Содержание к диссертации
Введение
1. Современные достижения в понимании механизмов заживления кожных ран – биологических мишеней для разработки эффективных методов лечения (обзор литературы) 16
1.1 Характеристика основных этапов и механизмов заживления острых ран 18
1.1.1 Адекватный гемостаз 18
1.1.2 Воспалительная реакция – важнейший процесс ранозаживления 20
1.1.3 Пролиферативная фаза заживления ран 24
1.1.4 Фаза ремоделирования – завершающий этап ранозаживления 27
1.2 Современные лечебные стратегии при хронических ранах. 28
1.2.1 Инфекционный фактор как биологический объект для фармакологического воздействия 30
2. Материал и методы исследования 40
2.1 Дизайн исследования 40
2.2 Следование требований к соблюдению биоэтических процедур при работе с лабораторными животными и возбудителями инфнкций 43
2.3 Характеристика лабораторных животных и экспериментальных групп 44
2.4 Характеристика магистральных лекарственных форм исследуемых в работе веществ 47
2.5 Методы исследования острой токсичности и внеэкспери ментального прогнозирования активности 48
2.6 Методы формирования экспериментальных кожных ран 50
2.7 Методы инфицирования ран 51
2.8 Морфологические методы исследования 52
2.9 Методы определения общего белка, билирубина, аминотрансфераз, щелочной фосфатазы в периферической крови 54
2.10 Методы исследования активности свободнорадикальных процессов в ткани раны 56
2.11 Метод количественного определения некоторых цитоки-нов в тканях раны крыс 56
2.12 Методы изучения противомикробной активности действующих веществ ЛХТ-6-17 и ЛХТ-7-17 60
2.13 Методы статистического анализа полученных экспериментальных данных 61
3. Токсикологическая характеристика оригинальных производных n-ацетил-6-аминогексановой кислоты и прогнозирование регенеративной активности 62
4. Ранозаживляющее действие производных N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на моделях неинфицированных кожных ран 69
4.1 Эффективность солей N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на модели линейных ран кожи крыс 69
4.2 Эффективность солей N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на модели плоскостных ран кожи крыс 73
4.3 Динамика микроскопических изменений плоскостной не-инфицированной раны кожи в процессе заживления на фоне различных методов консервативного лечения 76
4.4 Влияние топического воздействия солями N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на состояние детоксицирующих систем организма, активность ПОЛ и цитокиновый профиль тканей неинфицированной плоскостной раны 84
5. Противомикробная активность производных N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на модели хирургической раневой инфекции 89
6. Обсуждение результатов 108
Заключение 121
Перспективы дальнейшего развития темы 123
Выводы 124
Практические рекомендации 126
Библиографический список 127
- Воспалительная реакция – важнейший процесс ранозаживления
- Метод количественного определения некоторых цитоки-нов в тканях раны крыс
- Динамика микроскопических изменений плоскостной не-инфицированной раны кожи в процессе заживления на фоне различных методов консервативного лечения
- Противомикробная активность производных N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на модели хирургической раневой инфекции
Воспалительная реакция – важнейший процесс ранозаживления
Воспалительная реакция включает вовлечение в процесс нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов. После реализации первичного гемостаза происходит вторичная вазодилатация в ответ на гемокоагуляцию и активацию системы комплемента. Брадикинин (образованный в ходе каскада свертывания крови) и С3а, С5а компоненты комплемента (т.н. анафилатоксины) повышают проницаемость сосудов и индуцируют миграцию нейтрофилов и моноцитов в рану [30]. Указанные компоненты комплемента также стимулируют выделение гистамина и лейкотриенов тучными клетками. В последующем нарушается прочность межклеточных контактов эндотелиоцитов, что приводит к повышению проницаемости сосудов и прикреплению клеток воспаления к краям раны [31]. Первая популяция лейкоцитов, представленная в раневом дефекте образована преимущественно нейтрофилами. Тромбин и ИЛ-8 стимулируют проницаемость эндотелиального слоя посредством модуляции адегрин-опосредованной адгезии и сокращения эндотелиальных клеток, облегчая таким образом проникновение лейкоцитов в поврежденные ткани из циркуляции [32, 33]. В самой ране нейтрофильная реакция по деконтамина-ции пораженного участка развивается несколькими путями, включая секрецию протеаз и антимикробных пептидов, а также продукцию активных форм кислорода, посредством так называемого респираторного взрыва [34].
При этом, в отсутствие медиаторов воспаления нейтрофилы претерпевают спонтанный апоптоз, запуск которого опосредуется выходом катепсина Д из нейтрофильных гранул, который, в свою очередь, осуществляет расщепление и активацию регулирующей каспазы 8, с последующим запуском производящего фермента каспазы 3, ответственной за фрагментацию ДНК [35]. Дефицит или отсутствие нейтрофилов в месте повреждения сопровождается утратой управляемости макрофагами в регуляции процесса раноза-живления [36]. И, хотя нейтрофилы играют важную роль в предотвращении инфицирования раны и развития микробного процесса, их отсутствие в целом не тормозит прогресс заживления [37]. Напротив, их длительное присутствие в раневом дефекте может быть фактором трансформации острой раны в хроническую незаживающую форму [38, 39]. Циркулирующие моноциты и тучные клетки мигрируют и инфильтрируют раневой дефект [17, 40]. В самой ране моноциты дифференцируются в макрофаги, которые, в свою очередь, поглощают погибшие нейтрофилы и другие клетки, действуют как антиген-презентующие клетки, секретируют цитокины и множество пептидных факторов роста [26]. Фагоцитоз нейтро-филов, находящихся в состоянии апоптоза имеет важнейшее значение, поскольку сопровождается также устранением активирующего влияния цито-кинов по привлечению лейкоцитов в очаг воспаления [26]. Макрофаги, в частности, секретируют такие цитокины и факторы роста, как [41]: TGF-, TGF-, основной FGF (bFGF), VEGF и PDGF. Обозначенные факторы активируют и привлекают местные эндотелиальные клетки, фибробласты, кера-тиноциты, и стимулируют восстановление раневого дефекта путем активации клеточной пролиферации, синтеза экстрацеллюлярного матрикса, индукции ангиогенеза. Также VEGF [42-45] стимулирует экспрессию самими макрофагами ФНО-альфа, который, связываясь с рецептором лимфотоксина, индуцирует гибель макрофагов [46].
Так, макрофаги являются ключевыми клеточными регуляторами заживления ран, истощение пула которых существенным образом нарушает естественное течение процесса [42, 47]. В экспериментальных исследованиях, проведенных Leibovich and Ross [48] было показано, что введение анти-макрофагальной сыворотки наряду с гидрокортизоном ограничивает колонизацию кожной раны морских свинок макрофагами. В результате нарушался естественный процесс регуляции количественного и качественного состава клеточных и матриксных элементов, снижалось количество фибробластов и компрометировался процесс заживления [48].
Очевидно, что воспалительная реакция, вызванная повреждением, участвует в процессе заживления лишь в том случае, если она своевременна и ограничена во времени. Вместе с тем, воспаление не обязательно для заживления кожных ран. В своем исследовании Martin et al. [49] показали, что у PU.1 null мышей, лишенных макрофагов и нейтрофилов линейная и плоскостная раны заживают в те же сроки, что и у представителей дикого вида животных с тем лишь отличием, что у первых не формируется рубец. Возможным объяснением подобному явлению является то, что спектр цитокинов и факторов роста в тканях раны у нокаутных мышей существенно отличался от дикого вида, что сопровождалось редукцией процессов клеточной смерти и формирования рубцовой ткани [49].
Исследования, в рамках которых изучали роль тромбоцитов и тучных клеток, показали, что данные клетки не являются облигатными при заживлении ран. Позже было показано, что ингибирование или модификация воспалительной фазы заживления приводит к сокращению объема рубцовой ткани [29, 50]. В то же время, как уже было замечено нами выше, нарушение мак-рофагальной функции в области раневого дефекта, нарушает разрешение воспалительной реакции. А персистенция воспалительной реакции при сахарном диабете является результатом незавершенности фагоцитоза находящихся в состоянии апоптоза или погибших клеток [51]. При этом, пролонгирование воспаления не только компрометирует закрытие кожной раны, но также усугубляет формирование рубцовой ткани [52, 53].
Липидные медиаторы, такие как липоксины, резолвины, протектины и маресины, в настоящее время рассматриваются как молекулярные новеллы, обладающие высоким потенциалом по регуляции острой воспалительной реакции и разрешению воспалительного процесса, с его трансформацией в следующую стадию ранозаживления [54].
В фокусе научной дискуссии находится и активность различных про-теолитических ферментов. Так, металлопротеиназы, сериновые протеазы, нейтрофильные эластазы могут играть ключевую роль в трансформации острой раны в хроническую [17]. Показано повышение активности протеаз в жидком отделяемом и тканях длительно незаживающих ран у человека, что ведет к немедленной биодеградации экзогенно введенных пептидных факторов роста [55, 56]. Следовательно, перспективным альтернативным направлением подавления такой гиперактивности является использование матриксов-скавенджеров протеаз, селективных протеазных ингибиторов и антител [57, 58].
Последними в очаг раневого процесса появляются лимфоциты, ответственные за специфический ответ против микроорганизмов и других антигенов за счет В-лимфоцит опосредованной продукции антител и выделения ци-токинов – регуляторов цитолитической активности. Лимфоцит-опосредованный этап воспалительной реакции заканчивается апоптозом вследствие выработки интерферона-с и ФНО-альфа [26].
Роль тучных клеток, появляющихся на заключительных этапах воспалительной реакции, до настоящего времени остается не совсем ясной. Вместе с тем, у мышей, дефицитных по данному виду клеток, было доказано нарушение процесса заживления кожной раны [59]. Также доказано участие клеток в фиброзировании кожной раны [60, 61], более того, указано на наличие корреляционной связи между их уровнем и вероятностью формирования ке-лоидных и гипертрофических рубцов [60, 61].
Метод количественного определения некоторых цитоки-нов в тканях раны крыс
Для определения роли активации или подавления ключевых сигнальных систем в процессе репарации инфицированной и неинфицированной кожной раны у здоровых крыс и животных с экспериментальным сахарным диабетом на фоне топического воздействия серебряной (ЛХТ-7-17) и 3-оксипиридиновой (ЛХТ-6-17) солей N-ацетил-6-аминогексановой кислоты изучили тканевые концентрации ведущего пускового фактора воспаления – фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа), цитокина с противовоспалительной активностью – ИЛ-10, а также фактора-активатора воспаления – ИЛ-1, ответственного за активацию регенераторных процессов и клеточной диф-ференцировки, с помощью метода иммуноферментного анализа.
ПРИНЦИП МЕТОДА. В основу теста положен количественный твердофазный иммуноферментный анализа типа «сэндвич». Микропланшет на 96 измерений, входящий в составе набора, покрыт специфическими монокло-нальными антителами к ФНО-, ИЛ-10 или ИЛ-1 крысы. В ходе реакции в отдельные лунки микропланшета вносили стандарты и образцы. ФНО-, ИЛ-10 или ИЛ-1, присутствующие в пробах стандартов и образцов, связывается с иммобилизованными антителами. После промывки несвязавшиеся компоненты удаляли, и в каждую лунку микропланшета вносили конъюгат полик-лональных антител к ФНО-, ИЛ-10 или ИЛ-1 с биотином. После промывки в каждую лунку вносили комплекс авидин – пероксидаза хрена (HPR). После промывки и удаления несвязанного авидин-ферментного комплекса, в лунки вносили хромогенный субстрат. Интенсивность окраски была прямо пропорциональна количеству ФНО-, ИЛ-10 или ИЛ-1 образца. Цветную реакцию останавливали и измеряли интенсивность окраски.
ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ. Приготовление тканевого гомогената. 100 мг ткани иссеченной раны крысы (или иссеченных свежих грануляций на 8 сутки формирования раневого дефекта) промывали однократно буфером PBS, гомогенизировали в 1 мл 1х PBS и хранили в течение ночи при -20C в морозильной камере «SANYO» (Корея).
После двух циклов размораживания и повторного замораживания и размораживания происходило разрушение клеточных мембран, и гомогенаты центрифугировали в течение 5 минут при 5000 g и температуре 2-8 С. Су-пернатант отделяли немедленно и исследовали.
Аликвоты хранили при температуре -80C в морозильной камере того же производителя. Избегали повторного размораживания образцов. При необходимости, перед исследованием размороженных образцов их центрифугировали.
Использовали исследовательские диагностические наборы производства CUSABIO BIOTECH Co., LTD (США), более детальная информация о котором, представлена в таблице 2.4.
Динамика микроскопических изменений плоскостной не-инфицированной раны кожи в процессе заживления на фоне различных методов консервативного лечения
При изучении микроскопической динамики процесса заживления плоскостной кожной раны получили объективные доказательства эффективности примененного консервативного метода.
В микропрепаратах фрагментов кожи, подкожно-жировой клетчатки контрольной группы животных, полученных на 4, 8 и 21 сутки наблюдения наблюдали признаки формирования асептического воспаления с формированием на поверхности раны грубого соединительно-тканного рубца (рис. 4.9-4.11). В то же самое время топическое воздействие препаратом сравнения и исследуемыми мягкими лекарственными формами солей N-ацетил-6-аминогексановой кислоты приводило к предотвращению воспалительной трансформации процесса закрытия раневого дефекта и активации первичной эпителизации раны – первичным натяжением.
На 4 сутки опыта в микропрепаратах контрольной группы животных наблюдались явления некроза. В подлежащих тканях признаки инфильтра-тивной воспалительной реакции, проявляющейся лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией, отеком подлежащих тканей, полнокровием сосудов.
В микропрепаратах животных, получавших однократное топическое воздействие 3-оксипиридиновой солью N-ацетил-6-аминогексановой кислоты (соединение ЛХТ-6-17) в виде 1% мази также отмечали явления некроза и формирование воспаления с преобладанием лимфо-гистиоцитарных клеточных элементов. Микропрепараты крыс, получавших однократное топическое воздействие серебряной солью N-ацетил-6-аминогексановой кислоты (соединение
Микропрепараты плоскостной кожной раны у крыс контрольной группы и на фоне местного использования солей N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на 4 сутки эксперимента: А – контроль; Б и В – на фоне первого местного воздействия ЛХТ-6-17 и ЛХТ-7-17 в виде 1% мазей соответственно (гематоксилин и эозин, слева х100, справа х200) 77 ЛХТ-7-17) в виде 1% мази на вторые сутки после воспроизведения плоскостной кожной раны, имели незначительные отличия от описанных выше: регистрировали преобладание некроза и воспалительной реакции с преобладанием лейкоцитарного компонента. В отличие от группы контроля наблюдали появление клеточных элементов грануляционной ткани.
На 8 сутки эксперимента в микропрепаратах, полученных в контрольной серии животных (рис. 4.10), в области раневого кожного дефекта на фоне сохраняющегося некроза (до 20% площади раны) наблюдалась значительная экспансия грануляционной ткани, составляющей до 80% площади раневого дефекта. Ткани раны инфильтрированы макрофагами и лимфоцитами, сохраняется периваскулярный и перицеллюлярный отек, полнокровие сосудов с явлениями стаза эритроцитов.
В микропрепаратах животных, получавших двукратное (на 2 и 6 сутки) топическое воздействие 3-оксипиридиновой солью N-ацетил-6-аминогексановой кислоты (соединение ЛХТ-6-17) в виде 1% мази отмечалась значительная динамика патоморфологической картины. На фоне очищающейся от некротических масс раны происходит формирование грануляционной ткани. В клеточном составе преобладают фиброциты (до 50 в поле зрения), лимфоциты (до 30 в поле зрения), плазматические клетки (до 20 в поле зрения). В микропрепаратах видны начальные явления апикальной эпители-зации раневого дефекта.
В микропрепаратах животных, получавших двукратное (на 2 и 6 сутки) топическое воздействие серебряной солью N-ацетил-6-аминогексановой кислоты (соединение ЛХТ-7-17) в виде 1% мази отмечалась еще более значительная динамика патоморфологической картины при сравнении с группой контроля и 3-оксипиридиновой соли.
Рана полностью очищена от некротических тканей и выполнена созревающей грануляционной тканью. Доминируют фибробласты, синтезирующие коллагеновые и эластические волокна. Грануляционная ткань распространена и на подлежащие ткани.
В поле зрения наблюдается множество капилляров (до 40), при этом хорошо заметно накопление действующего вещества мази, содержащей ЛХТ-7-17 в перикапиллярной зоне за счет серебряного окрашивания (рис. 4.10Б правая микрофотография с увеличением 200). Наблюдаются интенсивно идущие явления эпителизации.
На завершающей фазе эксперимента оценили микроскопическую картину внешне закрывшегося раневого дефекта в исследуемых группах (рис. 4.11). В целом, в области раневого кожного дефекта наблюдается рубцовая ткань на фоне слабой краевой эпителизации. Выражены явления гиперкератоза. В зрелой грануляционной ткани под рубцом преобладают фибробласты, единичные капилляры (в поле зрения 2-5). Сохраняются явления инфильтра-тивного воспаления. Заживление раны вторичным натяжением: регистрируются явления субституции.
В микропрепаратах животных, получавших трехкратное (на 2, 6 и 12 сутки) топическое воздействие 3-оксипиридиновой солью N-ацетил-6-аминогексановой кислоты (соединение ЛХТ-6-17) в виде 1% мази отмечалась значительная позитивная динамика патоморфологической картины. На фоне очистившейся от некротических масс раны происходит эпителизация раневой поверхности. Следовательно, можно сделать вывод о том, что топическое воздействие 3-оксипиридиновой солью N-ацетил-6-аминогексановой кислоты приводит к заживлению раны путем реституции за счет активации регенерации.
В микропрепаратах животных, получавших трехкратное (на 2, 6 и 12 сутки) топическое воздействие серебряной солью N-ацетил-6-аминогексановой кислоты (соединение ЛХТ-7-17) в виде 1% мази отмечалась еще более значительная положительная динамика патоморфологической картины при сравнении с группой контроля и группой крыс, получавшей в качестве местного агента 3-оксипиридиновую соль.
Рана полностью очищена от некротических тканей и выполнена многослойным ороговевающим эпителием.
В дерме наблюдается множество капилляров (до 50), при этом хорошо заметно накопление действующего вещества мази, содержащей ЛХТ-7-17 в перикапиллярной зоне за счет серебряного окрашивания (рис. 4.11Б правая микрофотография с увеличением 200). Заживление раны произошло первичным натяжением за счет реституции.
При оценке интенсивности экспансии соединительнотканных компонентов в рану при различных видах воздействия воспользовались гистохимическим методом Ван Гизона. Гематоксилин-пикрофуксиновое окрашивание позволяет специфически идентифицировать коллагеновые волокна в микропрепаратах (рис. 4.12).
В контроле на 4 сутки эксперимента в микропрепаратах контрольной группы животных не зафиксировано явлений неоангиогенеза и формирования грануляционной ткани.
Уже к 8 суткам после формирования плоскостной кожной раны заметно значительное преобладание соединительной ткани, что говорит о запуске механизма восстановления целостности вторичным натяжением. К 21 суткам кожная рана животных контрольной группы закрылась вторичным натяжением. В составе рубцовой ткани преобладает коллаген III типа.
В микропрепаратах животных, окрашенных гематоксилин-пикрофуксином и получавших трехкратное (на 2, 6 и 12 сутки) топическое воздействие 3-оксипиридиновой (соединение ЛХТ-6-17) и серебряной (соединение ЛХТ-7-17) солью N-ацетил-6-аминогексановой кислоты в виде 1% мази, отмечалась следующая морфологическая динамика. На 4 сутки наблюдения активировался неоангиогенез с преобладанием микрососудов капиллярного типа. Плотность сосудистых компонентов достигала 12 в поле зрения (рис. 4.11Б, В).
На 8 сутки в препаратах наблюдали умеренное окрашивание на наличие коллагена, а также отмечали миграцию конгломератов, содержащих серебряную соль N-ацетил-6-аминогексановой кислоты и захваченных фиб-робластами, в толщу раневого дефекта кожи.
Использование гистохимического метода исследования (по Ван Гизо-ну) позволило на 21 сутки опыта подтвердить факт первичного заживления кожной плоскостной неинфицирвоанной раны во всех препаратах, полученных у животных, подвергавшихся местному фармакологическому воздействию.
Противомикробная активность производных N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на модели хирургической раневой инфекции
В результате проведенного на предыдущем этапе исследования мы установили, что неинфицированная экспериментальная хирургическая кожная рана у крыс имеет типичную клиническую картину, проявляющуюся умеренными признаками эндогенной интоксикации и заживающей вторичным натяжением с формированием рубца, в основе которого преобладает коллаген III типа. Сразу после воспроизведения раны, наблюдали минимальное кровотечение, прекратившееся самостоятельно. Небольшие отек и эритема наблюдались на ранних стадиях заживления ран, которое быстро прогрессировало почти до полного восстановления целостности тканей через 2-3 недели.
Микроскопически неинфицированная рана первоначально демонстрировала классические признаки воспаления: некроз, периваскулярный и пери-целлюлярный отек, полнокровие капилляров, лимфо-гистиоцитарная инфильтрация окружающих тканей. В результате проведения хирургической процедуры гибели животных не наблюдалось.
При инфицировании раневой поверхности плоской кожной раны S.aureus и P.aeruginosa, клинические признаки инфекции присутствовали, но не были ярко выражены. По краям ран наблюдались незначительные отек и эритема, нагноение свободных краев раневого дефекта. Заживление ран обычно требовало около 3-х недель с момента заражения. Гибель мышей, инфицированных S.aureus не наблюдалась. Отмечали летальность 17% животных в группе экспериментальных животных, инфицированных P.aeruginosa.
Для воспроизведения раневой инфекции использовали инокулюм микроорганизмов плотностью 1,5108 КОЕ в Мюллер-Хинтон бульоне (0,5 по Мак-Фарланду).
В настоящем разделе изучены 3-оксипиридиновая (ЛХТ-6-17) и серебряная (ЛХТ-7-17) соли N-ацетил-б-аминогексановой кислоты в виде магистральных 1% мазей производства АО «ВНЦ БАВ» (Россия). В качестве препарата сравнения применяли широкоспектрный антибиотик полимиксин М в виде 1% магистральной мази, изготовленной на той же мазевой основе, что и исследуемые вещества.
Лечебная процедура включала трехкратное нанесение на раны препарата сравнения и исследуемых лекарственных форм на 2, 6 и 12 сутки после воспроизведения ран: ЛХТ-6-17, ЛХТ-7-17 для экспериментальных хирургических ран, инфицированных S.aureus АТСС 43300; ЛХТ-6-17, ЛХТ-7-17 -для экспериментальных хирургических ран, инфицированных P. aeruginosa АТСС 27853 (табл. 5.9 и 5.10).
В процессе эксперимента определено, что методика поверхностных смывов собирает из раны только поверхностно локализованные бактерии, тогда как метод гомогенизации оценивает как поверхностные, так и тканево-локализованные микроорганизмы. Поэтому, более высокие показатели обсе-мененности раны, полученные методом гомогенизации, являются показателем инвазивности заражающего организма (табл. 5.9 и 5.10).
Однако количество микроорганизмов раны, полученное методом поверхностного смыва, хотя и ниже, также точно отражает динамику общего количества микроорганизмов раны, поверхностно- и тканево-локализованных бактерий в ходе инфекции.
Также была исследована возможность системного поражения в результате раневых инфекций, вызванных P.aeruginosa и S.aureus. Через различные промежутки времени после заражения исследованы внутренние органы и кровь для определения отсутствия или наличия тестируемого организма. Обе инфекции проявили некоторую степень системного участия довольно быстро после заражения.
В случае инфекции S.aureus тестируемый организм был обнаружен в печени, селезенке и почках у большинства крыс в течение 24 часов после инфицирования и определялся в течение первой недели (табл. 5.11). Однако, когда органы исследовались через 2 недели после заражения, S.aureus выделялся довольно редко.
Из органов, взятых через 3-х и 4-недельные интервалы постинфекции, исследуемые микроорганизмы не выделялись. Несколько положительных культур крови были получены только в течение первой недели заражения, причем наибольшее количество было обнаружено после 24 часов культивирования. Во время всего эксперимента не было зафиксировано гибели экспериментальных животных после воспроизведения инфекционного процесса с S.aureus. При инфицировании P.aeruginosa через 3 дня после заражения почти 75% крыс продемонстрировали присутствие микроорганизма в печени, почках и селезенке, хотя культуры крови в большинстве случаев были отрицательными на протяжении всего эксперимента (табл. 5.12).
Были зарегистрированы в течение первой недели после заражения, но ни один из них не произошел позже 7 дня после инфицирования. P.aeruginosa была изолирована из всех внутренних органов погибших крыс, что указывает на развитие генерализованной инфекции.
В эксперименте была оценена эффективность исследуемых соединений, применяемых трехкратно в течение 12 сут. Терапия начиналась через 24 часа после инфицирования, путем нанесения мягкой лекарственной формы исследуемых соединений или препарата сравнения на поверхность ран.
Исследование мазевой основы свидетельствует об отсутствии роста, изучаемых тест-культур в нем и об отсутствии влияния растворителя на развитие экспериментального инфекционного процесса.
После инфицирования инокулятом, содержащим S.aureus, было обнаружено, что исследуемый микроорганизм хорошо размножается в тканях кожи. В первый день натуральный логарифм показателя бактериологического роста в ранах внутри группы экспериментальных животных (п=10) составил 7,2±1,4 КОЕ/рана (табл. 5.13). Через три дня количество микроорганизмов в инфицированных ранах без терапии достигало пикового значения и составляло 7,9±3,0 КОЕ/рана. В последующие дни до седьмого показатели микробного роста оставались примерно на этом же уровне, хотя наблюдалась тенденция к снижению, после чего инфекция постепенно начинала разрешаться, к десятому дню логарифм количества бактерий составлял 5,4±0,4 КОЕ/рана, а к концу второй недели - 2,9±2,4 КОЕ/рана при макроскопической картине заживления.
В течение первых 24 часов экспериментальные раны были закрытыми и сухими. По истечении двух дней, хотя кожа вокруг раны казалась неизменной снаружи, раны открылись, были влажными, с легким воспалением и начальным процессом образования гноя. Между вторыми и седьмыми сутками наблюдения никаких изменений в динамике развития экспериментального инфекционного процесса, кроме увеличения количества гноеобразования не обнаруживалось. С седьмого дня раны начинали очищаться и через десять дней признаков воспаления не визуализировалось, в экспериментальных ранах не было гноя, наблюдалось заживление.
Внешние макроскопические проявления ран, обработанных исследуемыми соединениями, были отличны от необработанных ран и ран, обработанных мазевой основой. Различия были в количестве образовывающегося гноя в обработанных и необработанных ранах и выраженности признаков воспаления. В целом, в ранах, обработанных исследуемыми соединениями, образования гноя не наблюдалось, в отличие от необработанных и обработанных мазевой основой ран животных, и отсутствовали признаки воспаления. Раны оставались сухими в течение всего периода наблюдения.
Данные, представленные в таблице 5.13, свидетельствуют, что использование соединения с лабораторным шифром ЛХТ-6-17 на 2 и 6 сутки формирования раны уменьшало логарифм среднего количества микроорганизмов экспериментальной раны с 5,4±0,7 КОЕ/рана в начале терапии до 2,9±0,5 КОЕ/рана на седьмой день. С 6-го дня раны начинали заживать, что наблюдается в контрольной группе экспериментальных животных на второй неделе после заражения.
Количество бактериальной популяции на 6-й день после терапии соединением с лабораторным шифром ЛХТ-6-17 соответствует показателю 14-го дня экспериментальной инфекции в группе необработанных животных. Стафилококки, выделяемые в течении всего эксперимента из ран, не показывали изменения чувствительности к ЛХТ-6-17 (МПК 7,8 мкг/мл).
Тестируемый микроорганизм был обнаружен в печени, селезенке и почках у большинства крыс в течение 24 часов после инфицирования. После начала терапии исследуемый микроорганизм высевался из ткани печени, почек и селезенки экспериментальных животных в течение первых 2-4 дней (табл. 5.15). Последующее исследование внутренних органов через 1 неделю после заражения и далее, не обнаружило обсемененности S.aureus. Не были также получены положительные культуры крови на фоне терапии. Во время проведения эксперимента не было зафиксировано гибели экспериментальных животных после воспроизведения инфекционного процесса с S.aureus.
Нанесение на экспериментальные раны мягкой лекарственной формы соединения с лабораторным шифром ЛХТ-7-17 на 2 и 6 сутки формирования раны уменьшало логарифм среднего количества микроорганизмов экспериментальной раны с 6,2±1,3 КОЕ/рана в начале терапии до 3,8±1,3 КОЕ/рана на седьмой день (табл. 5.13). S.aureus, выделенные из ран, не обнаруживали изменения чувствительности к ЛХТ-7-17 (МПК 62,5 мкг/мл). С 6-7 дня раны начинали естественным образом заживать.