Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Патологические рубцы кожи: причины и механизмы формирования 12
1.2. Современные методы профилактики патологических рубцов 17
1.3. Флавоноиды как перспективный класс эндотелиопротекторов в профилактике келоидных и гипертрофических рубцов 21
Заключение по обзору литературы 22
Глава 2. Материалы и методы исследования 24
2.1. Характеристика объектов исследования 24
2.2. Лабораторные животные 24
2.3. Постановка опытов и основные экспериментальные серии 27
2.3.1. Моделирование патологического рубца хирургическим методом 27
2.3.2. Моделирование патологического рубца путем термического ожога 28
2.3.3. Моделирование патологического рубца путем химического ожога 28
2.3.4. Регистрация скорости кровотока в зоне рубца с последующей оценкой вазодилатирующей функции эндотелия сосудов кожи 28
2.3.5. Оценка антитромботической функции эндотелия 29
2.3.6. Оценка макроскопической картины процесса заживления 30
2.3.7. Гистологические и морфометрические исследования кожи 31
2.3.8. Иммуноферментный анализ различных маркеров 32
2.3.9. Статистическая обработка результатов эксперимента 32
Глава 3. Изучение влияния исследуемых составов на вазодилатирующую функцию эндотелия при экспериментальном моделировании патологического рубца 34
3.1. Изучение влияния экспериментальных составов на вазодилатирующую функцию сосудов кожи крыс на 7 сутки эксперимента 34
3.2. Изучение влияния экспериментальных составов на вазодилатирующую функцию сосудов кожи крыс на 14, 21 и 45 сутки эксперимента 43
3.3. Резюме 46
Глава 4. Изучение влияния исследуемых составов на антитромботическую функцию эндотелия сосудов кожи крыс с различными экспериментальными моделями патологического рубца 48
4.1. Сравнительная оценка влияния экспериментальных составов и препаратов сравнения на агрегационную активность тромбоцитов крыс с различными моделями экспериментального патологического рубца 48
4.2. Сравнительная оценка влияния экспериментальных составов и препаратов сравнения на уровень фактора фон Виллебранда у крыс с различными моделями экспериментального патологического рубца 58
4.3. Резюме 60
Глава 5. Макроскопическая и микроскопическая оценка процесса формирования рубца 62
5.1. Макроскопическая оценка процесса заживления ран на модели термического ожога кожи крыс 62
5.2. Макроскопическая оценка процесса заживления ран на модели химического ожога кожи крыс 66
5.3. Изучение ранозаживляющей активности исследуемых составов на моделях термического и химического ожога кожи крыс 69
5.4. Гистологические исследования кожи крыс с термическим и химическим ожогами 71
5.5. Анализ некоторых морфометрических показателей кожи животных с экспериментальными патологическими рубцами 89
5.6. Резюме 92
Глава 6. Выяснение возможных механизмов действия исследуемых составов 95
6.1. Влияние исследуемых составов на концентрацию изоформ NOS у животных с различными моделями патологического рубца на ранних сроках заживления 95
6.2. Влияние исследуемых составов на концентрацию АТФ у животных с различными моделями патологического рубца на ранних сроках заживления 100
6.3. Влияние исследуемых составов на концентрацию MMP-1 у животных с различными моделями патологического рубца на ранних сроках заживления 102
6.4. Влияние исследуемых составов на концентрацию PKC у животных с различными моделями патологического рубца на ранних сроках заживления 104
6.5. Резюме 106
Глава 7. Заключение 109
Выводы 117
Перечень сокращений и условных обозначений 120
Список литературы 122
Приложение А 152
Приложение Б 157
Приложение В 185
- Современные методы профилактики патологических рубцов
- Сравнительная оценка влияния экспериментальных составов и препаратов сравнения на агрегационную активность тромбоцитов крыс с различными моделями экспериментального патологического рубца
- Гистологические исследования кожи крыс с термическим и химическим ожогами
- Влияние исследуемых составов на концентрацию изоформ NOS у животных с различными моделями патологического рубца на ранних сроках заживления
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Число пациентов с грубыми патологическими рубцами вследствие
различных травм и хирургических операций продолжает расти с каждым годом,
поскольку представленные на сегодняшний день методы раннего
предупреждения рубцов не всегда являются эффективными (Белоусов А.Е.,
2004; Воронков А.В. и др., 2014; Карпова Т.Н., 2009). Решение данной
проблемы значительно усложняет отсутствие единого мнения относительно
главного пускового механизма: в патогенезе келоидных и гипертрофических
рубцов выделяют нарушение микроциркуляции в поврежденной поверхности,
чрезмерную интенсивность воспаления и активность фибробластов, дисбаланс
между синтезом и деградацией коллагена и т.д. (Борхунова Е.Н., 2011;
Воронков А.В. и др., 2014; Иванова Е.А., 2007; Chike-Obi C.J., 2009; Gauglitz
G.G. et al., 2010). Согласно результатам последних исследований, все
перечисленные выше звенья формирования келоидных и гипертрофических
рубцов могут являться следствием эндотелиальной дисфункции сосудов,
которые расположены и формируются на месте повреждения, поскольку
эндотелий, являющийся высокочувствительной сложноподчиненной
пограничной системой, контролирует синтез различных биологически активных соединений (Майорова А.В. и др., 2015). Именно поэтому поиск новых соединений, которые обладают эндотелиопротекторными свойствами и способны уже на ранних стадиях оптимизировать процесс заживления ран, является, на наш взгляд, весьма актуальным.
Степень разработанности темы
Сравнительно недавно в литературе стали появляться экспериментальные
данные, подтверждающие высокую эффективность наружных лекарственных
форм (гелей, мазей) с растительными экстрактами, иммуномодуляторами,
витаминами и антиоксидантами, в профилактике келоидных и
гипертрофических образований (Бутко Я.А., 2010; Владимирова О.В., 2008; Горохов В.Г., 2011). Основываясь на результатах данных исследований, а также принимая во внимание роль сосудистого эндотелия в нормальном формировании рубцовой ткани, можно сделать вывод, что наиболее перспективным направлением профилактики патологических рубцов является поиск новых природных веществ, оказывающих положительное влияние на функциональное состояние эндотелиоцитов.
В настоящее время особое внимание уделяют флавоноидам, поскольку
они являются мощными растительными антиоксидантами и
эндотелиопротекторами, способными влиять на различные звенья развития эндотелиальной дисфункции (систему синтеза, выделения и биодоступности NO, гемореологические параметры крови, воспаление, пролиферацию) (Азарова О.В., 2012; Cotelle N., 2001; Gonzalez R. et al., 2011). Также имеются сведения о высокой эффективности каротиноидов в восстановлении нормального течения репаративных процессов (Воронков А.В. и др., 2014; Жидкова Ю.Ю., 2014).
Учитывая вышеизложенное, представилось целесообразным провести изучение эндотелиопротекторных свойств и выявить механизмы действия ряда флавоноидов (икариина и флоридзина) и комплекса каротиноидов в условиях экспериментально вызванного патологического рубца.
Цель исследования: экспериментальное обоснование применения новых форм для наружного применения на основе растительных компонентов в качестве эндотелиопротекторов для профилактики образования келоидных и гипертрофических рубцов, а также выявление некоторых механизмов реализации их эндотелиопротекторного действия.
Задачи исследования:
-
Дать оценку структурно-функциональным изменениям эндотелия сосудов кожи после термического и химического ожогов, а также хирургического вмешательства.
-
Изучить влияние новых форм для наружного применения на основе растительных компонентов и препаратов сравнения на вазодилатирующую функцию эндотелия сосудов в условиях экспериментально вызванного патологического рубца.
-
Изучить влияние новых форм для наружного применения на основе растительных компонентов и препаратов сравнения на антитромботическую функцию эндотелия сосудов в условиях экспериментально вызванного патологического рубца.
-
Провести макроскопическую оценку процесса заживления ран, анализ репаративной регенерации, гистологические и морфометрические исследования кожи животных с моделями патологических рубцов при наличии и отсутствии фармакологической поддержки.
-
Определить некоторые механизмы реализации эндотелиопротекторного действия новых форм для наружного применения на основе растительных компонентов.
Научная новизна исследования
Впервые изучено влияние новых форм для наружного применения на
основе растительных компонентов на вазодилатирующую,
противовоспалительную, антитромботическую функции эндотелия сосудов при
экспериментально вызванном патологическом рубце разной этиологии у белых
крыс и подтверждена их противорубцовая активность после первичных
операций, а также после химического и термического ожога, а также
определены потенциально возможные механизмы действия данных
экспериментальных составов на функцию эндотелия кожных сосудов при местном использовании.
Теоретическая и практическая значимость работы
Проведенные исследования дают экспериментальное обоснование эффективности новых форм для наружного применения на основе растительных компонентов в профилактике патологических рубцов.
Результаты исследования позволяют говорить о наличии у
экспериментальных составов ПМФИ-92 и ПМФИ-93 выраженного
эндотелиопротекторного действия, реализующегося за счет восстановления
функционирования системы NO-NOS, улучшения энергетического потенциала клеток, а также активации систем, отвечающих за дифференцировку тканей (ММP-1 и PKC) на ранней стадии заживления ран.
Полученные результаты позволяют рассматривать изученные нами экспериментальные составы ПМФИ-92 и ПМФИ-93 для дальнейших более глубоких исследований с целью создания препарата для профилактики формирования патологических рубцов различной этиологии.
Методология и методы диссертационного исследования
Эксперименты выполнялись на крысах-самцах линии Wistar в
соответствии с утвержденным планом работы, методическими
рекомендациями, правилами и стандартами по доклиническому изучению лекарственных средств с использованием современных методов анализа и диагностики (Миронов А.Н., 2012). Исследования проводились на кафедре фармакологии с курсом клинической фармакологии, кафедре технологии лекарств и кафедре морфологии Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России.
Положения, выносимые на защиту
-
Выраженное положительное влияние новых форм для наружного применения на основе растительных компонентов на вазодилатирующую, антитромботическую и противовоспалительную функцию эндотелия, а также результаты гистоморфологических исследований, позволяют рассматривать перечисленные составы в качестве эффективного средства профилактики формирования патологических рубцов при различных повреждениях и рекомендовать их для дальнейшего более глубокого изучения.
-
В механизме эндотелиопротекторного и противорубцового действия изученных составов важное значение имеет их корректирующее влияние на функционирование систем синтеза NO, матриксных металлопротеиназ MMP-1, протеинкиназы C, АТФ-синтетаз.
Степень достоверности и пробация результатов
Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментальных исследований и использованием для решения поставленных задач комплексного морфофункционального подхода, позволяющего с разных сторон оценить эффективность предложенных нами новых составов. В работе были задействованы современные методы диагностики, все эксперименты проводились на высокотехнологичном оборудовании, результаты подвергались статистической обработке с учетом параметрических и непараметрических критериев. Выводы сформулированы согласно полученным экспериментальным данным и согласуются с имеющимися литературными данными.
Основные положения и материалы диссертации представлены в виде докладов на следующих научных конференциях и съездах: 73-й, 74-й, 75-й научно-практической конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, г. Пятигорск 2015-2017 гг.), I научно-практической конференции с международным участием «Дезадаптация
различного генеза и пути ее фармакологической коррекции» (г. Пятигорск,
2015 г.), I научно-практической конференции научного общества им. И.П.
Павлова (г. Пятигорск, 2015 г.), V-й Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Беликовские чтения» (г. Пятигорск,
2016 г.), III Международной научно-практической конференции «Актуальные
аспекты экспериментальной и клинической фармакологии: от молекулы к
лекарству» (г. Пятигорск, 2017 г.).
Работа апробирована на расширенном заседании кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологииПятигорского медико-фармацевтического института – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из которых 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для изложения основных положений диссертационного исследования.
Личный вклад автора
Вся экспериментальная часть работы выполнена автором лично или при
его непосредственном участии. Автором также проведены: поиск современной
научно-патентной информации, соответствующей теме диссертационной
работы, на основании которого выбраны объекты и разработан дизайн
исследования; статистическая обработка, описание и интерпретация
полученных результатов; формулирование основных положений, заключений и
выводов, подготовка публикаций и докладов по основным положениям
диссертационной работы; оформление рукописи, автореферата и
сопроводительной документации.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 186 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав (обзор литературы; материал и методы исследования; 5 глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение), выводов, списка литературы, включающего 307 источников, из которых 154 на русском языке и 153 на иностранных языках, и 3 приложений. Текст работы иллюстрирован 16 таблицами и 131 рисунком.
Современные методы профилактики патологических рубцов
Профилактика осложнений при заживления ран является серьезной задачей современной медицины, при этом важно своевременно принять необходимые меры по предотвращению формирования гипертрофических и келоидных рубцов, особенно в тех случаях, когда повреждение кожного покрова происходит в результате аварийных ситуаций и сопровождается обширными ожогами и ранениями [126, 129, 135, 172, 241, 242].
Существует относительно небольшое количество способов, позволяющих снизить риск развития патологических рубцов на раннем этапе [136, 143, 145, 224, 229]. Кроме необходимых хирургических манипуляций, они включают в себя меры по снижению натяжения кожи, перевязку, увлажнение и защиту свежей рубцовой ткани от ультрафиолетового излучения [174, 175, 182, 186, 230, 253, 296, 301]. В литературных источниках имеются сведения об эффективности воздействия на раневую поверхность рентгеновских лучей, магнитотерапии, ультрафонофореза различных лекарственных веществ, в том числе гепарина, кортикостероидов и ферментов с коллагенолитической активностью [137, 148, 153, 161, 181, 185, 290, 293, 307]. При этом кортикостероиды не применяют для профилактики сразу после закрытия раны [197]. Также на ранних этапах формирования рубцовой ткани используют метод лазеротерапии [247]. Некоторые авторы сообщают о положительных результатах использования микрохирургической техники и методов стимуляции системы лимфодренажа тканей в зоне оперативного вмешательства [195, 293]. Другие специалисты подчеркивают эффективность санаторно-курортного лечения, отмечая хорошие результаты использования радоновых и сероводородных ванн [110]. Одним из новых методов профилактики и лечения патологических рубцов является использование экзогенного NO, обладающего кератолитическими и антикоагуляционными свойствами [45, 46, 94]. Кроме того, при серьезных ожогах и ранениях проводятся профилактические курсы антибактериальной, иммуностимулирующей и общеукрепляющей терапии [274, 276, 279, 291, 306].
Единственным общепризнанным методом, наряду с компрессионной терапией, является использование силиконовых гелей, пластин и пластырей [123, 162, 163, 204, 228, 248, 253, 296]. Силиконовые пластины и пластыри оказывают равномерное давление на раневую поверхность, которое не только уменьшает объем внеклеточного матрикса, но и способствует параллельной ориентации новых коллагеновых волокон [38, 39, 47, 78, 190, 207]. Сам силикон после высыхания образует на поверхности кожи очень тонкое покрытие, которое препятствует дегидратации эпидермиса, устраняет вероятность механических повреждений, а также способствует восстановлению функциональной активности фибробластов [95, 168, 173, 259]. Кроме того, некоторые экспериментальные данные сообщают, что отрицательно заряженное статическое электрическое поле покрытия за счет взаимодействия с тканевой жидкостью способно инициировать инволюционный процесс в келоидных рубцах [38, 39, 121, 272]. Наиболее известными силиконсодержащими препаратами являются: Дерматикс (Dermatix), Кело-Кот (Kelo-Cote), Зерадерм (Zeraderm), противорубцовые пластыри Сика-Кеа (CICA-CARE) и Мепиформ (Mepiform) [121, 139, 173, 180, 284].
Среди инновационных направлений следует отметить введение в линию шва интерферонов. Так, в исследованиях in vitro доказано, что интерфероны , и уменьшают продукцию коллагена I, III и VI типов и повышают активность коллагеназы [121, 252]. Кроме того, местное применение IL-1 показано для лечения поражений кожи при ожогах различного происхождения, трофических язвах, пролежнях, хирургических вялотекущих инфицированных ранах [92, 121].
В отдельную группу можно выделить лекарственные неинвазивные методы локальной профилактики патологических рубцов, которые не относятся к общепризнанным стандартам, но, при этом, достаточно популярны [13, 31, 34, 41, 48, 49, 55, 60]. Так, уже более 25 лет в медицине используется гель «Контрактубекс», который обладает комплексным действием, обусловленным входящими в него компонентами [20, 23, 106, 116, 124]. Флавоноиды репчатого лука оказывают стабилизирующее и противовоспалительное действие, гепарин обладает антитромботическими свойствами, аллантоин регулирует водный баланс в ткани рубца и проявляет кератолитическую активность [58, 91, 121, 287, 298].
Сероловая основа геля формирует на поверхности кожи тонкую защитную плёнку, защищающую от повреждений [121]. Результаты различных исследований говорят о том, что во многих случаях применение «Контрактубекса» является высокоэффективным, поскольку препарат положительно влияет на микроциркуляцию в зоне нанесения, снижает воспаление, тормозит пролиферацию клеток соединительной ткани, увлажняет рубцовую ткань [58, 104, 178, 225, 264, 289].
Возможность использования некоторых мазей, гелей и кремов для профилактики патологий рубцовой ткани в качестве самостоятельного метода, а также в качестве составляющей целого алгоритма, ещё оценивается в различных экспериментах [251, 254, 258, 260, 262]. Так, сразу несколько исследований посвящены сравнению фармакологического действия препарата «Контрактубекс» и геля «Медерма», содержащего сок листьев алоэ вера и экстракт лука [106, 121, 281]. Крем «Цикатрикс», на основе центеллы азиатской и сосны обыкновенной также может быть использован для профилактики грубых рубцов, поскольку снижает воспалительную реакцию, подавляет гиперпролиферацию кератиноцитов, а также участвует в реорганизации внеклеточного матрикса [106].
В литературных источниках содержатся сведения об эффективности геля «Эгаллохит» на основе эпигаллокатехин-3-галлата (катехина зеленого чая) в послеоперационном периоде [106, 124, 127, 198]. Гель значительно улучшает качество заживления ран за счёт подавления продукции коллагена фибробластами, а также модуляции ангиогенеза [106, 121, 198]. Для профилактики рубцов предлагают использовать комплексный гомеопатический препарат «Траумель С» с выраженными противовоспалительным, антиэкссудативным, антитромботическим, гемостатическим, иммуностимулирующим, регенерирующим и обезболивающим действиями. Так, в опытах in vitro было доказано, что гель нормализует образование коллагена и, следовательно, способствует восстановлению нормального функционирования внеклеточного матрикса [106, 146].
Как было отмечено ранее, одним из способов фармакологической профилактики патологических рубцов является использование каротиноидов [38, 39]. Так, установлено, что местное применение данных природных веществ стимулирует пролиферацию поврежденных тканей и препятствуют избыточному накоплению коллагена [38, 39, 121].
Сравнительная оценка влияния экспериментальных составов и препаратов сравнения на агрегационную активность тромбоцитов крыс с различными моделями экспериментального патологического рубца
При анализе агрегационной активности тромбоцитов крыс было установлено, что в группе Л/О животных степень агрегации тромбоцитов равна 1,50±0,037 усл.ед, а скорость агрегации тромбоцитов – 1,06±0,068 усл.ед (таблица А.3 Приложения А). На 7 сутки эксперимента у групп животных с моделями ЭПР без фармакологической коррекции отмечено увеличение степени агрегации тромбоцитов относительно Л/О крыс (р 0,05): в группе крыс с ПЭПР в 4,31 раза, с ТЭПР – в 4,55 раза, и наибольшее в группе животных с ХЭПР – в 4,74 раза. Скорость агрегации, в свою очередь, в группе животных с ПЭПР увеличилась в 2,91 раза, а у крыс с ТЭПР и ХЭПР – в 3,04 и 3,06 раза соответственно (рисунок 13).
При использовании препаратов сравнения «Контрактубекс» и «Эгаллохит» в течение 7 дней наблюдалось достоверное снижение исследуемых показателей (р 0,05). Так, у животных с ПЭПР при применении геля «Контрактубекс» степень агрегации тромбоцитов относительно группы животных негативного контроля снизилась на 23,99% (р 0,05), при применении геля «Эгаллохит» – на 18,11% (р 0,05). В то же время скорость агрегации уменьшилась на 7,79% (р 0,05) (КПЭПР) и 7,14% (р 0,05) (ЭПЭПР). При использовании этих же препаратов у групп животных с ТЭПР наблюдалась аналогичная тенденция: степень агрегации уменьшилась на 21,38% (КТЭПР) и 11,42% (ЭТЭПР), скорость агрегации – на 12,73% (КТЭПР) и 4,66% (ЭТЭПР). Эффективным также оказалось использование препаратов сравнения в группах животных с ХЭПР: так, снижение степени агрегации в группе КХЭПР составило 23,77% (р 0,05), в группе ЭХЭПР – 8,72% (р 0,05). Скорость агрегации понизилась (р 0,05) на 9,88% (КХЭПР) и 6,48% (ЭХЭПР) относительно группы животных НК. В то же время, использование препарата сравнения «Метилурацил» не привело к достоверным отличиям анализируемых показателей от таковых в группах животных негативного контроля на 7 сутки эксперимента (рисунок 14).
Применение экспериментального состава ПМФИ-91 в течение недели после моделирования патологии не привело к значимым изменениям степени и скорости агрегации у данных групп животных. Наибольшее позитивное влияние на анализируемые показатели среди всех экспериментальных объектов оказали составы ПМФИ-92 и ПМФИ-93. Так, на модели ПЭПР применение ПМФИ-93 привело к достоверному снижению (р 0,05) степени агрегации на 21,36%, а скорости агрегации – на 10,71% по сравнению с группой животных НК на 7 сутки эксперимента. У животных, получавших состав ПМФИ-92, данные показатели также снизились на 25,08% (р 0,05) и 10,39% (р 0,05), соответственно, относительно не получавших фармакологическую поддержку животных. На моделях ТЭПР и ХЭПР были достоверно ниже (р 0,05) таковых у группы крыс негативного контроля для степени агрегации – на 24,89% (92ТЭПР), 26,3% (92ХЭПР), на 22,69% (9ЗТЭПР) и 25,18% (9ЗХЭПР), для скорости агрегации – на 18,32% (92ТЭПР), 16,98% (92ХЭПР), на 18,01% (9ЗТЭПР) и 15,43% (9ЗХЭПР), что представлено на рисунке 15.
Показатели степени и скорости агрегации на 14 сутки эксперимента наглядно представлены в таблице А.4 Приложения А. Так, у животных, не получавших фармакологическую поддержку, наблюдалось снижение степени агрегации лишь на 16,72% (ПЭПР), 12,74% (ТЭПР) и 12,66% (ХЭПР) относительно аналогичного показателя у тех же групп животных на 7 сутки эксперимента. Скорость агрегации спустя неделю после формирования патологии у животных без лечения также изменилась незначительно: снизилась в группе с ПЭПР на 12,01%, в группе с ТЭПР – на 9% и у животных с ХЭПР уменьшилась на 12,34%.
Как видно из таблице А.4 Приложения А, на 14 сутки эксперимента наилучшие результаты были получены при применении состава ПМФИ-92: степень агрегации за 2 недели фармакологической поддержки на модели ПЭПР снизилась на 28,93%, на модели термического ожога – на 24,37%, на модели химического ожога – на 29,96% относительно показателей на 7 сутки. Скорость агрегации тромбоцитов в то же время уменьшилась на 26,81% (92ПЭПР), 23,57% (92ТЭПР) и 25,65% (92ХЭПР) относительно результатов 7 дня эксперимента (рисунок 16).
При этом степень агрегации на 14 сутки была ниже таковой по сравнению с группами НК в 1,56 раза на модели послеоперационного рубца, в 1,54 раза – на модели термического и 1,69 раза – на модели химического ожога. Скорость агрегации тромбоцитов крови животных, получавших состав ПМФИ-92, была меньше данного показателя в 1,34 раза (92ПЭПР), 1,46 раза (92ТЭПР) и 1,42 раза (92ХЭПР) по сравнению с крысами с ЭПР на 14 сутки эксперимента (рисунок 17).
Использование состава ПМФИ-93 также благоприятно воздействовало на процессы агрегации, способствуя снижению степени и скорости агрегации тромбоцитов. Так, на 14 сутки эксперимента в группе 9ЗПЭПР было отмечено снижение степени агрегации тромбоцитов в 1,54 раза по сравнению с животными без фармакологической поддержки, в группе 9ЗТЭПР – в 1,59 раза, в группе 9ЗХЭПР – в 1,66 раза. Скорость агрегации при этом также снизилась по сравнению с негативным контролем в 1,32 (9ЗПЭПР), 1,48 (9ЗТЭПР) и в 1,38 (9ЗХЭПР) раза (рисунок 18).
Следует также подчеркнуть, что данные результаты статистически отличались от результатов, полученных после недели использования состава: степень агрегации спустя 2 недели использования состава ПМФИ-93 снизилась на 31,1% (9ЗПЭПР), 28,98% (9ЗТЭПР), 29,7% (9ЗХЭПР) относительно показателей на 7 сутки. Аналогично отмечено снижение скорости агрегации тромбоцитов на 25,45% (9ЗПЭПР), 25% (9ЗТЭПР) и 24,82% (9ЗХЭПР) по сравнению с результатами, полученными на 7 сутки (рисунок 19).
Экспериментальный состав ПМФИ-91 так же, как и на 7 сутки, не оказал достоверно значимых отличий от значений степени и скорости агрегации у животных НК (таблица А.4 Приложения А). При этом степень агрегации в данных экспериментальных группах уменьшилась на 17,71%, 20,06% и 20,23% по сравнению с показателем на 7 сутки в группах животных с хирургическим, термическим и химическим патологическим рубцом, соответственно (рисунок 20). Также отмечено снижение скорости агрегации всего лишь на 9,73% (91ПЭПР), 9,45% (91ТЭПР) и 10,15% (91ХЭПР).
Значения степени и скорости агрегации тромбоцитов экспериментальных животных на 21 сутки эксперимента отражены в таблице А.5 Приложения А. Следует подчеркнуть, что у животных, не получавших фармакологическую поддержку в течение указанного промежутка времени, отмечено незначительное улучшение антитромботической функции эндотелия, при этом оба показателя сохранили высокое значение относительно Л/О животных: в группе ПЭПР степень агрегации была выше в 1,62 раза, а скорость – в 1,91 раза; у животных с ТЭПР степень агрегации была выше в 1,67 раза, а скорость агрегации – в 1,92 раза; у животных с ХЭПР в 1,73 и 2,00 раза для степени и скорости агрегации относительно Л/О группы, соответственно (рисунок 21).
В группе ЭПЭПР степень агрегации и скорость агрегации снизились на 17,28% и 10,89%, соответственно, относительно животных с ПЭПР. У животных ЭТЭПР степень агрегации и скорость агрегации была ниже на 17,2% и 5,42%, соответственно, чем у группы с ТЭПР. В группе ЭХЭПР наблюдалось снижение на 18,85% и 11,79% степени и скорости агрегации по сравнению с НК. У животных, получавших в течение трех недель «Контрактубекс» степень агрегации снизилась по отношению к животным НК на 21,4% (КПЭПР), 18% (КТЭПР) и 20% (КХЭПР), а скорость агрегации – на 11,88% (КПЭПР), 13,3% (КТЭПР) и 15,57% (КХЭПР) (рисунок 22).
Использование состава ПМФИ-93 позволило значительно улучшить исследуемые показатели: на 21 сутки скорость агрегации была ниже, чем у животных НК, на 23,87% (9ЗПЭПР), 20% (9ЗТЭПР) и 25,77% (9ЗХЭПР). Степень агрегации была ниже аналогичного показателя в группе НК на 15,84% (9ЗПЭПР), 14,78% (9ЗТЭПР) и 16,04% (9ЗХЭПР) (рисунок 24).
Наибольшее положительное влияние на изучаемые показатели при всех моделях ЭПР оказал экспериментальный состав ПМФИ-92 (таблица А.5 Приложения А). Так, степень агрегации была ниже, чем у животных НК, на 24,28% (92ПЭПР), 24% (92ТЭПР) и 24,23% (92ХЭПР), а скорость агрегации – на 16,83% (92ПЭПР), 16,26% (92ТЭПР) и 23,11% (92ХЭПР) (рисунок 25).
Гистологические исследования кожи крыс с термическим и химическим ожогами
При гистологическом исследовании кожи экспериментальных животных на 7 сутки после термического ожога отмечено формирование струпа с наличием воспалительной реакции различной степени выраженности. При отсутствии лечения после термического ожога у всех крыс наблюдалась деструкция дермы с выраженной воспалительной реакцией как непосредственно под струпом, так и по периферии дефекта (Приложение Б, рисунок Б. 11). Следует отметить, что воспалительный процесс распространялся вплоть до мышечного слоя, приводя к вторичному повреждению ткани. Скопление экссудата под струпом приводило к формированию микроабсцессов. Коллагеновые волокна при окраске по Ван-Гизону не определялись ни в зоне дефекта, ни в подлежащих тканях.
При использовании состава ПМФИ-92 было установлено, что поверхностный дефект характеризовался формированием струпа с наличием на поверхности небольшого количества наносимого препарата, что обеспечивало достаточно благоприятные условия для регенерации эпителия. На данном сроке эксперимента область дефекта характеризовалась обширным некрозом, распространившимся не только на всю дерму, но и на мышечные волокна, где сохранялись только их очертания. На границе кожа-мышцы было выявлено скопление экссудата, представленного пустыми вакуолями, сливающимися между собой (Приложение Б, рисунок Б.1). Степень воспалительной реакции была умеренно выражена в виде нейтрофильной инфильтрации. Следует отметить, что, несмотря на наличие обширного некроза дермы, определялась базальная мембрана эпидермиса с сохранением слоя базальных клеток, что может служить источником для регенерации дефекта кожи. Сам струп был представлен гомогенно прокрашенными эозинофильными массами, что свидетельствовало о его достаточной плотности. При окраске по Ван-Гизону обнаруживалась полная деструкция коллагеновых волокон (отсутствие окрашивания) дермы в области дефекта (Приложение Б, рисунок Б.2).
У животных с термическим ожогом, получавших в течение 7 дней экспериментальный состав ПМФИ-93, также отмечалась обширная зона некроза всей дермы, при этом эпидермис и сосочковая зона не определялись. Наблюдалось «классическое» развитие воспалительной реакции с полнокровием сосудов (воспалительная гиперемия) непосредственно под струпом, а также обильная экссудация на границе дерма – гиподерма, направленная на отторжение струпа (Приложение Б, рисунок Б.3). Воспалительная реакция была умеренно выражена и проявлялась в виде периваскулярного нейтрофильного инфильтрата. Придатки кожи, расположенные в поверхностных слоях кожи, были представлены в виде крупных пустых вакуолей за счет погибших клеток. В связи с достаточно выраженной экссудацией участки струпа чередовались с эозинофильными некротическими массами, что свидетельствовало о меньшей плотности струпа, чем в предыдущей группе животных. Интересно отметить, что при окраске по Ван-Гизону на границе дерма-гиподерма на фоне полнокровных сосудов отмечались сохранные коллагеновые волокна, располагавшиеся параллельно поверхности кожи, а также фибробласты, что, в крайнем случае, при недостаточной эпидермизации может обеспечить адекватное восстановление дефекта кожи посредством формирования рубца с минимальными изменениями поверхности кожи (Приложение Б, рисунок Б.4).
Кардинально противоположным влиянием на заживление термического ожога обладал препарат сравнения «Эгаллохит», действие которого оказалось направленным на изменение струпа, морфологически выражавшееся в формировании крупных вакуолей в дерме, преимущественно в сосочковом слое. У животных с термическим ожогом на данном этапе эксперимента вакуоли были достаточно крупными и располагались группами на протяжении сосочкового слоя дермы. На поверхности некротизированного эпидермиса достаточно рыхло располагался используемый гель в виде гранул темно-коричневого цвета. В более глубоких отделах дермы (ретикулярный слой) струп был представлен гомогенными эозиновыми массами, что свидетельствовало о достаточной плотности струпа. Перифокально наблюдалась умеренно выраженная воспалительная реакция (Приложение Б, рисунок Б.5). При окраске по Ван-Гизону волокна дермы не определялись вплоть до мышечного слоя (Приложение Б, рисунок Б.6).
У крыс с термическим ожогом, получавшим препарат сравнения «Контрактубекс», на 7-е сутки эксперимента струп характеризовался неравномерной плотностью на протяжении всей дермы за счет наличия экссудата, который локализовался преимущественно рядом с придатками кожи и был представлен крупными вакуолями. Остальные некротизированные участки характеризовались достаточно плотными гомогенными эозинофильными массами. В области дефекта эпидермис и сосочковый слой дермы не определялись, однако по периферии отмечались фрагменты многослойного плоского неороговевающего эпителия с подлежащей измененной (некротизированной) дермой (Приложение Б, рисунок Б.7). Данный факт свидетельствовал о том, что уже на 7 сутки наблюдалось начало краевой эпителизации дефекта с субэпителиальной нейтрофильной инфильтрацией умеренной степени выраженности. В отдельных случаях в области струпа отмечались мелкоочаговые кровоизлияния. При окраске по Ван-Гизону в области термического поражения наблюдалась деструкция коллагеновых волокон (отсутствие окраски фуксином) (Приложение Б, рисунок Б.8).
При гистологическом исследовании образцов кожи после термического поражения и недельного использования препарата «Метилурацил» установлено, что основная масса тканей была представлена некротическими массами (Приложение Б, рисунок Б.9). Струп характеризовался равномерным прокрашиванием эозином без признаков отека и наличия экссудата. Эпидермис и дерма были представлены достаточно плотными некротическими массами с минимальной перифокальной воспалительной инфильтрацией. При окраске по Ван-Гизону компоненты соединительной ткани дермы не выявлены, что связано с обширным некрозом, распространяющимся вплоть до мышечной ткани (Приложение Б, рисунок Б.10).
При использовании в течение 7-ми дней состава ПМФИ-91 было отмечено, что в зоне ожога происходила деструкция волокон дермы, а также массивная гибель фиброцитов, часть из которых имела пикнотичные ядра. Кроме этого, наблюдалось формирование достаточно крупных вакуолей, как в поверхностных слоях струпа, так и на границе с дермой и мышечной тканью, что свидетельствовало о выраженном отеке, не смотря на относительно умеренную лейкоцитарную инфильтрацию (Приложение Б, рисунок Б.13). В периферической зоне на границе с дермой на фоне нанесения ПМФИ-91, по-прежнему, наблюдались дистрофические изменения волокон дермы, о чем свидетельствовало наличие эффекта метахромазии (при окраске эозином голубое окрашивание). При окраске по Ван-Гизону в области дефекта кожи наблюдалась полная деструкция коллагеновых волокон с образованием гомогенных масс, окрашенных в розово-желтый цвет, а также различной плотностью струпа за счет формирования крупных вакуолей (Приложение Б, рисунок Б.14). При оценке краевой зоны с признаками мукоидного набухания в поверхностных участках коллагеновые волокна не определялись, в то время как в подлежащем слое дермы волокна были сохранны.
При отсутствии лечения термического ожога на 14-е сутки эксперимента морфологические изменения были более существенными, чем в других группах, что проявлялось в виде выраженной лейкоцитарной инфильтрации под струпом с распространением на мышечную ткань и формированием микроабсцессов, в связи с чем наблюдалась деструкция подлежащих тканей и мелкоочаговые кровоизлияния (Приложение Б, рисунок Б.21). На фоне выраженного воспаления наблюдался отек на границе дерма - мышечная ткань, проявлявшийся в виде множества оптически пустых пространств и крупных вакуолей. При окраске по Ван-Гизону в области дефекта волокна были представлены бесструктурными массами светлого малинового цвета, что свидетельствовало об их деструкции в результате термического воздействия (Приложение Б, рисунок Б.22). Повреждение распространялось до мышечного слоя, где отмечались частично сохранные прослойки соединительной ткани в виде тонких коллагеновых волокон.
При гистологическом исследовании кожи крыс с термическим ожогом, получавших состав ПМФИ-91, на 14 сутки эксперимента были выявлены признаки краевой эпителизации дефекта кожи, которые проявлялись в виде пролиферации многослойного плоского ороговевающего эпителия и расположением его непосредственно под струпом (Приложение Б, рисунок Б.15). Кроме этого, наблюдалось формирование незрелой соединительной ткани под струпом, которая характеризовалась наличием обилия кровеносных сосудов умеренного кровенаполнения и хаотичным расположением волокон соединительной ткани. Также отмечалась скудная лейкоцитарная инфильтрация. В более глубоких слоях дермы и подлежащей мышечной ткани выявлялись полнокровные сосуды и наличие пустых пространств непосредственно под струпом, что может свидетельствовать о начале отторжения некротических масс, образовавшихся в результате термического ожога. При окраске по Ван-Гизону в грануляционной ткани были выявлены разнонаправленные тонкие пучки коллагеновых волокон под струпом, в то время как по краю дефекта в зоне эпителизации коллагеновые волокна были зрелыми и соответствовали нормальному строению кожи (Приложение Б, рисунок Б.16).
Влияние исследуемых составов на концентрацию изоформ NOS у животных с различными моделями патологического рубца на ранних сроках заживления
Как было сказано ранее, NO играет ключевую роль во всех фазах процесса заживления ран: регулирует воспаление, оксидацию и локальный иммунитет на стадии воспаления; влияет на синтез коллагена, сосудов и дифференцировку фибробластов в фазу репарации, ускоряя, тем самым, завершающую стадию эпителизации раны [21, 157, 158, 206]. Кератиноциты эпидермиса постоянно выделяют нейрональную изоформу NOS-1, которая, согласно последним данным, играет важную роль в поддержании сосудистого гемостаза за счет синтеза H2O2, способствующего ЭЗВД [72, 278]. Усиление активности nNOS может играть компенсаторную роль при сниженной активности NOS-3 (eNOS) – изофермента, выделяемого фибробластами дермы и другими клетками кожи [179]. При этом подавление активности eNOS и избыточная активация iNOS при повреждениях кожи может привести к нарушению физиологического процесса репарации тканей [120, 108].
С помощью иммуноферментного анализа нами были определены концентрации eNOS, nNOS и iNOS у экспериментальных животных с моделями термического и химического рубца, поскольку они приводили к наиболее выраженному угнетению функции эндотелия по сравнению с моделью послеоперационного патологического рубца.
У Л/О животных концентрация eNOS составила 97,33±2,577 пг/мл (Приложение В, таблица В.1). У животных с моделью термического рубца на 7 сутки эксперимента наблюдалось снижение концентрации eNOS в 1,31 раза по сравнению с Л/О крысами, при этом данный показатель еще больше уменьшился на 14 сутки (в 1,45 раза по сравнению с этой же группой). У животных с химическим ожогом также установлено снижение концентрации eNOS по сравнению с Л/О группой в 1,27 и в 1,32 раза на 7 и 14 сутки, соответственно (рисунок 42).
При применении препарата сравнения «Контрактубекс» у животных с моделью термического ожога отмечено увеличение концентрации eNOS на 16,14% (7 сутки) и 50% (14 сутки) по сравнению с группами НК. У животных с химическим ожогом также отмечен рост данного показателя на 22,06% (на 7 сутки) и на 33,87% (на 14 сутки лечения), что видно на рисунке 42.
Применение препаратов сравнения «Метилурацил» и «Эгаллохит» не вызвало существенного изменения концентрации eNOS ни на модели термического, ни на модели химического ожога по сравнению с группой Л/О животных (рисунок 42). При применении в течение недели состава ПМФИ-93 отмечено увеличение концентрации eNOS на 25,16% (ТЭПР) и 25,44% (ХЭПР) по сравнению с животными НК. На 14 сутки эксперимента отмечено еще большее по сравнению с животными без лечения увеличение содержания фермента: на 66,66% для животных с ТЭПР и на 71,19% для животных с ХЭПР (рисунок 42).
При использовании состава ПМФИ-92 на 7 сутки эксперимента отмечено увеличение концентрации eNOS в 1,35 (ТЭПР) и в 1,31 (ХЭПР), а на 14 сутки в 2,33 (ТЭПР) и в 3,58 (ХЭПР) по сравнению с животными НК (рисунок 42).
Использование состава ПМФИ-91 у животных с термическим рубцом, в свою очередь, привело к увеличению концентрации eNOS по сравнению с группой животных без фармакологической поддержки в 1,71 раза на 7 сутки, а на 14 сутки – в 1,69 раза. При химическом ожоге применение ПМФИ-91, напротив, оказало наименьшее влияние на уровень eNOS – концентрация изофермента на 7 сутки увеличилась лишь в 1,15 раза, а на 14 сутки – в 1,08 раза по сравнению с крысами НК (рисунок 42).
У Л/О животных концентрация nNOS, в свою очередь, составила 17,71±2,329 нг/мл (Приложение В, таблица В.2). У животных с моделями патологий зафиксировано увеличение концентрации nNOS: при химическом ожоге – в 1,79 и в 1,52 раза на 7 и 14 сутки, соответственно, а при термическом ожоге – в 1,03 и 1,32 раза, что, вероятно, можно объяснить компенсаторным механизмом при снижении активности eNOS.
Было установлено, что препараты сравнения «Контрактубекс» и «Метилурацил» не привели к достоверному изменению экспрессии нейрональной NOS, в то время как гель «Эгаллохит» при использовании на модели термического ожога привел к увеличению концентрации фермента в 1,67 раза (7 сутки) и в 1,2 раза (14 сутки) по сравнению с животными НК (рисунок 43).
У животных с термическим ожогом, получавших состав ПМФИ-93, отмечено небольшое увеличение nNOS по сравнению с крысами НК. Так, на 7 сутки эксперимента концентрация изофермента превосходила аналогичный показатель в группе НК в 1,44 раза, и на 14 сутки – в 1,5 раза. На модели химического ожога были получены аналогичные результаты: содержание изофермента превосходило таковое в группе животных с ХЭПР в 1,14 раза (7 сутки) и в 1,46 раза (14 сутки). При использовании ПМФИ-92 концентрация фермента была выше в 1,2 и 1,53 раза на 7 и 14 сутки эксперимента, чем у животных с моделью ТЭПР. Аналогичная тенденция наблюдалась и при химическом ожоге: отмечено увеличение содержания nNOS в 1,02 (7 сутки) и в 1,62 раза (14 сутки). При использовании состава ПМФИ-91 не было отмечено достоверных изменений активности nNOS относительно НК (рисунок 43).
Данные, полученные при анализе iNOS, представлены в таблице В.3 Приложения В. Так, концентрация фермента у группы Л/О животных составила 14,16±0,448 нг/мл. В результате воспроизведенной патологии на 7 сутки отмечено достоверное увеличение концентрации iNOS в 2,14 (ТЭПР) и в 2,09 (ХЭПР) раза, которое также сохранилось и на 14 сутки – уровень фермента был выше в 2,25 (ТЭПР) и в 2,14 (ХЭПР) раза по сравнению с Л/О животными (рисунок 44).
Наибольшее позитивное влияние на уровень изофермента оказало использование препарата «Контрактубекс». Так, у животных с термическим ожогом отмечено снижение концентрации iNOS по сравнению с животными НК на 42,87% (7 сутки) и 34,71% (14 сутки); а на модели химического ожога изменения носили менее выраженный характер – на 31,39% (7 сутки) и на 27,25% (14 сутки). Препараты сравнения «Метилурацил» и «Эгаллохит» не привели к достоверным отличиям количественного содержания iNOS от данного показателя в группе крыс НК (рисунок 44).
При использовании состава ПМФИ-91 на 7 и 14 сутки не было зафиксировано достоверных изменений концентрации iNOS. В то же время, ПМФИ-93 и ПМФИ-92 оказали достоверно не отличающееся друг от друга влияние на концентрацию фермента. Так, на 7 сутки применения ПМФИ-93 у животных с термическим ожогом концентрация iNOS была на 21,06% ниже, чем в группе НК, а на 14 сутки – на 21,4% (рисунок 44). Аналогичная тенденция к снижению активности фермента была отмечена и при химическом ожоге – показатель снизился на 22,3% и 18,34% на 7 и 14 сутки соответственно (рисунок 44). При использовании состава ПМФИ-92 были получены следующие результаты: на 7 сутки терапии концентрация iNOS снизилась на 27,69% (ТЭПР) и 22,26% (ХЭПР) по сравнению с животными без фармакологической поддержки, а спустя 2 недели использования состава – на 19,24% и 20,72% (рисунок 44).