Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
Клинико-экспериментальная фармакокинетика пептидных препаратов 13
1.1 Биологические факторы, влияющие на фармакокинетику пероральных
пептидных препаратов 13
1.1.1 Энзиматический барьер 14
1.1.2 «Эффлюкс»-транспортные системы
1.1.2.1 P-гликопротеин 18
1.1.2.2 Белок множественной лекарственной устойчивости 19
1.1.2.3 Пептидная транспортная система-6 20
1.1.3 Системы прямого транспорта пептидов 20
1.1.3.1 PepT1 и PepT2 21
1.1.4 Кишечный метаболизм пептидов и пептидомиметиков 23
1.2 Межвидовые различия в фармакокинетике лекарственных препаратов 24
1.2.1 Особенности всасывания лекарственных веществ у животных и человека...26
1.2.2 Особенности распределения лекарственных веществ у животных и человека 28
1.2.3 Особенности метаболизма (биотрансформации) лекарственных веществ у животных и человека 32
1.2.4 Особенности экскреции фармакологических препаратов у животных и человека 38
1.2.5 Выбор оптимальной фармакокинетической модели для межвидового переноса фармакокинетических параметров с животных на человека 40
1.3 Преимущества препаратов на основе коротких пептидов 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1 Материалы 44
2.1.1 Объекты исследования 44
2.1.2 Химические реактивы 45
2.1.3 Средства измерений 45
2.1.4 Вспомогательные устройства 46
2.1.5 Приготовление растворов и буферов 46
2.2 Экспериментальные животные 47
2.2.1 Крысы 47
2.2.2 Кролики
2.3 Отбор здоровых добровольцев 48
2.4 Методы 50
2.4.1 Способы отбора образцов плазмы крови 50
2.4.1.1 Способы отбора образцов плазмы крови у кроликов 50
2.4.1.2 Способы отбора образцов плазмы крови у добровольцев 50
2.4.2 Экстракция дилепта и его предполагаемых метаболитов из плазмы крови...51
2.4.2.1 Экстракция дилепта и его предполагаемых метаболитов из плазмы крови кроликов 51
2.4.2.2 Экстракция дилепта и его предполагаемых метаболитов из плазмы крови добровольцев 52
2.5 Количественное определение дилепта и его возможных метаболитов 52
2.5.1 Количественное определение дилепта и его предполагаемых метаболитов в плазме крови кроликов 52
2.5.1.1 Параметры УБЖХ-МС анализа дилепта и его предполагаемых метаболитов в плазме крови кроликов 52
2.5.1.1.1 Определение градуировочных зависимостей 54
2.5.1.1.2 Процент извлечения дилепта, М-1 и М-2 из плазмы крови 59
2.5.2 Количественное определение дилепта и его предполагаемых метаболитов в плазме крови добровольцев 59
2.5.2.1 Параметры ВЭЖХ-МС анализа дилепта и его предполагаемых метаболитов в плазме крови добровольцев 59
2.5.2.1.1 Определение градуировочных зависимостей 60
2.5.2.1.2 Процент извлечения дилепта из плазмы крови добровольцев 69
2.6 Расчет основных фармакокинетических параметров дилепта и его метаболитов 70
2.7 Статистическая обработка полученных результатов 71
Глава 3. Результаты исследования 72
3.1 Доклиническая фармакокинетика дилепта и его метаболитов 72
3.1.1 Фармакокинетика дилепта и его метаболитов у крыс 72
3.1.2 Фармакокинетика дилепта и его метаболитов у кроликов 75
3.1.3 Сравнительная фармакокинетика и относительная биодоступность таблеток и субстанции дилепта
3.2 Клиническая фармакокинетика дилепта и его метаболитов 82
3.3 Особенности биотрансформации и фармакокинетики дилепта у животных и человека 89
3.4 Межвидовая экстраполяции фармакокинетических параметров дилепта 97
Общее заключение 106
Выводы 108
Практические рекомендации 109
Список сокращений
- Белок множественной лекарственной устойчивости
- Средства измерений
- Количественное определение дилепта и его предполагаемых метаболитов в плазме крови кроликов
- Межвидовая экстраполяции фармакокинетических параметров дилепта
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Создание новых, высокоэффективных лекарственных препаратов с антипсихотическими свойствами, обладающими низкой токсичностью и лишенных побочных эффектов, присущих как антипсихотикам 1-го поколения, так и атипичным нейролептикам, остается актуальной проблемой. К побочным эффектам нейролептиков относятся экстрапирамидные расстройства (паркинсонизм, акатизия, дистонические реакции и др.), гематологические осложнения (агранулоцитоз), гемодинамические нарушения, синдром отмены и нейролептический дефицитарный синдром (Rummel-Kluge C., et al. Schizophrenia Bulletin. 2012. 38. 1. P. 167-177). Эти эффекты усугубляют состояние пациентов, что требует назначения дополнительных лекарственных препаратов, корректирующих их (Hasan A., et al. The World Journal of Biological Psychiatry. 2013. 14. 1. P. 2-44).
В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» разработан оригинальный препарат с антипсихотическими свойствами – метиловый эфир N-капроил-L-пролил-L-тирозина, получивший название дилепт. Он является модифицированным дипептидом, имитирующим структуру атипичного нейролептика сульпирида и «голову» бета-поворотной структуры нейротензина (НТ8-13). Предпосылкой к созданию препарата явились данные о наличии у эндогенного нейропептида – нейротензина – антипсихотической активности (Гудашева Т.А. Вестник Российской АМН. 2011. 7. С. 8-16; Островская Р.У. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2005. 68. 1. С. 3-6).
Важнейшим этапом разработки любого инновационного лекарственного средства (ЛС) является изучение его экспериментальной и клинической фармакокинетики. Данные исследования позволяют установить, в каком количестве от введенной дозы препарат всасывается из места введения и поступает в системный кровоток (абсолютная биодоступность, БД) и, соответственно, к месту его биологического действия. После введения внутрь препарата необходимо узнать, какая доля ЛС подвергается биотрансформации, а какая попадает в системный кровоток в интактном виде. Более того, требуется изучить основные пути метаболизма исследуемого соединения с идентификацией и дальнейшим определением фармакологической активности метаболитов (Фирсов, А.А. и др. Методические рекомендации по проведению доклинических исследований фармакокинетики новых лекарственных средств. В кн. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под общ. ред. А. Н. Миронова. Часть 1, М.: «Гриф и К». 2013. 944 с.).
Выявление общих закономерностей и различий в фармакокинетике фармакологически активных веществ у экспериментальных животных разных видов позволяет наиболее точно провести межвидовой перенос фармакокинетических данных на человека. Доклиническое изучение фармакокинетики новых оригинальных лекарственных веществ (ЛВ) необходимо, в первую очередь, для установления зависимости «концентрация-эффект». Эта зависимость характеризуется меньшими видовыми
различиями, чем «доза-эффект», и благодаря этому может использоваться для прогнозирования действия ЛВ у человека, а также при выборе дозы ЛС для клинических исследований и для оценки безопасности внедряемых новых ЛВ для человека.
В то же время при разработке нового ЛС невозможно обойтись без клинических исследований, поскольку экстраполяция результатов исследований с животных на человека возможна только в общем виде.
В связи с вышесказанным актуальным является изучение фармакокинетики нового дипептидного антипсихотика дилепта у животных разных видов и человека.
Степень разработанности проблемы. В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» создан пептидомиметик бета-поворотной структуры активного участка нейротензина (НТ8-13) – дилепт. Создание препарата обусловлено тем, что к настоящему времени установлена важная роль нейротензина в патогенезе шизофрении. Однако сам нейротензин имеет низкую энзиматическую устойчивость и проявляет нейротропную активность только при непосредственном введении в мозг. Дилепт же после перорального введения крысам в дозах 4,0-8,0 мг/кг проявил нейролептическую активность (Ретюнская М.В. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. 136. 11. С. 527-531). Для дальнейшего внедрения в медицинскую практику потенциального антипсихотика нового поколения, проведено фармакокинетическое изучение на животных. Экспериментальная фармакокинетика дилепта изучена на крысах после перорального введения в дозах 40 мг/кг и 200 мг/кг. Через 15 мин после введения дилепта в плазме крови крыс выявлены два его продукта превращения. Эти метаболиты масс-спектрометрически идентифицированы, как деметилированное производное N-капроил-L-пролил-L-тирозин (М-1) и N-капроил-L-пролин (М-2). В дальнейшем структуры дилепта и его метаболитов были подтверждены встречным химическим синтезом. В связи с тем, что дилепт по своей структуре близок к эндогенным соединениям, изучена также его способность к биотрансформации в модельных опытах после добавления препарата в плазму крови крыс и человека в зависимости от продолжительности инкубации. Обнаружено, что у крыс дилепт очень быстро превращается в М-1 (Жердев В.П. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2009. 72. 3. С. 16-21).
Изучение фармакокинетики дилепта у кроликов и добровольцев ранее не проводилось.
В связи с этим важной и актуальной задачей является использование результатов фармакокинетического изучения дилепта у кроликов и крыс для прогностической оценки фармакокинетических параметров дилепта и его метаболитов у человека.
Цель исследования. Клинико-экспериментальное изучение фармакокинетики нового оригинального дипептидного антипсихотика дилепта и его метаболитов, выявление общих закономерностей и различий в фармакокинетике у экспериментальных животных и человека.
Задачи исследования. Для достижения цели настоящего исследования были поставлены следующие задачи:
-
Воспроизвести и валидировать методику количественного определения дилепта и его метаболитов (М-1 и М-2) в плазме крови кроликов и добровольцев с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием.
-
На кроликах провести сравнительное фармакокинетическое исследование таблеток и субстанции дилепта в дозе 40 мг. Определить относительную биодоступность лекарственной формы.
-
Провести изучение клинической фармакокинетики таблеток дилепта 20 мг на добровольцах после однократного применения возрастающих доз (20, 40 и 60 мг).
-
Выполнить математическую статистическую обработку полученных данных с последующим расчетом фармакокинетических параметров дилепта и его метаболитов.
-
Провести сравнительный анализ результатов изучения клинической фармакокинетики с экспериментальными данными.
-
Провести соответствующие расчеты для последующего межвидового переноса фармакокинетических данных, полученных у кроликов и крыс на человека.
Научная новизна исследования. Впервые изучены межвидовые различия фармакокинетики нового антипсихотического ЛС дилепта в организме экспериментальных животных: крыс и кроликов, а также у добровольцев. Выявлены следующие особенности:
-
После перорального введения/приема дилепт в неизмененном виде определяется как у животных, так и человека в незначительных количествах. При этом у кроликов исходное ЛС регистрируется в плазме крови более продолжительное время по сравнению с крысами и человеком.
-
Установлено, что в организме животных и человека нейролептик подвергается окислительным реакциям с образованием деметилированного производного М-1 и метаболита М-2 с отщеплением L-тирозина.
-
Степень превращения дилепта в основные метаболиты оказалась максимальной у крыс и минимальной у кроликов. Таким образом, интенсивность биотрансформации нового оригинального нейролептика уменьшается в ряду крыса>человек>кролик.
Изучение клинико-экспериментальной фармакокинетики дилепта показало свою прогностическую ценность и актуальность доклинического изучения фармакокинетики, как минимум, на двух видах экспериментальных животных.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявление общих закономерностей и различий в фармакокинетике дилепта у экспериментальных животных различной видовой принадлежности позволяет провести более точную прогностическую оценку фармакокинетики ЛС у человека, основанную на межвидовом переносе фармакокинетических данных вновь создаваемых фармакологических препаратов (коротких пептидов) на этапе изучения их фармакокинетики на экспериментальных животных. Полученные результаты позволяют более корректно обосновывать выбор доз лекарственных препаратов пептидной природы для проведения клинических
исследований, что потенциально может снизить частоту нежелательных лекарственных реакций, тем самым повысить эффективность исследуемых препаратов.
Методология и методы исследования. Методология исследования заключалась в анализе фармакокинетических данных, полученных в ходе изучения сравнительной фармакокинетики дилепта на кроликах после однократного введения таблеток и субстанции дилепта и клинического изучения дилепта на добровольцах с последующим сравнении с результатами экспериментального изучения дилепта на крысах после введения внутрь ЛС в дозе 200 мг/кг, проведенного ранее. Результаты анализа фармакокинетических данных стали основой для выявления общих закономерностей и различий в фармакокинетике дилепта и его метаболитов у крыс и кроликов и последующего межвидового переноса фармакокинетических данных на человека.
В настоящей работе использовались следующие методы: аналитический – ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием, фармакокинетический – модельно-независимый и методы математической статистики.
Для прогностической оценки фармакокинетических параметров дилепта и его метаболитов у человека по результатам фармакокинетического изучения дилепта у кроликов и крыс был использован аллометрический подход. Показано, что период полувыведения дилепта у человека в большей степени соответствует параметру, рассчитанному для крыс.
Основные положения, выносимые на защиту.
1.Дилепт в организме животных и человека активно метаболизируется с образованием деметилированного метаболита М-1 и метаболита М-2 с отщеплением L-тирозина.
2. На кроликах проведено сравнительное фармакокинетическое исследование
субстанции и таблеток дилепта. Установлена линейность фармакокинетики ЛС в
диапазоне доз 20-60 мг. Относительная биодоступность таблетированной лекарственной
формы составила 93,46±28,91%. Данная лекарственная форма рекомендована для
проведения I фазы клинических исследований.
3. На добровольцах изучена клиническая фармакокинетика таблеток дилепта 20 мг
после однократного применения 3-х доз (20, 40 и 60 мг). Из-за интенсивного процесса
метаболизма исходное соединение определяется в плазме крови добровольцев в
нанограммовом диапазоне.
4. Дилепт в плазме крови кроликов определялся в 4-6 раз дольше, чем у
добровольцев и крыс. Интенсивность метаболизма неизмененного соединения у
животных и человека различна: уменьшается в ряду крыса > человек > кролик.
5. На основе аллометрического подхода выполнен межвидовой перенос
фармакокинетических параметров, полученных у кроликов и крыс на человека. Период
полувыведения дилепта у человека в большей степени соответствует параметру,
рассчитанному на основе данных, полученных у крыс.
Степень достоверности. Работа выполнена на большом экспериментальном и
клиническом материале с использованием адекватных методов исследования; статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием современных методов математической статистики и анализа полученных данных. Расчеты выполнены в соответствии с требованиями, изложенными в главе 57 «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К., 2013. 944 с.» и в Национальном стандарте РФ ГОСТ Р52379-2005 «Надлежащая клиническая практика».
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); в материалах IV всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств»; в Евразийском конгрессе «Медицина, фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2013); IX Международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: Вопросы медицины» (Москва, 2013); I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013); Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Достижения современной фармакологической науки» (Рязань, 2015), VI Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Клязьма, 2015); конференции лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (Москва, 2016 г.).
Личный вклад автора. Автором самостоятельно воспроизведена и валидирована методика количественного определения дилепта и его метаболитов в биоматериале, проведены исследования по изучению фармакокинетики дилепта и его метаболитов у кроликов и добровольцев, обработаны результаты, сформулированы выводы. При непосредственном участии автора по результатам работы подготовлены публикации.
Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения.
Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательской работы ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» Рег. № 01201169192.
Сведения о публикациях по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи (в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ), а также 2 статьи и 6 тезисов в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, общего заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 27 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 139 источника, из них 37 отечественных.
Белок множественной лекарственной устойчивости
Известно, что более 60% всех ЛС, используемых в современной медицине, назначаются перорально, благодаря простоте и удобству приема (не требует наличия квалифицированного медицинского персонала), относительной безопасности и естественности. Для перорального введения используются различные лекарственные формы: таблетки, порошки, капсулы, растворы и др. Возможность перорального использования пептидных препаратов, с одной стороны, перспективно, благодаря уникальной способности к всасыванию в кишечнике: наличию специфических переносчик-опосредованных транспортных систем, с другой – ограничено высокой активностью пищеварительных ферментов ЖКТ и его мембранных пептидаз щеточной каемки, иными словами, наличием мощного биологического энзиматического барьера для всасывания [71].
Понимание биологических факторов, влияющих на фармакокинетику пероральных пептидных препаратов является ключом к созданию высокоэффективных фармакологических препаратов. Особый интерес представляют биологические факторы, влияющие на фармакокинетику пептидных ЛС и их производных. Так как пептиды в большинстве случаев являются гидрофильными соединениями, пассивная диффузия таких молекул через водные поры сильно затруднена из-за большего диаметра молекул пептидных соединений, превышающих 0,4 нм. При пероральном поступлении всасывание коротких пептидов и аминокислот происходит преимущественно в тонкой кишке, благодаря транспортным системам клеточных мембран и большой площади поверхности всасывания (200-300 м2), образованной циркулярными складками и кишечными ворсинками [3]. Здесь важным является определение механизмов активного транспорта и условий для избирательного поступления через мембраны энтероцитов гидрофильных полярных молекул ЛВ в системный кровоток, а так же факторов, способствующих пресистемной элиминации, например наличие и выраженность эффекта «первого прохождения» [92, 93].
Слизистая оболочка ЖКТ является мощным биологическим барьером, образуя энзиматический барьер – главное препятствие для всасывания в системный кровоток ксенобиотиков и лекарственных препаратов. Энзиматический барьер ЖКТ представлен ферментными системами, осуществляющими защитную функцию от поступления ксенобиотиков, особенно пептидной природы, во внутреннюю среду организма. Его составляет ряд пространственно разделенных барьеров, образованных ферментами полости тонкой кишки, пристеночной слизи, гликокаликса, а также энтероцитов (мембранные, внутриклеточные и лизосомальные экзо- и эндопептидазы) [133]. Хорошо изученными ферментами, ответственными за расщепление белков и пептидов, являются пептидазы, секретируемые, главным образом, поджелудочной железой в просвет тонкой кишки. Их называют протеолитическими пищеварительными ферментами. Наряду с протеолитическими пищеварительными ферментами большую роль в снижении биодоступности играет группа пептидаз щеточной каемки, которая также серьезно ограничивает пероральное использование пептидных препаратов на основе олиго- и полипептидов. Интересно, что сравнение ферментативной активности пептидаз, секретируемых в полость тонкой кишки с активностью мембранных энзимов показало, что общая пептидазная активность в просвете тонкой кишки крыс в 16 раз выше, чем активность на мембране каемочных энтероцитов при использовании в качестве субстрата B-цепи инсулина, состоящего из 30 аминокислотных остатков [132]. Так же установлено, что цитозольные растворимые энзимы аминопептидаза P1 и аминопетидаза P2, связанная с мембраной, участвуют в инактивации вазоактивного пептида брадикинина [131]. Наиболее важные протеолитические ферменты человека, вовлеченные в расщепление пептидов, представлены в таблице 1.
Средства измерений
Для приготовления подвижных фаз, буферных растворов, экстрагентов использовали: ацетонитрил «для хроматографии» («Sigma-Aldrich», ФРГ), метиловый спирт «для хроматографии» («Merck», ФРГ), аммония ацетат («Acros Organics», США), уксусная кислота («Реахим», Россия), муравьиная кислота («Sigma-Aldrich», ФРГ), хлороформ ( «Реахим», Россия), гексан («Борис», Россия).
Жидкостной хроматограф с масс-селективным детектором «Agilent 1200 Series 6310 Ion Trap LC/MS» (США), оборудованный автосемплером и управляемый PC совместимым компьютером с системой обработки данных; жидкостной хроматограф «Shimadzu UFLC» (Япония) с масс-селективным детектором «Shimadzu LC-MS 8030» (Япония), оборудованный системой автоматического ввода пробы и управляемый компьютером с системой обработки данных;микрошприцы «Hamilton» вместимостью 10, 100 и 500 мкл; весы лабораторные (ГОСТ 24104-2001) аналитические «AR 2140» («Ohaus», США) с погрешностью взвешивания не более ±0,0001, весы лабораторные (ГОСТ 24104-2001) технические «BA310S» («Sartorius», ФРГ) с погрешностью взвешивания не более ± 0,01, калиброванные мерные колбы вместимостью 50; 100; 250 мл (ГОСТ 1770-74), цилиндры мерные объемом 50, 250, 1000 мл (ГОСТ 1770-74). 2.1.4 Вспомогательные устройства
Дозаторы переменного объема на 100,0; 200,0; 1000,0; и 5000,0 мкл («Eppendorf», ФРГ) со сменными одноразовыми пластиковыми наконечниками («Eppendorf», ФРГ); рН-метр «Seven Easy S20-К» («Mettleroledo», Швейцария); аппарат для встряхивания жидкости «K-550 GE» (Vortex, США); ультразвуковая баня «Elmasonic S 40H» («Elma», ФРГ); пробирки со шлифами на 5,0; 10,0; и 15,0 мл (ГОСТ 1770-74); бумага фильтровальная марки «ФБ» («Невалаб», Россия, ГОСТ 12026-76); индикаторные палочки для контроля рН в диапазоне 4,5-10,0 («Macherey-Nagel», ФРГ); установка для получения деионизованной воды «Milli-Q plus» (Millipore, Франция); упариватель в токе азота «Dri-Bath» («Thermolyne», США); центрифуга «2-16K» («Sigma», ФРГ).
В качестве подвижной фазы для проведения ультрабыстрой ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (УБЖХ-МС-МС) использовали смесь ацетонитрила и воды деионизованной в соотношении 300:200. Для проведения ВЭЖХ-МС-МС в качестве подвижной фазы В использовали 100% ацетонитрил. Подвижную фазу А для проведения анализа готовили следующим образом: в колбу вместимостью 1,0 л помещали 2,5 мл муравьиной кислоты концентрированной и 1 мл 200 мМ раствора аммония ацетата (готовили растворением точной навески в рассчитанном объеме воды деионизованной), затем объем колбы доводили до метки водой деионизованной. Контроль реакции среды раствора осуществляли pH-метром (рН 3,0).
Матричные растворы метилового эфира N-капроил-L-пролил-L-тирозина, N-капроил-L-пролил-L-тирозина готовили растворением точных навесок каждого из соединений (10 мг) в 100 мл метанола. Навеску N-капроил-L-пролина (10 мг) растворяли в 100 мл воды деионизованной. Рабочие растворы получали последовательным разбавлением матричных до необходимой концентрации.
5% раствор К3-ЭДТА готовили растворением навески 0,5 г в 10 мл дистилированной воды на ультразвуковой бане. 2.2 Экспериментальные животные 2.2.1 Крысы
Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 200±20 г (n=6), полученных из питомника «Столбовая» (Московская область). Животных содержали в стандартных условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при 12-ти часовом световом режиме.
Препарат вводили перорально крысам в дозе 200 мг/кг (в виде таблеточной массы). Образцы крови отбирали через дискретные временные интервалы: через 0; 0,08; 0,17; 0,25; 0,33; 0,50; 0,75; 1,0; 2,0; 4,0 ч.
Поскольку на каждую временную точку использовали по 6 животных, результирующие фармакокинетические кривые представлены в виде средней арифметической и соответствующего ей стандартного отклонения (x ± SD).
Расчет фармакокинетических параметров проводили по усредненным концентрациям дилепта и его метаболитов.1
Работа выполнена на 6 кроликах-самцах породы шиншилла (питомник «Столбовая», Московская область) массой 3,34±0,18 кг. Животные содержались в стандартных условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при 12-часовом световом режиме на стандартном сбалансированным брикетированном корме со свободным доступом к пище и воде при естественном освещении и температуре воздуха 20-21 оС. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с международными правилами (Директива 86/609/ЕЕС) и правилами работы с животными, утвержденными этической комиссией ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова». Содержание животных в виварии соответствовало Приказу МЗ РФ №708н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
1 Месонжник, Н. В. Экспериментальное изучение фармакокинетики и метаболизма нового фармакологического препарата дилепт: дисс. ... канд. мед. наук: 14.00.25 / Месонжник Наталья Владимировна. – М., 2009. – 145 с. За 12 часов до эксперимента животных лишали корма. В случайном порядке животным с помощью зонда внутрь вводили 2 таблетки дилепта (220=40 мг) или субстанции препарата (40 мг) в виде суспензии, приготовленной на 1% крахмальном клейстере. Спустя десять дней порядок введения исследуемых препаратов животным был обратным (таблица 4).
Количественное определение дилепта и его предполагаемых метаболитов в плазме крови кроликов
Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 200±20 г (n=6), полученных из питомника «Столбовая», Московская область (см. гл. 2 раздел. 2.2.1).
Препарат вводили перорально крысам в дозе 200 мг/кг (в виде таблеточной массы). Образцы крови отбирали через дискретные временные интервалы: через 0; 0,08; 0,17; 0,25; 0,33; 0,50; 0,75; 1,0; 2,0; 4,0 ч.
На 6 кроликах-самцах породы шиншилла (питомник «Столбовая», Московская область) массой 3,34±0,18 кг проведено открытое фармакокинетическое исследование (см. гл. 2 раздел. 2.2.2, 2.4.1.1).
Методом хромато-масс-спектрометрии установлено, что дилепт в организме крыс метаболизируется с образованием двух основных метаболитов. Главными путями биотрансформации дилепта являются деметилирование: с образованием N-капроил-L-пролил-L-тирозина (М-1) и отщепление L-тирозина с образованием N-капроил-L-пролина (М-2) [19].
На рисунке 4 представлены усредненные фармакокинетические профили дилепта и его метаболитов в плазме крови крыс после однократного перорального введения таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг, а в таблице 15 соответствующие им фармакокинетические параметры (расчеты выполнены на основе данных, полученных Месонжник Н.В. [23]). Дилепт быстро всасывается из ЖКТ крыс (величина Сmax/AUC0t, составила 2,503 ч-1).
Рисунок 4. Усредненные фармакокинетические профили дилепта и его метаболитов в плазме крови крыс после однократного перорального введения таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг (n=6; x ±SD). а) – дилепт, б) – М-1, в) – М-2.
Таблица 15. Фармакокинетические параметры дилепта и его метаболитов (М-1 и М-2) у крыс, после перорального введения таблеточной массы препарата в дозе 200 мг/кг AUC0t, нг/млч AUC0, нг/млч Tmax, ч Cmax,нг/мл kel,ч-1 t1/2 el, ч MRT, ч CL/F л/ч/кг Vd/F л/кг Сmax/AUC0t Дилепт 8,03 11,60 0,17 20,1 1,26 0,55 0,85 17,24 13,68 2,503 М-1 170,90 186,03 0,17 188,0 0,60 1,14 1,61 - - М-2 13209,30 24309,20 1,0 7046,2 0,24 2,87 4,80 - - После перорального введения крысам дилепт подвергается интенсивной биотрансформации, и уже в первые минуты в плазме крови крыс регистрируются его метаболиты М-1 и М-2. Неизмененное соединение определяется в плазме крови животных течение 60 мин, а его метаболиты в течение 4 ч. Снижение концентраций дилепта и его метаболитов носит двухфазный характер. Из рисунка 4 и таблицы 15 видно, что после введения крысам препарата максимальная концентрация (Cmax) пептида определялась через 0,17 ч (время достижения максимальной концентрации, Tmax), при этом величина Cmax составила 20,1 нг/мл. Период полувыведения (t1/2 el) дилепта равнялся 0,5 ч.
Большая величина общего клиренса (CL/F=17,24 л/ч/кг) указывает на значительный вклад в процесс очищения организма от дилепта за счет его биотрансформации. Подобный факт отмечен при изучении фармакокинетики дилепта у здоровых добровольцев [33].
Параметром, характеризующим степень проникновения лекарственного вещества в ткани, является кажущийся объем распределения (Vd/F). Его величина для дилепта после его перорального введения крысам в дозе 200 мг/кг составила 13,68 л/кг. Кажущийся объем распределения обычно неэквивалентен анатомическому объему, а отражает распределение препарата и степень его связывания в организме. Связывание препарата во внесосудистом пространстве приводит к превышению значения Vd/F над реальным. В нашем случае расчет величины Vd/F дал значительно большие результаты, указывающие, что дилепт распределяется во всех жидких средах организма животных и интенсивно проникает в ткани [61].
Время достижения максимальной концентрации метаболита М-1 в плазме крови крыс отмечали через 0,17 ч после введения дилепта, при этом величина его Cmax почти в 10 раз превышала таковую для неизмененного соединения. Период полувыведения М-1 в два раза превышал данный параметр для неизмененного соединения и составил 1,14 ч. Максимальная концентрация метаболита М-2 определялась через 1 ч после введения препарата. Величина Cmax составила 7,0 мкг/мл, что значительно больше величин, полученных для дилепта и М-1. t1/2 el М-2 составил около 3 ч. Таким образом, в плазме крови крыс концентрации М-2 значительно превышают концентрации неизмененного вещества и М-1 во всех исследуемых интервалах времени.
Межвидовая экстраполяции фармакокинетических параметров дилепта
Аллометрический, то есть нелинейный, метод межвидовой экстраполяции фармакокинетических данных широко используется в фармакологии уже более 50 лет [26].
Желательным условием применения этого метода является линейность фармакокинетики препарата в изучаемом диапазоне доз, а также подобие направления биотрансформации у человека и животных, которые используются в расчетах. Тем не менее, данное условие не является обязательным для успешного применения аллометрического подхода, когда направления метаболизма лекарственного вещества у животных и человека различаются, поскольку в литературе имеются примеры, подтверждающие этот тезис [26, 27]. Более подробно концепции межвидовых зависимостей фармакокинетических параметров лекарственных средств изложены в литературном обзоре диссертации в разделе 1.2.
В настоящем исследовании аллометрический подход был использован для прогностической оценки фармакокинетических параметров дилепта у человека по результатам фармакокинетического изучения дилепта у кроликов и крыс.
Материалы и методы Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 200±20 г (n=6), кроликах-самцах породы шиншилла массой 2,8-3,0 кг (n=6) (см. гл. 2 раздел. 2.2.1, 2.2.2, 2.4.1.1 ). Изучение фармакокинетики дилепта у добровольцев (73,4±7,5 кг, n=20) проведено в рамках I фазы клинических исследований по стандартизированному протоколу (см. гл. 2 раздел. 2.3, 2.4.1.2).
Концентрации дилепта и его метаболитов в образцах плазмы крови крыс и добровольцев определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, а вплазме крови кроликов – ультрабыстрой ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией [4].
Полученные данные подверглись математической статистической обработке. Определение фармакокинетических параметров проводили модельно-независимым методом. Расчет фармакокинетических параметров, полученных на крысах, проводили по усредненным фармакокинетическим профилям неизмененного препарата и его метаболитов. В таблицах, где приведены фармакокинетические параметры дилепта и его метаболитов у добровольцев и кроликов, представлены средние арифметические значения и, соответствующие им, стандартные отклонения.
Для проверки линейности фармакокинетики дилепта у кроликов его профили характеризовали рассчитанными методом трапеций значениями площади под фармакокинетической кривой (AUC0t) в пределах от нуля до момента времени отбора последней пробы крови, содержащей значимое количество лекарственного вещества, после введения наименьшей дозы дилепта.
Межвидовые соотношения для фармакокинетических параметров ЛВ формируются на основе концепции биологического подобия, согласно которой у мелких и крупных животных скорости протекания основных физиологических процессов одинаковы, если в качестве параметра «время» использовать не астрономическое (хронологическое), а «биологическое» или «физиологическое» время [26, 30].
Для отображения полученных данных на основе аллометрического подхода использовали метод Дедрика, где хронологические времена отбора проб крови животных пересчитывали в соответствующие «фармакокинетические времена» по уравнению: tpk = t/m0,25 (1), где tpk - «фармакокинетическое время», m – масса тела кролика или крысы, кг [62]. По профилям изменения концентраций дилепта в плазме крови кроликов в координатах Дедрика модельно-независимым методом рассчитывали период полуэлиминации препарата (t1/2 el), выраженного в «фармакокинетическом времени» (t1/2 el pk). Величину t1/2 el дилепта у человека (t1/2 el h) рассчитывали по уравнению: t1/2 el h = t1/2 el pk 73,40,25 (2), где 73,4 – средняя масса тела добровольца, кг. Результаты и их обсуждение
В таблицах 23-25 представлены концентрации дилепта в плазме крови кроликов после однократного перорального введения субстанции в дозах 20, 40 и 60 мг, в таблице 26 – фармакокинетические параметры дилепта, которые в дальнейшем использовали для оценки гипотезы линейности фармакокинетики дилепта в плазме крови экспериментальных животных.
Статистический анализ фармакокинетических данных может обойти неопределенность, связанную с дозозависимостью, в ситуации, когда исследуемое вещество находится в системном кровотоке. В самом деле, при повышении дозы препарата его кинетика может стать нелинейной (непропорциональное увеличение рассматриваемого параметра в зависимости от дозы). Общий метод оценки пропорциональности доз заключается в нормировании значений AUC0t или AUC0 к дозе и оценка постоянства отношений между исследуемыми дозами [70]. В некоторых случаях нелинейность может быть не очевидна вследствие вариабельности измеряемого показателя. Решить эту проблему может нелинейная степенная модель.