Введение к работе
Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания (в том числе атеросклероз и его осложнения) являются основной причиной смертности и инвалидизации людей в развитых странах. По этим причинам любая новая информация о механизмах развития атеросклероза, а также разработка новых, более эффективных методов его лечения имеют огромное социальное значение. Несмотря на многочисленные исследования, проблема эффективной коррекции органных нарушений при ишемической болезни сердца далека от своего решения. Одной из возможных причин этого положения является традиционность подходов к разработке средств и способов лечения и профилактики атеросклероза как наиболее важной причины ИБС.
По современным представлениям, нарушение функции эндотелия является первым шагом в процессе атерогенеза, часто предшествующим появлению структурных изменений сосудистой стенки. Понятие эндотелиальной дисфункции (ЭД) включает наличие дисбаланса между релаксацией и констрикцией, между анти- и протромбогенезом, антипролиферацией и пролиферацией. Эндотелиальная дисфункция сопровождается снижением секреции оксида азота (NO), обладающего выраженными противовоспалительными, вазодилатирующими и антисклеротическими свойствами. NO, важнейший эндогенный вазодилататор, играет ключевую роль в эндотелиальной регуляции сосудистого тонуса. Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка NO с помощью эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) из L-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов (Марков Х.М., 2001). В то же время NO обладает ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов и моноцитов (Бабак О.Я., 2004) и, предотвращая тем самым патологическую перестройку сосудистой стенки (ремоделирование), прогрессирование атеросклероза, кроме того, он опосредует сосудорасширяющие эффекты эндотелийзависимых вазодилататоров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина и др.), тормозит образование эндотелиального сосудосуживающего фактора эндотелина-1 и высвобождение норадреналина окончаниями симпатических нейронов, препятствует осуществлению чрезмерных эффектов других вазоконстрикторов (ангиотензина, тромбоксана А2), обладает противовоспалительным и антитромбогенным эффектами, оказывает антиоксидантное действие (Марков Х.М., 2005, Forstermann U.T., 2006).
Недостаточная продукция NO в сосудистом русле является ранним признаком ЭД. С одной стороны, это связано со снижением биодоступности NO, с другой - со сниженной активностью eNOS, в результате присутствия эндогенных или экзогенных ингибиторов её функционирования или снижения доступности его субстрата, L-аргинина. В основе снижения биодоступности NO лежат изменения продукции синтезируемых сосудистыми эндотелиальными клетками биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение имеют свободные радикалы кислорода, которые, соединяясь с NO, образуют избыточное количество такой реактивной формы кислорода (РФК), как пероксинитрит (ONOO-) (Pacher P., 2007). Пероксинитрит, являясь высокотоксичным соединением, повреждает мембраны и ДНК клетки, вызывает мутации и перекисное окисление липидов низкой плотности (Annuk M., 2001). При этом возникает оксидантный стресс, активирующий большое количество оксидантчувствительных факторов транскрипции (таких как нуклеарный фактор каппа-В (NF-В), которые повышают экспрессию адгезивных молекул эндотелия (ICAM-1, VCAM-1), а также различного рода факторов роста и хемокинов, способствующих развитию воспалительных процессов, протекающих при атеросклерозе (Griendling K.K., 2003; Taniyama Y., 2003), что приводит к дисбалансу медиаторов, обеспечивающих в норме эндотелийзависимые процессы (Марков Х.М., 2005; Heitzer T., 2001; Deanfield J., 2005).
Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения эндотелиальной дисфункции как предшественника атеросклероза являются важными клинико-экспериментальными задачами.
Несмотря на то что факторы риска атеросклероза на сегодняшний день хорошо известны (Харченко В.И., 2005), даже совокупность всех перечисленных факторов не объясняет более половины клинических случаев атеросклероза. Поэтому сегодня к списку факторов риска все с большей уверенностью причисляют и инфекционные болезни. Работами последних лет показана роль инфекционного и воспалительного фактора в развитии и волнообразном течении атеросклероза (цитомегаловирусы, Helicobacter pylori, Chlamydia Pneumoniaе) (Dunne M.; 2004, Stacey L.K., 2004; Goldschmidt-Clermont P.J., 2005; Mussa F.F., 2006), а также эффективность макролидов в отношении снижении риска сердечно- сосудистой патологии (Gurfinkel E., 1999; Pechere J.C., 2001; Gupta S., 2003; Melissano G., 2004).
Высказывается предположение о первичности антибактериального компонента в реализации кардио- и эндотелиопротективных эффектов макролидных антибиотиков (Rothstein N.M., 2001; Blessing E., 2002; Kutlin A., 2002). В то же время, представляется вероятной и альтернативная точка зрения на механизм защитного действия макролидов при повреждении эндотелия и миокарда, основанная на известных противовоспалительных и антиоксидантных свойствах этих препаратов (John P. et al. 2003; Andraws R. et al. 2005). Согласно литературным данным, противовоспалительное и антиоксидантное действие макролидов обнаруживается в диапазоне доз от 10 до 30 мг/кг и эти дозы макролидов проявляют эндотелио- и кардиотропные эффекты (Страчунский Л.С., 1998; Fong I.W., 1999; Ianaro A., 2000). При этом важное значение может иметь и направленный транспорт макролидов к очагу воспаления посредством лейкоцитов, концентрация в которых существенно выше, чем в плазме и миокарде (Parnham M.J., 2005), а также способность модулировать активность самих лейкоцитов (Карпов О.И., 2005).
Многочисленные экспериментальные исследования показали, что макролиды наряду с иммуномодулирующей, антиоксидантной, антиагрегационной и противовоспалительной активностью, обладают также и эндотелиотропной активностью в опытах in vitro. Эндотелиотропная активность макролидов обусловлена усилением высвобождения NO, предупреждением деградации NO, активацией фермента еNOS, ингибированием продукции вазоконстриктора эндотелина 1 (Mitsuyama T., 1998; Berman M., 2005; Sharma М., 2007).
В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение кардиопротективного и эндотелиопротективного действия макролидных антибиотиков при различном экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции и коронароокклюзионном инфаркте миокарда.
Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007-2012 гг. Номер государственной регистрации диссертационной темы 01.2. 007 05249.
Цель исследования: сравнительное изучение кардиопротективного и эндотелиопротективного действия в ряде макролидных антибиотиков.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать методологию оценки кардио- и эндотелиопротективного действия в ряду макролидных антибиотиков, определить наиболее информативные показатели и направления разработки экспериментальных моделей развития эндотелиальной дисфункции.
2. Произвести качественную и количественную оценку развития L-NAME-индуцированной, реактивной поствакцинально-васкулитной (РПВВ-индуцированной) и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции по совокупности функциональных, биохимических и морфологических маркеров дисфункции нарушения функции эндотелия.
3. Исследовать кардиопротективную активность в ряде макролидных антибиотиков при моделировании острого коронароокклюзионного инфаркта.
4. Изучить эндотелиопротективную активность азитромицина, рокситромицина, кларитромицина, джозамицина и мидекамицина при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.
5. По результатам исследования кардио- и эндотелиопротективных свойств макролидных антибиотиков провести анализ структура - действие и выбрать для дальнейшего исследования наиболее активный препарат.
6. Исследовать эндотелиопротективную активность азитромицина при моделировании РПВВ-индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.
7. Исследовать эндотелиопротективную активность азитромицина при моделировании сепсис–индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.
8. Предложить рабочую гипотезу и обосновать возможные патогенетические «мишени» для объяснения механизма кардио- и эндотелиопротективного действия макролидных антибиотиков.
Научная новизна исследования. В работе сформировано новое направление в доклинической оценке эндотелиотропной активности фармакологических препаратов с использованием коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведением функциональных проб, определением биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
Разработаны новые модели эндотелиальной дисфункции воспалительного генеза: реактивной поствакцинально-васкулитной и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
В работе впервые предложен способ фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции в эксперименте с использованием 14-, 15-, и 16-членных макролидных антибиотиков. Используя впервые объединённый комплекс методических подходов, выявлено, L-NAME-индуцированная, реактивная поствакцинально-васкулитная и сепсис-индуцированная эндотелиальная дисфункции характеризуются изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 5, 3,5 и 2 раза соответственно, резким нарушением продукции NO, отрицательной динамикой морфометрических показателей сердечно-сосудистой системы.
Впервые в сравнительном аспекте исследовано кардиопротективное действие макролидных антибиотиков в «малой» дозе – 10 мг/кг и «большой» дозе – 30 мг/кг при моделировании острого коронароокклюзионного инфаркта у крыс.
Впервые в сравнительном аспекте исследовано эндотелиопротективное действие макролидных антибиотиков в «малой» дозе – 10 мг/кг и «большой» дозе – 30 мг/кг при моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс.
Впервые исследовано эндотелиопротективное действие антибиотика азитромицина на модели реактивной поствакцинально-васкулитной эндотелиальной дисфункции у кроликов.
Впервые исследовано эндотелиопротективное действие антибиотика азитромицина на модели сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс.
Научная новизна подтверждается получением 8 патентов РФ.
Практическая значимость.
1. Предложено теоретическое и экспериментальное обоснование возможности исследования макролидных антибиотиков как прототипа для создания бионаномашин на основе клеток, обеспечивающих клеточный иммунитет (макрофаги и лейкоциты), в качестве элементов направленного транспорта макролидов к участкам повреждённого эндотелия с целью реализации модулирующего влияния макролидов на активность эндотелиальной и индуцибельной NOсинтазы, локального антиоксидантного статуса и выработки провоспалительных цитокинов.
2. Исследована зависимость структура–действие и доза–эффект в ряде макролидных антибиотиков, что может служить теоретической предпосылкой для дальнейшего синтеза соединений с плейотропными противовоспалительными, иммуномодулирующими, антиагрегантными и эндотелиопротективными свойствами.
3. Сделан вклад в формирование системы доказательств неантибактериального (плейотропного) действия макролидных антибиотиков и других соединений, обладающих способностью модулировать выброс провоспалительных цитокинов, в объяснении данных эпидемиологических исследований о профилактическом эффекте макролидов в отношении волнообразного течения заболеваний с атеросклеротическим поражением сосудов различной локализации.
Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования включены в регистрационное досье, направленное в Фармакологический Комитет МЗ РФ и ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздрава» для регистрации препарата «Азитрокс» 250 мг производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», получено регистрационное удостоверение № 001157/01 от 29.12.06, и препарата «Азитрокс» 500 мг производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», получено регистрационное удостоверение ЛСР-004203/08 от 30.05.08 г. Препараты промышленно выпускаются.
Материалы диссертационного исследования используются в экспериментально-фармакологических лабораториях Курского медицинского университета, Воронежской и Кубанской медицинских академиях.
Результаты исследований внедрены и используются в практике работы НИИ ЭМ КГМУ и в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии Белгородского государственного университета.
Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых КГМУ в 2002-2010гг.; VI Международной конференции «Биоантиоксидант»; VIII, XIV Национальных конгрессах «Человек и лекарство»; I, II Национальных конгрессах терапевтов; VII съезде аллерголов и иммунологов СНГ; VI Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств»; II Российской научно-практической конференции; Российском национальном конгрессе кардиологов «От исследований к клинической практике»; Международной научной конференции по фармакологии «Fundamental pharmacology and pharmacy – clinical practice»; XIV Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, инфекционных болезней, анатомии человека, ЛОР-болезней, микробиологии, вирусологии, иммунологии, биохимии и НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета. По материалам диссертации опубликовано 37 печатных работ, в том числе 12 работ в журналах, рекомендуемых ВАК.
Положения, выносимые на защиту
1. Впервые разработанные методики реактивной поствакцинально-васкулитной и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции в сочетании с моделью L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, характеризующиеся изменением соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением КЭД, нарушением продукции NO, повышением биохимического маркера воспаления ФНО, а также отрицательной динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы, являются адекватными и информативными моделями и полностью охватывают все возможные механизмы эндотелиальной дисфункции.
2. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты исследованных макролидных антибиотиков на моделях коронароокклюзионного инфаркта миокарда, L-NAME-индуцированной, реактивной поствакцинально-васкулитной и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического и клинического изучения данных препаратов в качестве потенциальных эндотелиопротекторов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 710 источников, из них 98 отечественных и 612 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 322 страницах машинописного текста, содержит таблиц – 23, рисунков – 58, схем – 7.