Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Нейромедиаторные системы, участвующие в развитии тревожных состояний и патогенезе мигрени и являющиеся мишенями при поиске новых препаратов
1.1.1. Серотонинергическая система 17
1.1.2. Норадренергическая система 26
1.1.3. Дофаминергическая система 28
1.1.4. Система кортиколиберина 31
1.1.5. ГАМК-ергическая система 33
1.1.6. Глутаматергическая система 35
1.1.7. Система тахикининов (субстанция P, нейрокинин А, нейрокинин B, нейрокинин К), нейропептида Y и галанина
1.2. Классификация препаратов анксиолитического профиля 40
1.3. Классификация препаратов противомигреневого профиля 41
1.4. Фармакологические свойства препаратов сравнения, использованных в настоящем исследовании.
1.4.1 Афобазол 43
1.4.2. Селанк 44
1.4.3. Тропоксин 45
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы 47
2.2. Дизайн исследования 51
2.3. Характеристика экспериментальных животных 51
2.4. Методика открытого поля 52
2.5. Методика неизбегаемого плавания по Порсолту 53
2.6. Методика приподнятого крестообразного лабиринта 54
2.7. Модель обсессивно-компульсивного поведения (тест закапывания шариков) 56
2.8. Методика водного лабиринта Морриса 57
2.9. Методика нормобарической гипоксии с гиперкапнией («баночная гипоксия») 60
2.10. Методика изучения эффектов соединений на содержание моноаминов и их метаболитов в различных структурах мозга 60
2.11. Методика изучения острой токсичности и возможных побочных
эффектов соединений 64
2.12. Статистическая обработка экспериментальных данных 65
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Изучение влияния соединений на поведение мышей в тесте открытого поля 66
3.2. Изучение эффектов соединений в тесте неизбегаемого плавания по Порсолту 67
3.3. Изучение анксиолитической активности соединений в тесте приподнятого крестообразного лабиринта 69
3.4. Изучение антикомпульсивных свойств новых соединений на модели обсессивно-компульсивного поведения 71
3.5. Изучение влияния соединений на пространственное обучение мышей в водном лабиринте Морриса 72
3.6. Изучение эффектов соединений на модели нормобарической гипоксии 74
3.7. Анализ влияния соединения ЛК-933 на изменение мозгового кровотока 75
3.8. Нейрохимическое изучение эффектов ЛК-933, ЛК-998 и тропоксина на содержание моноаминов и их метаболитов в структурах мозга мышей 78
3.9. Изучение острой токсичности и побочных эффектов соединений 83
Обсуждение результатов 85
Выводы 97
Практические рекомендации 98
Список сокращений 99
Список литературы 100
- Серотонинергическая система
- Афобазол
- Модель обсессивно-компульсивного поведения (тест закапывания шариков)
- Изучение анксиолитической активности соединений в тесте приподнятого крестообразного лабиринта
Серотонинергическая система
В настоящее время установлено, что серотонинергическая система играет ключевую роль в развитии феномена тревожности. Её дисфункция является результатом различных процессов, таких, как недостаточная или, напротив, чрезмерная иннервация ключевых структур мозга и активация молекулярных механизмов, приводящих к нарушению нейропередачи. В последнем случае происходит либо нарушение высвобождения и обратного захвата серотонина (функция пресинаптических рецепторов) из синаптической щели, либо нарушение чувствительности к серотонину.
Наличие серотониновых рецепторов на нейронах других нейротрансмиттерных систем говорит о том, что нарушение активности серотонинергической системы может существенно повлиять и на другие системы.
Изменение тонуса серотонинергической нейропередачи представляет собой комплексный процесс, в котором участвуют пресинаптические ауторецепторы (5-HT1A/1D), транспортер серотонина SERT и, как минимум, рецепторы четырнадцати различных постсинаптических подтипов, из которых некоторые играют существенную роль в развитии тревожности (5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT3) [120]. SERT является основной мишенью такого класса препаратов, как СИОЗС, к числу которых относятся такие широко применяемые в клинике депрессивных состояний препараты как флуоксетин, пароксетин, сертралин, флувоксамин. СИОЗС резко увеличивают внеклеточную концентрацию серотонина в синаптической щели посредством блокады SERT, в результате чего усиливается активация постсинаптических 5-НТ рецепторов [37]; вместе с тем, увеличение концентрации внеклеточного серотонина ограничивается его связыванием с пресинаптическими 5-НТ1А ауторецепторами, что приводит по принципу обратной связи к ингибированию синтеза и высвобождения серотонина. 5-НТ1А рецепторы.
Рецепторы, относящиеся к 5-НТ1 семейству, ассоциированы с аденилатциклазными G-белками и характеризуются высоким сродством к серотонину. 5-НТ1А рецепторы состоят из двух функционально различных популяций: пресинаптические и постсинаптические рецепторы. 5-НТ1А рецепторы обнаружены в поверхностных слоях коры, гиппокампе, ядре шва, амигдале и других лимбических структурах [110]. Действуя как ауторецепторы, 5-НТ1А пресинаптические рецепторы подавляют активность 5-НТ нейронов. На экспериментальных моделях было обнаружено, что введение агонистов, взаимодействующих с пре- и постсинаптическими 5-НТ1А рецепторами вызывает противоположные эффекты: активация пресинаптических рецепторов в ядре шва приводит к снижению тревожных реакций, в то время, как активация постсинаптических рецепторов в гиппокампе, напротив, вызывает тревожное поведение [87]. По литературным данным доклинических исследований основную роль в реализации анксиолитических эффектов 5-НТ1А агонистов играют пресинаптические 5-НТ1А рецепторы [77]. К агонистам 5-НТ1А рецепторов относятся анксиолитики буспирон, тиоспирон, антидепрессанты: тразодон, вортиоксетин [190]. 5-НТ1В рецепторы. 5-НТ1В рецепторы являются ауторецепторами и расположены на терминалях нейронов. Наиболее плотные скопления этих рецепторов находятся в черной субстанции, бледном шаре, в меньших количествах они представлены в прилежащем ядре, хвостатом ядре, скорлупе и гиппокампе. Наименьшая концентрация рецепторов обнаружена в ФК [50]. При стимуляции 5-НТ1В рецепторов снижается высвобождение серотонина, регулируя тем самым уровень серотонина в синаптической щели. 5-НТ1В рецептор также модулирует высвобождение других ключевых нейромедиаторов, таких, как норадреналин, дофамин, глутамат и ГАМК [171]. В связи с тем, 5-НТ1B рецепторы выполняют ряд регулирующих функций, они играют определенную роль в патофизиологии настроения и тревожных расстройств, импульсивного и агрессивного поведения, а также зависимости [152]. Было показано, что неселективные агонисты или частичные агонисты 5-НТ1В рецепторов вызывают тревожно-подобное поведение у грызунов [98]. Так, введение CP 94,253, селективного 5-НТ1В агониста, вызывало развитие значительных анксиогенных эффектов у грызунов. Предварительное введение 5-НТ1В/1D антагониста эффективно устраняло эти эффекты [143]. Введение только одного 5-НТ1В/1D антагониста не вызывало анксиолитического эффекта. В другом доклиническом исследовании была выявлена стресс-индуцированная десенсибилизация 5-НТ1В рецепторов [48], и установлена связь между фрагментами хромосом, отвечающими за анксиогенность, и плотностью 5-НТ1В рецепторов [65]. Таким образом, показано, что агонисты 5-НТ1В явяются веществами, провоцирующими развитие тревожности, и в связи с этим не используются в разработке анксиолитических препаратов.
Афобазол
На схеме дизайна исследования отображены задачи исследования (Рис.5). Первым этапом проводилось изучение специфических нейропсихотропных эффектов новых соединений посредством поведенческих методик, принятых в экспериментальной фармакологии: приподнятный крестообразный лабиринт (ПКЛ), тест закапывания шариков, тест неизбегаемого плавания, тест открытое поле. Далее были изучены побочные эффекты и токсичность соединений. На третьем этапе были отобраны наиболее эффективные соединения для проведения более подробного их изучения и поиска дополнительных фармакологических свойств, а также сравнение с эталонными препаратами и изучение нейромедиаторного механизма действия.
В работе использовали 830 аутбредных мышей-самцов весом 20-25 г (питомник "Столбовая", Московская область). Содержание животных соответствовало нормам, определенным нормативными документами: ГОСТ 31886-2012 «Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP)», Приказ
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики» и СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденным Главным Государственным санитарным врачом 29.08.2014 г. № 51. Все процедуры, в ходе которых животным могла быть причинена боль или иного рода страдание, проводились при обезболивании, манипуляции проводились с соблюдением этических правил гуманного обращения с животными, утвержденными этической комиссией НИИ фармакологии имени В.В.Закусова.
Для изучения влияния веществ на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение животных использовалась методика открытого поля [5]. Открытое поле для мышей представляет собой круглую коробку из белого непрозрачного пластика диаметром 45 см с высотой стенок 28 см и полом, расчерченным на 32 квадрата 8х8 см с 25 отверстиями диаметром 1,5см. Над открытым полем располагались два светильника с 4 лампами накаливания мощностью 100 Вт в каждой. Животное помещали в центр установки и в течение 3 мин проводили визуальную оценку двигательной (количество пересеченных квадратов, число стоек) и исследовательской активности (число заглядываний в отверстия). Кроме того, подсчитывалось количество актов дефекации и груминга (умывания лапами). Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного обеспечения BioStat 2009.
Нормальность распределения определяли с помощью критерия Шапиро Уилка. Так как распределение значительно отличалось от нормального, статистическую значимость изменений проверяли с помощью непараметрического аналога однофакторного дисперсионного анализа по Краскалу-Уоллесу. В том случае, если этот метод показывал значимость различий, то проводили сравнение экспериментальных групп с контрольной с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, множественность сравнений учитывали с помощью поправки Бонферрони. Полученные результаты описывали с помощью медиан, нижнего и верхнего квартилей. Различия считались значимыми при p0,05.
Тест неизбегаемого плавания (forced swimming test) проводили согласно модифицированной методике Porsolt [178, 2]. Форсированное плавание вызывает у животных стрессовое состояние, при котором они принимают характерную неподвижную позу «отчаяния». В первый день животных помещали на 6 мин в прозрачные цилиндры диаметром 10 см и высотой 30 см, наполненные на 20 см водой с температурой 25С. На следующий день вводили исследуемые вещества внутрибрюшинно и через 60 мин повторно помещали мышь в те же условия, что и накануне, и на протяжении 6 мин регистрировали время сохранения животным позы иммобильности. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного обеспечения BioStat 2009. Нормальность распределения определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Гомогенность дисперсий проверяли с помощью критерия Левене. Так как полученные данные имели нормальное распределение и дисперсии были гомогенными, то значимость различий определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Даннету. Данные описывали с помощью средних арифметических и их стандартных ошибок. Различия считались значимыми при p0,05.
Модель обсессивно-компульсивного поведения (тест закапывания шариков)
В открытом поле горизонтальная активность животных заключалась в пересечении квадратов на полу установки. У контрольной группы животных число пересеченных квадратов варьировалось в пределах 42-62 шт. Количество вертикальных стоек составляло 1-3 раз. Параметр, отражающий ориентировочно-исследовательское поведение мышей – количество заглядываний в норки – у контрольной группы составляло 10-23 раз. Количество актов дефекации и груминга (умываний) указывают на стрессовое состояние мышей. В контрольной группе эти параметры варьировались в интервале 0-2 раз. При исследовании влияния веществ ЛК-933, ЛК-998, ЛК-1022, ЛК-1033, ПИОН-934 и ПИОН-935 (в дозах 10 и 20 мг/кг в/б каждое) на локомоторную активность беспородных мышей в открытом поле, достоверных отличий показателей групп, которым вводили соединения, от аналогичных параметров мышей контрольной группы обнаружено не было, что свидетельствует об отсутствии у изучаемых соединений как седативных, так и стимулирующих свойств (Табл. 2 и 3).
Результаты исследования эффектов соединений ЛК-933, ЛК-998, ЛК-1022, ЛК-1033, ПИОН-934 и ПИОН-935 в тесте представлены на Рисунке 13. Длительность иммобилизации у контрольной группы мышей составляла 234-262 сек. В тесте поведенческого отчаяния по Порсолту вещества ПИОН-934, ЛК-933, ЛК-998, ЛК-1022 и ЛК-1033 в дозах 10 и 20 мг/кг при однократном введении не влияли на продолжительность иммобилизации по сравнению с контролем, что может свидетельствовать об отсутствии антидепрессивных свойств у этих веществ. Только одно соединение – ПИОН-935 в дозе 20 мг/кг достоверно сокращало время иммобилизации в 1,4 раза по сравнению с контролем, увеличивая длительность активных движений животного (Рис.13). Амитриптилин в дозе 10 мг/кг уменьшал длительность иммобилизации в 1,6 раза, а флуоксетин в дозе 20 мг/кг в 1,5 раза.
Эффекты соединений в тесте неизбегаемого плавания мышей по методике Порсолта. Примечание: А. Эффекты соединений ПИОН-934, ПИОН-935, амитриптилина и флуоксетина. Б. Эффекты соединений ЛК-933, ЛК-998, ЛК-1022, ЛК-1033. – достоверность различий по сравнению с контролем при р 0,05 (Dunnett s Post Hoc ANOVA тест) 3.3. Изучение анксиолитической активности соединений в тесте приподнятого крестообразного лабиринта
Параметры анксиолитической активности у контрольных групп мышей в ПКЛ составляли: количество переходов в темные рукава – 4-6 раз; количество переходов в светлые рукава – 0-1 раз; время пребывания в светлых рукавах – 2-4 сек; латентный период первого захода в светлый рукав – 213-300 сек.
При изучении эффектов соединений в ПКЛ было обнаружено, что наибольшей анксиолитической активностью обладает соединение ЛК-998 в дозах 10 и 20 мг/кг (Табл.4) [21]. Через 60 мин после введения вещества отмечалось значительное увеличение числа переходов животного между светлыми отсеками и длительности пребывания в них. Интересно отметить, что в дозе 10 мг/кг величина этих показателей была существенно больше, что свидетельствует о большей эффективности соединения именно в этой дозе (Рис.15, Рис.16). По сравнению с афобазолом в дозе 5 мг/кг, ЛК-998 в дозе 10 мг/кг превосходит анксиолитическое действие последнего, а в дозе 20 мг/кг проявляет эффекты, сопоставимые с ним. В то же время, изучаемое вещество в дозах 5 и 40 мг/кг не оказывало значимого влияния на параметры теста, что подтверждает наличие куполообразной зависимости эффекта от дозы («доза-эффект»).
Соединение ЛК-933 в дозе 20 мг/кг проявляет отчетливую анксиолитическую активность, что выражается в значительном, статистически достоверном возрастании длительности пребывания животных в открытых рукавах ПКЛ, числа заходов в них и сокращении латентного периода первого захода в открытый рукав (Рис.14, Рис.16). Однако эффект этого соединения уступает эффекту афобазола в дозе 5 мг/кг. В дозах 5, 10 и 40 мг/кг соединение ЛК-933 не проявляет анксиолитической активности. ПИОН-934 в дозе 20 мг/кг достоверно увеличивал количество переходов в светлые рукава и время пребывания в них, сокращал латентный период первого захода в светлый рукав. Анксиолитический эффект ПИОН-934 уступает эффекту афобазола в дозе 5 мг/кг. В то же время, достоверных отличий эффектов ПИОН-934 в дозе 10 мг/кг от контроля выявлено не было. У соединений ЛК-1022, ЛК-1033 и ПИОН-935 анксиолитической активности по результатам теста ПКЛ выявлено не было. Афобазол в тесте ПКЛ в дозе 5 мг/кг достоверно увеличивал время пребывания и количество выходов в светлые рукава, сокращал латентный период первого захода в открытый рукав, а также увеличивал число переходов между темными рукавами.
Изучение анксиолитической активности соединений в тесте приподнятого крестообразного лабиринта
Два других вещества, синтезированных Л.М. Косточкой – ЛК-998 и ЛК-1033 - являются производными 2,2,6,6-тетраметил-пиперидона, и содержат в качестве ароматического заместителя фрагмента 3,4,5-триметоксибензойную кислоту. Значительный интерес привлекает группа производных пиперидина, представители которых изучаются с конца 50-х годов ХХ века и обладают как нейролептической (группа бутирофенонов, в первую очередь, галоперидол), так и другими видами психотропной активности, в т.ч. антидепрессивной (ипрониазид, ниаламид и др.). Не ослабевает интерес к поиску новых соединений с антидепрессивными и анксиолитическими свойствами среди веществ данной группы и в настоящее время [128]. Так, обнаружено противотревожное действие у веществ группы ацетамидов пиперидина [134]. Сходными эффектами обладают и производные фенциклидина (1-(1-фенилциклогексил)пиперидин, PCP) [109]. Методом внутримозгового микродиализа было установлено, что производное 1,2,4-пиперазина МС1 способно вызывать увеличение содержания дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК, что, как было описано выше, является характерным для лигандов серотониновых рецепторов, обладающих анксиолитическими свойствами [121].
Впервые соединение 3,4,5-триметокси-N`(2,2,6,6-тетраметил пиперидин-4-илиден)бензогидразид гидрохлорид было синтезировано в Болгарии в 1974 году. Было показано, что это вещество обладает вазодилатирующим эффектом, что было продемонстрировано на изолированном сердце кролика, а также проявляет слабое кратковременное гипотензивное и спазмолитическое и сильное центральное никотинолитическое и анальгезирующее действие [219]. Впоследствии данное соединение было ресинтезировано в отделе химии ФГБНУ НИИ фармакологии и получило шифр ЛК-998. Несмотря на то, что соединение ЛК-998 было синтезировано достаточно давно, изучения его возможных нейрофармакологических эффектов до настоящего времени не проводилось. В связи с этим, представлялось актуальным и важным выявление и изучение нейропсихотропного спектра действия этого вещества.
В настоящем диссертационном исследовании было показано, что ЛК-998 в дозах 10 и 20 мг/кг обладает выраженной анксиолитической активностью, что выражается в значительном возрастании длительности пребывания животных в открытых рукавах ПКЛ и увеличении числа заходов в них. По эффективности соединение ЛК-998 в дозе 10 мг/кг превосходит действие афобазола в дозе 5 мг/кг, а в дозе 20 мг/кг сопоставимо с ним.
Тест закапывания шариков используют для выявления антикомпульсивной активности изучаемого соединения. В наших экспериментах было установлено, что животные контрольной группы закапывают 61% от общего количества шариков. Мыши, которым вводили афобазол, закапывают 38% от общего количества шариков, а грызуны, получавшие соединение ЛК-998 – 32%. Таким образом, у данного соединения в дозе 10 мг/кг наблюдается антикомпульсивный эффект, сопоставимый с эффектом афобазола в дозе 5 мг/кг.
При исследовании влияния вещества ЛК-998 на локомоторную активность мышей в открытом поле достоверных отличий показателей группы животных, которым вводили ЛК-998 (10 и 20 мг/кг в/б), от аналогичных параметров мышей контрольной группы не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии у изучаемого соединения как психостимулирующих, так и седативных свойств. В тесте поведенческого отчаяния по Порсолту соединение ЛК-998 в тех же дозах не изменяло длительности иммобилизации по сравнению с контролем, что является показателем отсутствия антидепрессивных свойств.
При нейрохимическом изучении эффектов соединения ЛК-998 не было обнаружено статистически значимых изменений концентрации моноаминов и их метаболитов.
При изучении возможных побочных эффектов ЛК-998 в дозе 200 мг/кг (т.е. в 20 раз превышающей терапевтическую (10 мг/кг)) было показано, что данное вещество не вызывает развития побочных эффектов и признаков неврологического дефицита (изменение состояния слизистых оболочек, повышенная саливация, дефекация, уринация, нарушение ритма и глубины дыхательных движений, наличие агрессивности, повышенной пугливости, наличие тремора, изменение позы, каталепсия, судороги, стереотипия, седация) как через 24 ч, так и в более отдалённые сроки (4 сут, 10 сут и 14 сут) после введения соединени. ЛК-998 в дозе 200 мг/кг не нарушает координации движений животных (100% мышей удерживаются на вращающемся стержне в течение 5 минут).
Из литературных источников известно, что ряд производных пиперидина (N-фенил-2-[1-[3-(2-пиридинилэтинил)бензоил]-4-пиперидин] ацетамид [211], 1-(1-фенилциклогексил) пиперидин, фенциклидин [217]) обладают анксиолитическими свойствами. В частности, установлено, что они обладают агонистическим сродством к рецепторам 5-HT1a подтипа, проявляя, в то же время, антагонизм по отношению к 5-HT2а рецепторам серотонина [217]. Подобная тропность характерна для соединений, обладающих противотревожной активностью, в частности, для широко используемого в клинической практике буспирона, который является агонистом 5-HT1a рецепторов [60]. Можно предположить, что в механизме анксиолитического действия соединения ЛК-998, которое имеет структурное сходство с упомянутыми выше производными пиперидина, также принимает участие серотонинергическая система мозга. Таким образом, согласно результатам проведенных нами экспериментов, соединение ЛК-998 обладает выраженной анксиолитической и антикомпульсивной активностью, не вызывая при этом неврологического дефицита. Анксиолитическая активность данного вещества в дозе 10 мг/кг превосходит эффективность афобазола в дозе 5 мг/кг.
У второго вещества, производного 2,2,6,6-тетраметил-пиперидона -ЛК-1033 не было выявлено фармакологической активности.
Подводя итоги проведенных нами исследований (Табл.11), следует отметить, что в ходе первичного скрининга производных N-ацилгидразона и пиридо [1,2-а] пиримидинов были выявлены два соединения, обладающие наибольшей фармакологической активностью и представляющие интерес для дальнейшего исследования. Соединение ЛК-998 сочетает в себе анксиолитическую и антикомпульсивную активность, а ЛК-933 – анксиолитическую и противомигреневую в той же дозе. Анксиолитическая эффективность ЛК-998 превосходит афобазол, а противомигреневая активность ЛК-933 превосходит тропоксин.