Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Локализация и основные функции ABCB1-белка 15
1.2. Структура ABCB1-белка 18
1.3. Субстратная специфичность ABCB1-белка 20
1.4. Модуляторы функционирования ABCB1-белка 21
1.5. Прогноз принадлежности лекарственных веществ к субстратам ABCB1-белка и модуляторам его функционирования 29
1.6. Фексофенадин как маркер функциональной активности ABCB1-белка 31
1.7. Трансляционные исследования в современной медицинской науке 33
1.8. Афобазол как потенциальный субстрат и модулятор функционирования ABCB1-белка 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Объект экспериментальных и клинических наблюдений 43
2.2. Фармакокинетические методы исследования 43
2.2.1. Методика количественного определения фексофенадина в плазме крови кроликов 43
2.2.2. Методика количественного определения фексофенадина в плазме крови людей 46
2.2.3. Расчет фармакокинетических параметров фексофенадина 47
2.3. Иммуногистохимические методы исследования 47
2.4. Стандартизация методики анализа принадлежности лекарственных веществ к модуляторам активности ABCB1-белка 48
2.5. Оценка влияния афобазола на функциональную активность и относительное количество ABCB1-белка на мембранах клеток в эксперименте 51
2.6. Оценка влияния афобазола на функционирование ABCB1-белка в клинике 53
2.6.1. Методика генотипирования добровольцев 55
2.7. Математико-статистические методы исследования 55
Глава 3. Результаты исследования 58
3.1. Стандартизация и апробация методики анализа принадлежности лекарственных веществ к модуляторам функционирования ABCB1-белка in vivo 58
3.2. Влияние курсового назначения афобазола на функциональную активность и относительное количество ABCB1-белка на мембранах клеток в эксперименте 69
3.3. Оценка влияния афобазола на функциональную активность ABCB1-белка в клинике 74
3.3.1. Модификация методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови добровольцев 74
3.3.2. Влияние курсового назначения афобазола на функциональную активность ABCB1-белка в клинике 78
3.4. Оценка трансляционности для клиники используемых тест-системы и метода оценки принадлежности лекарственных веществ к модуляторам активности ABCB1-белка 83
Глава 4. Заключение 85
Выводы 104
Список литературы 105
Благодарности 126
- Модуляторы функционирования ABCB1-белка
- Афобазол как потенциальный субстрат и модулятор функционирования ABCB1-белка
- Стандартизация и апробация методики анализа принадлежности лекарственных веществ к модуляторам функционирования ABCB1-белка in vivo
- Влияние курсового назначения афобазола на функциональную активность ABCB1-белка в клинике
Модуляторы функционирования ABCB1-белка
Курсовое или даже однократное введение ряда лекарственных веществ способно изменить функциональную активность ABCB1-белка. Ингибиторы транспортера снижают опосредованный им эффлюкс субстратов, что часто ассоциировано с возникновением нежелательных лекарственных реакций. Индукторы повышают активность транспортера, что способствует снижению эффективности фармакотерапии. Важно, что индукция ABCB1-белка в клинике редко имеет терапевтическую ценность, а его ингибирование является привлекательной целью, например, для лечения резистентной к фармакотерапии эпилепсии [107] или предотвращения множественной лекарственной устойчивости опухолей, т.к. гиперэкспрессия гена данного белка-транспортера в опухолевых тканях является ведущей причиной ее возникновения [122]. В связи с этим поиск эффективных ингибиторов ABCB1-белка – это одна из целей программ совершенствования терапии онкологических заболеваний. Первые препараты с обнаруженной у них ингибирующей активностью по отношению к ABCB1-белку представляли собой средства, применяемые по поводу различных нозологий – прогестерон, верапамил, циклоспорин А и пр. Препараты второго поколения являются либо производными средств первого поколения (аналог циклоспорина валдоспар – PSC-833), либо продуктами химического скрининга (chemical library screens) (элакридар – GF120918, бирикодар – VX-710). Однако интенсивное изучение данных препаратов показало, что они индуцируют микросомальные ферменты печени, а также снижают активность ряда других мембранных белков-транспортеров. Третье поколение ингибиторов ABCB1-белка, такие как зосуквидар (LY335979), тариквидар (XR-9576) и ланиквидар (R101933) характеризуются большей селективностью, однако поиски препаратов-ингибиторов продолжаются [98].
Поиск индукторов ABCB1-белка имеет скорее научный интерес c целью создания положительного экспериментального контроля транспортера с повышенной активностью для оценки препаратов аналогичного действия или его субстратов. Кроме того, предполагается возможность использования индукторов транспортера в качестве антидотов для терапии заболеваний, вызванных отравлением его субстратами [133].
Согласно современным представлениям, активность ABCB1-белка может изменяться в результате ряда процессов [36]:
1) изменение экспрессии гена MDR1;
2) полиморфизм гена MDR1;
3) амплификация участка генома, включающего ген MDR1;
4) стабилизация мРНК гена MDR1;
5) передача транспортера от клетки к клетке;
6) изменение активности синтезированного ABCB1-белка;
7) изменение клеточного метаболизма. Изменение экспрессии гена MDR1
ABCB1-белок кодируется геном MDR (multidrug resistance gene). Человеческий ген MDR1 и гены mdr1, mdr3 грызунов вовлечены в формирование феномена множественной лекарственной устойчивости, поэтому изучены наиболее широко. Ген MDR1 локализуется на 7 хромосоме и содержит 28 экзонов, при этом распространяется более чем на 100 kb [48]. В большинстве случаев интенсификация экспрессии гена MDR1 вызывает увеличение функциональной активности ABCB1-белка, ингибирование экспрессии – снижение активности. Однако в ряде случаев, экспрессия гена транспортера и его функциональная активность не коррелируют [58].
Экспрессия гена MDR1 изменяется под действием ряда факторов внутренней среды, а также химических веществ. Так, продемонстрировано индуцирующее влияние гипертермии на экспрессию данного гена с максимальным эффектом при 42С [150]. В данном процессе ведущая роль принадлежит взаимодействию фактора теплового шока с областью промотора гена MDR1, называемой элементом теплового шока [115].
Существенную роль в процессе активации экспрессии гена MDR1 в условиях гипоксии отводится фактору, индуцируемому гипоксией (Hipoxia Inducible Factor – HIF-1) – полипептиду, ответственному за транскрипционный ответ на дефицит кислорода, изменение выработки эритропоэтина, ферменты гликолиза и цикла Кребса, транспортеры глюкозы, изменение сосудистого тонуса и ангиогенеза, метаболическую адаптацию [59, 104]. В условиях дефицита кислорода кислородчувствительная субъединица транскрипционного фактора – HIF-1 стабилизируется, проникает в ядро и образует димер с субъединицей HIF-1, после чего связывается с ответственным за гипоксический ответ элементом промотора гена MDR1, представляющим собой последовательность нуклеотидов 5 -GCGTG-3 на расстоянии 49-45 пар нуклеотидов от сайта начала транскрипции, и оказывает на него регуляторное воздействие [60]. В исследовании in vitro установлено, что при ультразвуковом воздействии на культуру клеток HepG2/ADM количество ABCB1-белка повышается, что проявляется существенным возрастанием уровня мРНК гена MDR1 [152].
Экспрессия гена MDR1 возрастает под действием УФ-излучения, а также химических и лекарственных веществ, таких как натрия бутират, кислота ретиноевая, многие химиотерапевтические препараты [129]. Причем сигналы от всех этих разносторонних стимулов сходятся в области промотора гена MDR1, получившей название enhanceosome. Данный участок содержит сайты связывания ряда транскрипционных факторов: трехмерного транскрипционного фактора NF-Y (nuclear factor Y) и Sp-семейства GC-связывающих транскрипционных факторов [85].
Показано, что рифампицин не принадлежит к субстратам ABCB1-белка, но индуцирует экспрессию гена MDR1 в энтероцитах и гепатоцитах. Предполагается, что это связано со способностью рифампицина связываться с прегнан-X-рецептором (PXR) [9] – сенсором ксенобиотиков, регулирующим транскрипцию генов транспортеров лекарственных средств, в том числе ABCB1-белка, а также основных ферментов метаболизма [42]. PXR взаимодействует с областью промотора гена MDR1, называемой hormone response elements (HREs) и включающей нуклеотидную последовательность AGGTCA (находится на расстоянии – 8 тысяч пар нуклеотидов от сайта старта транскрипции [70].
Однако возможно также ингибирование экспрессии гена MDR1. Так, эксперименты in vitro показали, что фактор некроза опухолей-, интерлейкин-2 и интерферон- связываются с промотором гена и угнетают его экспрессию [137].
Полиморфизм гена MDR1
В настоящее время описан только один полиморфизм гена MDR1, связанный с изменением функции ABCB1-белка – так называемая «молчащая» мутация в 26-м экзоне в положении 3435 (С3435Т) – замена цитозинового нуклеотида на тимидиновый в промоторе гена MDR1 [163].
Hoffmeyer S. и соавт. впервые продемонстрировали более выраженную экспрессию гена MDR1 в тонком кишечнике у гомозигот CC по сравнению с гомозиготами TT (р=0,056). Однако в дальнейшем исследователи как подтверждали, так и опровергали подобные результаты. Мета-анализ восьми работ не показал достоверных различий в значениях площадей под фармакокинетической кривой дигоксина (маркерного субстрата ABCB1-белка) у носителей генотипов СС и СТ, ТТ или (СТ+ТТ). В то же время максимальная концентрация дигоксина у добровольцев с генотипом СС была статистически значимо ниже аналогичного показателя у носителей генотипа ТТ. Данные мета-анализа свидетельствуют в пользу независимости функциональной активности транспортера от генотипа по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1 [52].
Субпопуляционный анализ показал, что у европеоидов с генотипом CC и площадь под фармакокинетической кривой, и максимальная концентрация дигоксина достоверно ниже, чем у лиц с генотипом ТТ. Однако в японской популяции результаты были противоположны [52].
В мета-анализе исследований, выполненных до 2016 года, включающем детей с фармакорезистентной (n=863) и поддающейся фармакотерапии эпилепсией (n=863) не выявлено корреляции между С3435Т полиморфизмом гена MDR1 и риском лекарственной устойчивости. Однако в подгруппе европейской популяции в публикациях от 2010 года у гомозигот СС этот риск был достоверно выше [106].
Еще один мета-анализ, включающий 4407 пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой и 4436 контрольных пациентов, показал, что наличие мутантных аллелей гена MDR1 повышает риск развития данного заболевания [149].
Вероятной причиной противоречивых результатов может быть то, что совместно с полиморфизмом С3435Т гена MDR1 у индивидуумов могут встречаться и другие полиморфизмы, имеющее клиническое значение. Тем не менее следует учитывать влияние данного полиморфизма на активность и экспрессию ABCB1-белка при исследовании его функционирования.
Афобазол как потенциальный субстрат и модулятор функционирования ABCB1-белка
В соответствии с определением ВОЗ, к ноотропным препаратам принадлежат лекарственные средства, оказывающие прямое активирующее влияние на процессы обучения, улучшающие память и умственную деятельность, повышающие устойчивость мозга к агрессивным воздействиям и улучшающие качество коммуникационной жизни больного.
В России предложена следующая классификация ноотропных средств [4]:
1. Активаторы метаболизма мозга и белково-нуклеинового синтеза (пирацетам, церебролизин, актовегин, кортексин и др.)
2. Ноотропные средства, реализующие действие через нейромедиаторные системы
а) холинергические (холина хлорид, фосфатидилсерин, лецитин, донепезил, галантамин и др.)
б) вещества, влияющие на систему возбуждающих аминокислот (глутаминовая кислота, мемантин, нооглютил и др.)
в) вещества, влияющие на систему ГАМК (гаммалон, пантогам, пикамилон, фенибут, нейробутал, натрия оксибутират и др.)
г) вещества, влияющие на серотонинергическую систему (антагонисты 5-НТ3 рецепторов – ондансетрон, мерисетрон и др.)
д) вещества, влияющие на дофаминергическую систему (сумаринол, селегилин и др.)
е) вещества, влияющие на аденозиновую систему (кофеин, ролипрам и др.)
ж) вещества, влияющие на гистаминовую систему
з) вещества, влияющие на каннабиноидную систему
3. Нейропептиды, их аналоги и фрагменты (АКТГ, соматостатин, вазопрессин, эбиратид, ноопепт)
4. Нейростероиды и мелатонин (7--эстрадиол, мелатонин, карбеноксолин и др.)
5. Антиоксиданты (пиритинол, дибунол, мексидол, атеровит и др.)
6. Антагонисты кальция (нимодипин, циннаризин и др.)
7. Вазотропные средства или церебральные вазодилататоры (ницерголин, винпоцетин, винкамин, нафтидрофурил и др.)
8. Вещества, влияющие на протеинкиназы (этимизол и др.)
9. Витамины и их аналоги, пищевые добавки и растительные средства (витамины Е, В6, В12, фолаты, тиамин, лецитин, L-карнитин, препараты женьшеня, лимонника и др.)
10. Вещества, влияющие на нейротрофиновую систему
11. Вещества, влияющие на процессы нейродегенерации при болезни Альцгеймера
12. Средства для лечения синдрома дефицита внимания с гиперреактивностью у детей и взрослых (метилфенидат, атомоксетин, фенотропил, фенибут и др.) 13. Комбинированные препараты (фезам, инстенон, цитофлавин и пр.)
14. Вещества из различных групп (оротовая кислота, фолиевая кислота, глюкокортикоиды и др.)
Ноотропные средства действуют на базе естественных нейромедиаторных процессов, формирующих все разнообразие функций ЦНС: аминов (адреналин, норадреналин, дофамин, серотонин, гистамин), аминокислот (ГАМК, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, глицин), пуриновых нуклеотидов и нейропептидов [16].
Возникновение и прогрессирование цереброваскулярной патологии ухудшает когнитивные функции, отвечающие за адаптацию в обществе, адекватность ответных реакций на внешние факторы: функций гнозиса, праксиса, речи, анализа, обработки и хранения информации.
Афобазол – оригинальный отечественный селективный анксиолитик с нейропротекторной активностью, предотвращающий стресс-индуцированное падение связывания в бензодиазепиновом участке ГАМКА-рецепторного комплекса, одобренный для клинического применения в РФ в 2005 году. Препарат не обладает характерными для бензодиазепинов гипноседативным, амнестическим и миорелаксантным эффектами, однако по анксиолитическим свойствам им не уступает [1].
Афобазол является стимулятором сигма-1 рецепторов эндоплазматического ретикулума, мелатониновых рецепторов МТ1 и МТ3 типа и регуляторного участка МАО-А. Основной механизм действия афобазола связан с сигма-1 рецепторами, которые оказывают модулирующее влияние на все основные нейромедиаторные системы, такие как ГАМК-ергическая, серотонинергическая, норадренергическая, дофаминергическая, холинергическая системы, и NMDA-зависимые глутаматные эффекты, играющие значимую роль в патогенезе тревоги, депрессии, нарушений памяти и нейродегенеративных заболеваний.
Препарат повышает выживаемость нейронов при его превентивном добавлении в среду инкубации с пероксидом водорода и глутаматом. При добавлении афобазола после внесения глутамата положительного эффекта не выявлено. Нейропротекция наблюдается также при ишемии. Механизм нейропротекторного действия афобазола остается невыясненным.
Предполагается, что препарат прямо или косвенно ингибирует фермент каспазу-3 в ответ на глутаматную эксайтотоксичность [55].
Сигма рецептор локализуется на эндоплазматическом ретикулуме и включает 2 подтипа: сигма-1 и сигма-2 рецептор. Сигма-1 рецептор является внутриклеточным модулятором систем сигнальной трансдукции, которые влияют на ретикулум-митохондриальный транспорт ионов кальция и регулируют биоэнергетику нейрональных клеток в стрессовых ситуациях, в частности при ишемии [68]. Активация сигма-1 рецептора под действием афобазола устраняет перегрузку кальцием, вызванную ишемией и ацидозом путем ингибирования ионных каналов, в частности acid-sensingion channel 1a (ASIC1a), что показано на культурах нейрональных клеток, а также в экспериментах на крысах [55]. Однако применение необратимого антагониста сигма рецептора – метафита и селективного блокатора сигма-1 рецептора – BD 1063 не полностью устраняло положительное влияние афобазола на внутриклеточный уровень кальция, что свидетельствует о наличии некоторых других мишеней его действия [55]. Показана супрессия афобазолом ASIC1a, ионотропных глутаматергических рецепторов и потенциалзависимых кальциевых каналов.
Установлено, что афобазол индуцирует транслокацию сигма-1 рецептора из тела клетки в аксоны [55].
Нейропротекторная активность афобазола подтверждена in vivo. Так, введение афобазола крысам с фототромбозом сосудов префронтальной коры через 1 час после моделирования патологии, а также в течение 8 последующих дней сокращало зону некроза на 50%. На ряде моделей геморрагического инсульта афобазол также повышал выживаемость животных [55]. Афобазол не связывается напрямую с ГАМКА-бензодиазепиновым рецепторным комплексом. Механизм его анксиолитического действия основан на способности предотвращать стресс-индуцированное снижение связывания в бензодиазепиновом участке ГАМКА-рецептора и восстанавливать его чувствительность к действию ГАМК. Кроме анксиолитического действия афобазол обладает также антидепрессивным эффектом: устраняет тревогу, эмоциональное напряжение, улучшает настроение и сон [17].
Афобазол обладает вазопротекторным и антирадикальным эффектами: снижает уровень малонового диальдегида и церуллоплазмина, активность каталазы, повышает уровень экспрессии фермента eNOS и концентрацию суммарных метаболитов NО, активность супероксиддисмутазы, приводит к возрастанию синтеза стресс-белка HSP70 [17].
В доклинических исследованиях продемонстрирована антиаритмическая и противоишемическая активность афобазола. Причем по широте терапевтического действия он превосходит такие антиаритмические средства, как новокаинамид, лидокаин, верапамил и этмозин [11; 23].
Применение афобазола не сопровождается гипноседативным действием (проявляется лишь в дозах, превышающих ЕD50 для анксиолитического действия более чем в 40 раз). У препарата не выявлены миорелаксантные свойства и отрицательное влияние на показатели внимания и памяти, к нему не формируется лекарственная зависимость и не развивается синдром отмены. Это позволяет отнести афобазол к безопасным безрецептурным средствам [1].
Стандартизация и апробация методики анализа принадлежности лекарственных веществ к модуляторам функционирования ABCB1-белка in vivo
Целью исследования явилась стандартизация и апробация методики анализа принадлежности лекарственных веществ к модуляторам активности ABCB1-белка с применением известного маркерного субстрата транспортера - фексофенадина и доказанных индуктора и ингибитора его функционирования: рифампицина и верапамила соответственно. Причем в исследование были включены 2 группы кроликов обоих полов с целью учета гендерных особенностей функционирования ABCB1-белка.
На рисунке 3 представлены усредненные фармакокинетические кривые фексофенадина у интактных кроликов-самцов на фоне введения им верапамила курсом 14 дней в дозе 20 мг/кг 3 раза в сутки.
Динамика индивидуальных значений фармакокинетических параметров фексофенадина у интактных кроликов-самцов и на фоне курсового введения им верапамила представлена в таблице 3.
Курсовое введение верапамила в дозе 20 мг/кг три раза в день кроликам-самцам приводило к повышению максимальной концентрации (Стах) фексофенадина на 50,3% (р=0,014), периода полувыведения (Т1/2) на 114,8% (р=0,024), площадей под фармакокинетическими кривыми AUC0.t и AUCo-oo соответственно на 53,4% (p=0,031) и 78,63% (p=0,011), а также снижению времени достижения максимальной концентрации (Ттах) на 63,6% (p=0,042). Кроме того, наблюдалась отчетливая тенденция к возрастанию клиренса фексофенадина (p=0,075) (таблица 4).
Наблюдаемая динамика свидетельствует о большем содержании маркерного субстрата ABCB1-белка - фексофенадина в плазме крови кроликов после введения верапамила и его замедленной экскреции. В связи с ведущей ролью данного белка-транспортера в контроле фармакокинетики фексофенадина можно сделать заключение о снижении его активности. Это подтверждает адекватность применяемой методики исследования и воспроизводимости ее результатов для анализа влияния лекарственных средств на функционирование ABCB1-белка. На рисунке 4 представлены усредненные фармакокинетические кривые фексофенадина у интактных кроликов-самцов до и после курсового введения индуктора ABCB1-белка - рифампицина курсом 14 дней в дозе 20 мг/кг 2 раза в сутки.
Динамика индивидуальных значений фармакокинетических параметров фексофенадина у интактных кроликов-самцов и на фоне курсового введения рифампицина представлена в таблице 5.
14-дневное введение кроликам-самцам рифампицина в дозе 20 мг/кг дважды в день приводило к достоверному снижению площади под фармакокинетической кривой концентрация-время AUC0 и AUC0-oo фексофенадина соответственно на 61,2% (р=0,042) и 61,25% (р=0,035) и увеличению общего клиренса (С1) на 130,2% (р=0,038). Остальные фармакокинетические параметры маркерного субстрата АВСВ1-белка достоверно от контрольных значений не отличались. Описанная динамика отражена в таблице 6.
Выявленные изменения фармакокинетики фексофенадина после введения кроликам-самцам индуктора ABCB1-белка рифампицина свидетельствуют о менее выраженном накоплении маркерного субстрата транспортера в организме животных, что подтверждает целесообразность применения кроликов-самцов породы Шиншилла в качестве тест-системы, используемой методики тестирования лекарственных средств на принадлежность к числу модуляторов активности ABCB1-белка, а также воспроизводимость ее результатов.
На рисунке 5 представлены усредненные фармакокинетические кривые фексофенадина у интактных кроликов-самок и на фоне введения им верапамила курсом 14 дней в дозе 20 мг/кг массы тела животного.
Динамика индивидуальных значений фармакокинетических параметров фексофенадина у интактных кроликов-самок и на фоне курсового введения им верапамила представлена в таблице 7.
Курсовое введение кроликам-самкам ингибитора АВСВ1-белка -верапамила вызывало достоверное повышение площадей под фармакокинетическими кривыми концентрация-время AUC0.t и AUC0.oo фексофенадина на 94,5% (p=0,033) и 104,00% (p=0,046) соответственно и снижение его общего клиренса на уровне тенденции (p=0,092). Также наблюдалось достоверное снижение объема распределения фексофенадина на 32,71% (p=0,028). Указанная динамика отражена в таблице 8.
В данном случае изменение последнего параметра фармакокинетики маркерного субстрата АВСВ1-белка свидетельствует об угнетении захвата фексофенадина тканями, что теоретически свидетельствует о сохраненной активности данного белка-транспортера по сравнению с контролем. С другой стороны, возрастание площади под фармакокинетической кривой говорит об обратной тенденции. Таким образом, однозначного заключения о функциональной активности АВСВ1-белка у самок на фоне курсового введения верапамила сделать нельзя. Хотя ключевыми параметрами для анализа и последующих выводов считаются Сmax, AUC0, AUC0-, которые характеризуют уровень маркерного субстрата в крови [14].
На рисунке 6 представлены усредненные фармакокинетические кривые фексофенадина, а в таблице 9 - индивидуальные значения его фармакокинетических параметров у интактных кроликов-самок и на фоне курсового введения им рифампицина.
Курсовое введение кроликам-самкам индуктора ABCB1-белка – рифампицина также не приводило к прогнозируемым изменениям фармакокинетики маркерного субстрата белка-транспортера: максимальная концентрация, площадь под фармакокинетической кривой «концентрация-время» и другие параметры его фармакокинетики статистически значимо не изменялись (p 0,05). Была выявлена только незначительная тенденция к снижению среднего времени удерживания (MRT) и периода полувыведения фексофенадина на 40,21% и 40,23% соответственно (p=0,098 для обоих показателей) (таблица 10).
Полученные на самках кроликов результаты свидетельствуют о неоднозначном изменении функциональной активности ABCB1-белка на фоне курсового введения животным доказанных многочисленными исследованиями индуктора (рифампицин) и ингибитора (верапамил) данного белка-транспортера, что может быть обусловлено полом животных и объемом выборки (n=6).
Таким образом, изучение принадлежности лекарственных веществ к числу модуляторов активности ABCB1-транспортера рекомендуется выполнять на кроликах-самцах породы Шиншилла, что подтвердила апробация используемой методики оценки с получением воспроизводимых результатов.
Влияние курсового назначения афобазола на функциональную активность ABCB1-белка в клинике
На этапе скрининга нами были обследованы 62 человека (36 мужчин и 26 женщин), подписавших информированное согласие. Из них были отобраны 15 человек (7 мужчин и 8 женщин), которые соответствовали критериям включения/исключения. Возраст испытуемых составил от 20 до 29 лет (в среднем 22,13±2,23 лет), индекс массы тела 22,71±1,79 кг/м2. Основные характеристики добровольцев представлены в таблице 15.
В исследование были отобраны добровольцы с генотипом СТ по полиморфному маркеру С3435Т гена МDR1. 12 человек завершили исследование в соответствии с протоколом и были включены в дальнейший статистический анализ. 2 добровольца выбыли из исследования в результате развития ОРВИ, один доброволец отказался от участия после завершения первого периода исследования. Таким образом в итоговый анализ вошло 12 человек, по 6 человек в каждой группе (в первой группе женщины: n=3, мужчины: n=3; во второй группе женщины: n=4, мужчины: n=2). Сформированные группы были сопоставимы по всем общеклиническим показателям.
Показанием для применения афобазола в данном исследовании было наличие у тестируемых добровольцев низкой степени тревожности, выявленной с помощью теста Спилбергера-Ханина, с нарушением сна. Показанием для приема фексофенадина было наличие в анамнезе поллиноза.
В соответствии с рекомендациями FDA был выбран перекрестный дизайн исследования. Афобазол и плацебо назначались в дозе 10 мг 3 раза в день в течение 14 дней. "Отмывочный" период составил не менее 5 дней.
Усредненные фармакокинетические кривые фексофенадина после приема добровольцами плацебо и афобазола отображены на рисунке 13.
Индивидуальные и усредненные фармакокинетические параметры маркерного субстрата ABCB1-белка у добровольцев представлены в таблицах 16 и 17 соответственно.
Единственным фактором, который вносил достоверный вклад в вариабельность параметров Сmax, Cmax/AUC0 и Kel являлись испытуемые (р=0,0057 и p=0,039 соответственно). Вклад остальных параметров (прием афобазола или плацебо, период, последовательность исследования) оказался статистически незначимым (p 0,05). Причем 90%-й ДИ отношения средних геометрических Kel (0,8-1,13) находился внутри интервала 0,8-1,25, что говорит об отсутствии какой бы то ни было клинической значимости.
AUC0 фексофенадина после приема афобазола увеличивалась по сравнению с показателями добровольцев при приеме плацебо в 1,33 раза (90%-й ДИ 1,13–1,55, p=0,008), общий клиренс снижался в 0,76 раза (90%-й ДИ 0,65–0,89, p=0,0099). Вклад факторов период и последовательность приема препаратов для данных фармакокинетических параметров фексофенадина являлся статистически незначимым (p 0,05). Tmax фексофенадина у добровольцев обеих групп статистически значимо не отличалась (p=0,68). Таким образом, выявленные значимые изменения фармакокинетики фексофенадина (AUC0 общий клиренс) свидетельствуют о повышении его содержания в плазме крови у добровольцев, получающих афобазол, по сравнению с испытуемыми, принимавшими плацебо, что подтверждает ингибирование функциональной активности АВСВ1-белка под действием тестируемого препарата.