Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 14
1.1 Острое почечное повреждение – актуальная проблема современного здравоохранения 14
1.2 Оптимизация функции эндотелия – перспективное направление коррекции ишемических повреждений почек 21
1.3 Фармакологическое прекондиционирование – перспективное направление коррекции ишемических повреждений почек 24
2 Материалы и методы исследования 29
3 Результаты собственных исследований 36
3.1 Оценка морфофункциональных нарушений при моделировании билатерального острого почечного повреждения ишемически-реперфузионного генеза 36
3.2 Нефропротективные эффекты асиалированного эритропоэтина при экспериментальной ишемии почек 52
3.3 Нефропротективные эффекты селективного ингибитора аргиназы II при экспериментальной ишемии почек 64
3.4 Нефропротективные эффекты комбинации асиалированного эритропоэтина и селективного ингибитора аргиназы II при экспериментальной ишемии почек 72
3.5 Роль eNOS и K+АТФ каналов в реализации нефропротективных эффектов асиалированного эритропоэтина и селективного ингибитора аргиназы II при экспериментальной ишемии-реперфузии почек 79
Заключение 86
Выводы 98
Список литературы 101
- Острое почечное повреждение – актуальная проблема современного здравоохранения
- Фармакологическое прекондиционирование – перспективное направление коррекции ишемических повреждений почек
- Нефропротективные эффекты асиалированного эритропоэтина при экспериментальной ишемии почек
- Роль eNOS и K+АТФ каналов в реализации нефропротективных эффектов асиалированного эритропоэтина и селективного ингибитора аргиназы II при экспериментальной ишемии-реперфузии почек
Острое почечное повреждение – актуальная проблема современного здравоохранения
Острое почечное повреждение, ранее известное как острая почечная недостаточность, представляет собой острое снижение функции почек, что приводит к снижению азотовыделительной функции почек, нарушениям водно-электролитного обмена и кислотно-щелочного баланса.
Острое почечное повреждение является распространенным осложнением, которое поражает до одного из пяти госпитализированных пациентов [78, 126].
Острое почечное повреждение (ОПП) является широко распространенным жизнеугрожающим состоянием и остается серьезной проблемой здравоохранения с высоким уровнем смертности пациентов [50, 84]. С изменением взгляда на концепцию острого почечного повреждения, доказаны неблагоприятные последствия не только тяжелой недостаточности функции почек, но и небольших повышений уровня креатинина, ассоциировавшихся с более высоким уровнем летальности и ухудшением исходов при кардиохирургических операциях [94]. Распространенность ОПП варьируется в зависимости от стран, регионов и их экономики и составляет 22% от числа госпитализированных пациентов для стран Восточной Европы [126] с уровнем летальности 23,9% у взрослых и 13,8% у детей.
Отсроченные риски острого почечного повреждения включают хроническую болезнь почек (ХБП), терминальную стадию ХБП, требующую заместительной терапии и трансплантации [53], сердечно-сосудистые события [27] и ухудшение качества жизни [74]. Так, в одном из исследований после эпизода ОПП, требующего проведения заместительной почечной терапии, у одного из четырех пациентов отмечалось качество жизни, равное или меньшее, чем смерть [106]. Повышение смертности не является единственным неблагоприятным исходом ОПП. У пациентов, перенесших данное состояние, выявлено достоверное повышение относительного риска развития хронической болезни почек и терминальной почечной недостаточности [50, 53], формирования острого ренокардиального синдрома, заболеваемости и смертности от кардиоваскулярной патологии [92].
В сочетании с ростом заболеваемости ОПП стало одним из основных проблем общественного здравоохранения с высокими человеческими и финансовыми издержками. В Англии расходы на стационар, связанный с лечением пациентов с ОПП, составляют 1% от бюджета Национальной службы здравоохранения, а в Соединенных Штатах ассоциируются с увеличением расходов на госпитализацию в пределах от 5,4 до 24,0 млрд долларов США [112].
Таким образом, острое почечное повреждение является не только предиктором летального исхода у госпитализированных пациентов, но и существенным риском развития отсроченных событий, влияющих на продолжительность жизни пациента и её качество, что в совокупности приводит к повышению финансового и человеческого бремени данной нозологической единицы.
Ведущим патогенетическим звеном ОПП является ишемическая и реперфузионная травма почек [20, 128]. Ишемия-реперфузия является патологическим состоянием, характеризующимся начальным снижением кровоснабжения органа, за которым следует последующая перфузия с последующей повторной оксигенацией. В любом органе снижение кровотока ведет, с одной стороны, к уменьшению доставки кислорода и питательных веществ, а с другой стороны, к сокращению выведения продуктов метаболизма.
Почка – это высокоперфузируемый орган, имеющий повышенную чувствительность к ишемии и реперфузии, в связи с этим проблема острого почечного повреждения актуальна не только в нефрологии, но и в трансплантологии, кардиохирургии, анестезиологии, при использовании рентгенконтрастных лекарственных средств и развитии синдрома системного воспалительного ответа и других.
Рост количества пациентов, нуждающихся в трансплантации, и ограниченное количество трупных почек, создало благоприятные условия для развития трансплантации почек от живых доноров. Однако, несмотря на отсутствие продолжительной гипоперфузии во время остановки сердца, почки от живых доноров также подвергаются ишемическому повреждению, которое в дальнейшем усугубляется при восстановлении кровотока [77]. Это приводит к увеличению риска развития отсроченной функции трансплантата, острого отторжения, а также хронического почечного фиброза и потери трансплантата [90].
С другой стороны, ежегодно в мире выполняется более 2 миллионов кардиохирургических операций с применением искусственного кровообращения, наиболее частым осложнением которых также является острое почечное повреждение [52]. Тяжесть развившегося ОПП напрямую влияет как на показатели ранней послеоперационной смертности (варьируется от 8 до 40%), так и на отдаленный прогноз.
При развитии ишемии снижение кровотока происходит неравномерно по всей почке, максимально уменьшаясь в мозговом слое в сравнении с корковым. Таким образом, переход на анаэробный гликолиз, снижение продукции аденозинтрифосфата (АТФ) и внутриклеточного pH с дальнейшим развитием перегрузки клеток кальцием, генерацией активных форм кислорода и апоптоза, в большей степени выражены в эпителиальных клетках проксимальных канальцев. Их повреждение, в свою очередь, приводит к реализации канальцево-клубочковой обратной связи, что активирует ренин-ангиотензин-альдостероновую систему и дополнительно усугубляет вазоконстрикцию и снижение скорости клубочковой фильтрации [80, 98]. Таким образом, при остром почечном повреждении ишемически-реперфузионного генеза первичной является дисфункция эпителиальных клеток канальцев, которая затем приводит к нарушению функционирования почечных клубочков и формированию порочных кругов. Ключевую роль в патофизиологии ОПП играет почечная микроциркуляция и дисфункция эндотелия. Повреждение эндотелия микрососудистого русла приводит к активации эндотелиальных клеток и экспрессии новых маркеров на их поверхности, которые способствуют вербовке и адгезии лейкоцитов и тромбоцитов, что приводит к дальнейшему снижению перфузии и доставки кислорода и дополнительному повреждению эндотелиальных клеток и персистенции воспаления [70, 96]. Эндотелиальная дисфункция характеризуется, в частности, нарушением способности к вазодилатации, что часто объясняется сокращением производства оксида азота. Эндотелиальная NO-синтаза (eNOS) продуцируется в эндотелиальных клетках, особенно в корковом веществе почек, где нормальная продукция NO регулирует и сохраняет мозговой кровоток в ответ на почечные сосудосуживающие агенты, такие как ангиотензин II [129]. Однако после повреждения почек происходит разобщение eNOS, что подтверждается потерей вазодилататорных ответов на ацетилхолин и брадикинин [54]. Несмотря на репаративные процессы в почках, протекающие в течение недели, эндотелиальная дисфункция сохраняется более длительно время [50]. Другим ключевым ферментом, регулирующим обмен L-аргинина и влияющим на функциональное состояние эндотелия, является аргиназа. Аргиназа катализирует гидролиз L-аргинина до L-орнитина и мочевины и, таким образом, конкурирует с NOS для общего субстрата – L-аргинина. Она представлена в виде двух изоформ: аргиназы I и аргиназы II (АргII), которые в различной степени экспрессированы в клетках печени, макрофагах, эндотелиальных клетках и других типах клеток [42, 127]. В одном из исследований было продемонстрировано, что экспрессия и активность аргиназы II значительно повышались после ишемии-реперфузии почек, параллельно с прогрессированием поражения почечной ткани.
Фармакологическая блокада или генетический дефицит АргII обеспечивали защиту почек на данной модели: животные имели более низкие показатели креатинина и мочевины плазмы крови ишемически-реперфузионного повреждения. Блокирование аргиназ с использованием S-(2-борноэтил)-L-цистеина (BEC) уменьшало выраженность гистопатологических изменений, процессов оксидативного стресса и апоптоза, синтез провоспалительных цитокинов; увеличивало образование оксида азота и фосфорилирование eNOS, экспрессию 1-альфа -рецептора-активатора пролиферации пероксисом и способствовало сохранению митохондриальной ультраструктуры. Эти данные также демонстрируют, что АргII играет важную роль в почечной ишемии-реперфузии, через механизм, зависящий от eNOS. Недавнее исследование продемонстрировало, ишемия-реперфузия повышает активность аргиназы, а применение ингибитора аргиназ S-(2-бороноэтил)-L-цистеина (BEC) изменяет синтез почечного NO, не влияя на общую концентрацию аргинина в почках или плазме, что отражает два ключевых аспекта метаболизма аргинина и экспрессии аргиназы: во-первых, клетки могут содержать множественные внутриклеточные аргининовые бассейны, не все из которых взаимозаменяемы из внеклеточного аргининового пула [109]; во-вторых, так как аргиназа II локализуется в митохондриях, изменения в её деятельности не сказываются на концентрации аргинина на уровне всей почки [42]. Таким образом, ингибирование аргиназ при остром почечном повреждении ишемически-реперфузионного генеза является одним из перспективных направлений коррекции данного рода повреждений.
Фармакологическое прекондиционирование – перспективное направление коррекции ишемических повреждений почек
Эритропоэтин является цитокином, состоящим из двух частей: протеиновой и полисахаридной. Пептидная часть является стабильной и состоит из 165 аминокислотных остатков. Углеводная часть зависит от тканей и условий, в которых образуется эритропоэтин, и может достигать 39% от общей массы молекулы. Около 17% углеводной части эритропоэтина составляют сиаловые кислоты. В эмбриональном периоде эритропоэтин синтезируется в печени. В постнатальном периоде его синтез в основном происходит в почках, печени, эндотелиальных клетках, селезенке, ЦНС [55, 85, 111]. Образования эритропоэтина регулируется содержанием O2 и опосредуется гипоксией индуцируемым фактором (HIF) [9, 63, 76].
Биологические эффекты эритропоэтина реализуются при связывании со специфическими рецепторами. Рецепторы к эритропоэтину экспрессируются в эритроидных предшественниках, в эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов, различных клетках нервной системы, плаценте, почках, слизистой оболочке желудка, скелетной мускулатуре, семенниках, легких [9, 69]. Экспрессия рецепторов в тканях является не индуцированной гипоксией, а регулируется провоспалительными цитокинами [69].
Различают два вида рецепторов: гомодимерный и гетеродимерный. Это обусловливает независимое проявление эритропоэтического и цитопротективного эффектов. Активация гомодимерного рецептора приводит к торможению апоптоза и усилению пролиферации и дифференцировки клеток предшественников эритроидного ряда. Цитопротективные эффекты эритропоэтина связаны с активацией гетеродимерного рецептора [9, 69]. Реализация этих эффектов опосредуется JAK-2, STAT5, PI3-K, NFкB [63]. Обнаружение рецепторов к эритропоэтину в различных тканях закономерно вызвало повышенный интерес к его неэритропоэтическим свойствам.
Проведенные экспериментальные исследования позволили выявить у эритропоэтина нейропротективное и нейротрофическое действие [9], антиапоптотический и антиоксидантный эффект [63, 72, 85], способность улучшать ремоделирование и ангиогенез в поврежденной ишемией области за счет усиления образования эндотелиального фактора роста (VEGF) [Э3], кардиопротективные эффекты (46, 64), антитоксические и противоотечные свойства [66], кальций-модулирующие эффекты в возбудимых тканях [69] и др.
Ранее всего рецепторы к эритропоэтину были обнаружены в нервной ткани, и поскольку проблемы нейропротекции всегда были актуальными, наибольшее количество исследований посвящено коррекции последствий различных повреждений головного и спинного мозга или моделях заболеваний ЦНС. В лабораторных исследованиях эритропоэтин ускорял регенерацию нервной ткани, выявлены положительные эффекты при гипоксии, при воздействии экситотоксинов и метаболических стрессов, реализация которых осуществляется через блокирование высвобождения глутомата, снижение притока кальция, усиление продукции антиапоптотических и антиоксидантных белков, снижение продукции проапоптотических гуморальных факторов и свободных радикалов.
Периферическое или внутрижелудочковое введение эритропоэтина в экспериментальных условиях проявлял нейропротекторные эффекты при ишемическом инсульте, механической травме головного мозга, нейродегенеративных заболеваниях за счет модуляции иммунной и воспалительной реакций, уменьшения вторичных повреждений, восстановления оксигенации и непосредственного нейропротективного действия [60, 68, 85, 117]. Также эритропоэтин предотвращал демиелинизацию на модели рассеянного склероза, инсульта, повреждения спинного мозга, облегчал течение аутоиммунного энцефалита у мышей [85].
В ряде доклинических исследований было показано цитопротективное действие рекомбинантного человеческого эритропоэтина у животных при ишемическом повреждении ЦНС, миокарда, нижних конечностей и почек, при диабете и диабетической нефропатии, заживлении ран [55, 61, 67, 69, 111]. Большое перспективное значение играют данные о значительной роли эритропоэтина и механизмов его протективных эффектов в реализации положительных эффектов дистантного ишемического прекондиционирования [25, 86, 110, 120]. При моделировании экспериментальной преэклампсии у крыс введение эритропоэтина приводит к снижению протеинурии, улучшению функции эндотелия, положительной динамике морфологической картины в плаценте [6].
В клинических исследованиях эритропоэтин оказывал положительные эффекты у пациентов с ишемическим инсультом, шизофренией, эпилепсией и рассеянным склерозом [85].
Положительные результаты, полученные при трансплантации, тоже свидетельствуют о перспективности выбранного направления [58].
Принимая во внимание направление выполняемой диссертационной работы, хотелось отдельно уделить внимание эффективности эритропоэтина при ишемическом повреждении почек. На фоне введения эритропоэтина при 50-минутной ишемии почки наблюдается положительная динамика морфологической картины в почках, уменьшение оксидативного стресса, уменьшение воспалительных явлений, нормализация ферментной системы синтеза оксида азота [123]. Авторы другого исследования, проводя двустороннюю ишемию почек, также пришли к выводу о положительном влиянии эритропоэтина [29].
Однако, несмотря на достаточно большое количество исследований, остаются нерешенными многие моменты, которые препятствуют использованию неэритропоэтических эффектов эритропоэтина в клинике. Эритропоэтин является крупной молекулой и, несмотря на повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера при многих заболеваниях и описанном рецепторно-инвагинационном транспорте через мембраны, скорость его проникновения при системном введении уступает низкомолекулярным соединениям. Имеются публикации о том, что у мышей и у обезьян эритропоэтин при системном введении не проникает через гематоэнцефалический барьер [69]. Этим авторы пытаются объяснить неэффективность его при ишемическом инсульте.
При применении эритропоэтина возможны побочные эффекты, связанные с его эритропоэтическим эффектом, который является, даже сам по себе, нежелательным при многих заболеваниях [46, 55, 66, 86]. Это связано с тем, что многие неэритропоэтические эффекты проявляются при дозировках эритропоэтина, намного превышающих концентрацию, при которой происходит активация эритропоэтического эффекта. Поэтому на современном этапе большое внимание уделяется производным эритропоэтина, не обладающим эритропоэтическим действием. В плацебо-контролируемых клинических исследованиях также не говорится об эффективности неэритропоэтических свойств эритропоэтина [83].
Одним из таких производных является карбамилированный эритропоэтин. В нем все остатки лизина замещены гомоцитрулином. В литературе имеются данные об отсутствии у него способности стимулировать эритропоэз при сохраненной способности вызывать другие неэритропоэтические эффекты [95, 111]. Связано это с тем, что измененная химическая структура не позволяет ему связываться с гомодимерным рецептором эритропоэтина, при сохраненной способности связываться с гетеродимерным рецептором эритропоэтина [85]. Подобно эритропоэтину карбамилированный эритропоэтин способен оказывать цитопротективные эффекты и снижать воспаление при ишемическом и механическом повреждении головного и спинного мозга, при поражении седалищного нерва, при реперфузионно-ишемическом повреждении почек [69, 85, 95].
Еще одна из возможностей дифференцировки гемопоэтических и негемопоэтических эффектов заключается в создании короткоживущих производных эритропоэтина. Для активации цитопротекторных эффектов эритропоэтину достаточно связаться с гетеродимерным рецептором на короткое время (5 минут). Для активации эритропоэза необходимо постоянное нахождение эритропоэтина на гомодимерном рецепторе [69, 85].
Сиаловые кислоты, входящие в состав эритропоэтина, отвечают за пролонгированность нахождения эритропоэтина в кровотоке [85]. При отщеплении от эритропоэтина ферментативным путем сиаловых кислот получается асиалированный (десиалированный) эритропоэтин [55]. Время его обнаружения в кровотоке до 4 минут [69, 85]. Он так же связывается с гомодимерным рецептором, как и эритропоэтин, но активации эритропоэза не вызывает [55, 69, 85].
Несмотря на это, асиалированный эритропоэтин сохраняет свои неэритропоэтические эффекты, подобные эритропоэтину [95]. Он способен улучшать регенерацию нервной ткани. Обладает цитопротекторным действием при различных повреждениях головного мозга, спинного мозга и седалищного нерва, при рассеянном склерозе [24, 28, 55, 85, 111]. Введение асиалированного эритропоэтина оказывает протективное действие при ишемии нижних конечностей, а его ангиогенные эффекты превосходят эффекты рекомбинантного человеческого эритропоэтина [46]. Не оказывая эритропоэтического эффекта, он способен улучшать неврологическую симптоматику у новорожденной мыши при повреждении головного мозга [114].
Введение асиалированного эритропоэтина снижает апоптоз -клеток поджелудочной железы и улучшает их функцию. В этом же источнике имеются сведения о кардиопротективном эффекте асиалированного эритропоэтина [105]. При ксенотрансплантации яичников асиалированный эритропоэтин повышает процент выживших фолликулов [56].
Нефропротективные эффекты асиалированного эритропоэтина при экспериментальной ишемии почек
Ведение асиалированного эритропоэтина в дозах 0,4 мкг/кг и 2,4 мкг/кг за 30 минут до индукции ишемии приводило к росту скорости клубочковой фильтрации до 0,32±0,04 мл/мин и 0,37±0,03 мл/мин через 24 часа (рисунок 3.2.2) реперфузии соответственно, что статистически достоверно отличалось от группы с моделированием патологии при одновременном отсутствии достоверных отличий с уровнем сывороточного креатинина (рисунок 3.2.1). Активность исследуемых препаратов достоверно превосходила нефропротективные свойства рекомбинантного человеческого эритропоэтина, на фоне применения которого в субэритропоэтической дозе за 30 минут до ишемии, скорость клубочковой фильтрации восстанавливалась до 0,27±0,03 мл/мин.
Через 72 часа реперфузии также отмечалось дозозависимое улучшение фильтрационной способности почек, выражающееся в снижении концентрации сывороточного креатинина до 73,9±2,7 мкмоль/л и 63,1± 2,2 мкмоль/л (рисунок 3.2.3) и восстановлении скорости клубочковой фильтрации (рисунок 3.2.4) до 0,27±0,02 мл/мин и 0,36±0,03 мл/мин на фоне применения асиалированного эритропоэтина в дозах 0,4 мкг/кг и 2,4 мкг/кг соответственно.
Сывороточная концентрация мочевины также снижалась под действием асиалированного эритропоэтина, как на первые, так и на третьи сутки эксперимента, достигая при однократном введении в дозе 2,4 мкг/кг 5,97±0,25 ммоль/л и 6,76±0,33 ммоль/л через 24 и 72 часа реперфузии соответственно (рисунок 3.2.5, рисунок 3.2.6). Достигаемые значения достоверно отличались от группы ишемии-реперфузии (p 0,05), однако не были сопоставимы с показателями группы ложнооперированных животных.
При оценке функционального состояния почечных канальцев на фоне применения асиалированного эритропоэтина отмечалось дозозависимое снижение фракционной экскреции натрия в 2,2 и 2,5 раза на первые сутки эксперимента, превосходящее протективные эффекты эритропоэтина (таблица 3.2.1). На 3 сутки эксперимента коррекция асиалированным эритропоэтином позволила достичь целевых значений фракционной экскреции натрия менее 2% до 1,57±0,09% и 1,3±0,09% в дозах 0,4 мкг/кг и 2,4 мкг/кг соответственно.
Однократное введение асиалированного эритропоэтина в дозах 0,4 мкг/кг и 2,4 мкг/кг за 30 минут до ишемии приводило к восстановлению уровня микроциркуляции во всех временных точках эксперимента, превосходя статистически достоверно показатели группы с применением рекомбинантного человеческого эритропоэтина (p 0,05) (таблица 3.2.2)
Через сутки после оперативного вмешательства на фоне лечения в гистологических препаратах явления интерстициального отека слабо выражены, инфильтрация лимфоцитами соединительнотканной стромы сохранена, при этом плотность клеток на единицу площади среза значительно меньше, чем без лечения. Количество почечных телец на стандартной площади среза больше в сравнении с первыми сутками без лечения. Сморщенные сосудистые клубочки единичные. Визуализируются участки, как с полным сохранением пространственной организации структур канальцев почки, так и участки с разрушенной щеточной каемкой, внутриклеточным отеком, пузырением, но нахождением клеток на базальной мембране и разрушением межклеточных контактов (рисунок 3.2.7). Следует также отметить, что на данном сроке в условиях проведения медикаментозной терапии характерны обширные участки сохраненного эпителия между фокусами с обструкцией просвета канальцев цилиндрами из слущенных эпителиоцитов (рисунок 3.2.8). Обтурированные канальцы визуализируются не только на границе между корковым и мозговым веществом, но и в мозговом веществе – в собирательных трубочках (рисунок 3.2.9 А, Б).
На 3 сутки после оперативного вмешательства в условиях медикаментозного лечения наблюдается восстановление проходимости канальцев, при сохранении базальной мембраны и наличие некоторого количества жизнеспособных клеток, обеспечивающих регенерацию канальцевого эпителия. Визуализируются уплощенные клетки с гиперхромными ядрами и фигурами митоза. Признаки интерстициального отека отсутствуют.
В корковом веществе определяются преимущественно почечные тельца без выраженных структурных изменений, однако встречаются единичные сморщенные сосудистые клубочки, количество которых больше, чем на 1 сутки, но меньше, чем на 3 сутки без медикаментозного лечения (рисунок 3.2.10).
Следует отметить, что в некоторых патоморфологически неизмененных почечных тельцах визуализируется утолщение наружного листка капсулы Шумлянского-Боумэна (рисунок 3.2.11 А). Внутренний листок капсулы, окружающий кровеносные капилляры сосудистого клубочка, так же хорошо выражен.
Относительно структурных особенностей канальцев. В корковом веществе проксимальные канальцы с нечетким размытым просветом, образованы призматическими эпителиоцитами с хорошо выраженной щеточной каемкой на апикальной поверхности. В дистальных канальцах межклеточные контакты сохранены, высота эпителиоцитов снижена, просвет широкий, хорошо выражен (рисунок 3.2.11 Б).
В мозговом веществе почки в области собирательных трубок встречаются небольших размеров участки, содержащие цилиндры из слущенных эпителиоцитов (рисунок 3.2.11 В).
В условиях коррекции нарушений производными эритропоэтина по данным морфометрии отмечалось увеличение высоты эпителиоцитов как проксимальных, так и дистальных канальцев, что отражает регенеративные процессы в эпителии, отмеченные при морфологическом исследовании. Наиболее эффективной была коррекция асиалированным эритропоэтином в дозе 2,4 мкг/кг: высота эпителия проксимальных канальцев составила 9,93±0,07 мкм и 9,72±0,11 мкм на 1 и 3 сутки эксперимента соответственно при параллельном росте высоты эпителия дистальных канальцев до 6,65±0,09 мкм и 6,33±0,09 мкм (таблица 3.2.3).
Морфометрия клубочковых структур была наиболее показательна через 72 часа реперфузии: под действием асиалированного эритропоэтина площадь сосудистого клубочка достигала 4818,81±73,06 мкм2, 5453,48±85,6 мкм2, превосходя эффекты рекомбинантного эритропоэтина при параллельном увеличении площади почечного тельца до 9997,14±100,2 мкм2 и 10070,46±128,51 мкм2 в дозах 0,4 мкг/кг и 2,4 мкг/кг соответственно (таблица 3.2.4).
Роль eNOS и K+АТФ каналов в реализации нефропротективных эффектов асиалированного эритропоэтина и селективного ингибитора аргиназы II при экспериментальной ишемии-реперфузии почек
Введение блокатора K+АТФ каналов глибенкламида и блокатора эндотелиальной NO-синтазы до применения асиалированного эритропоэтина и KUD975 не приводило к изменению уровня креатинина на первые сутки эксперимента (рисунок 3.5.1).
С другой стороны, введение глибенкламида полностью снимало положительные эффекты асиалированного эритропоэтина, выражавшееся в снижении скорости клубочковой фильтрации, и не оказывало влияния на нефропротективные эффекты селективного ингибитора аргиназы II (рисунок 3.5.2). Применение ингибитора эндотелиальной NO-синтазы, L-NAME за 30 минут до введения фармакологических агентов нивелировало положительные эффекты как асиалированного эритропоэтина, так и KUD975 до показателей СКФ группы с моделированием ишемии-реперфузии (рисунок 3.5.2).
Через 72 часа реперфузии отмечалась схожая тенденция: на фоне применения глибенкламида нивелировались защитные эффекты асиалированного эритропоэтина, что проявлялось в виде роста креатинина (рисунок 3.5.3) и снижения скорости клубочковой фильтрации (рисунок 3.5.4) до показателей группы контроля. В группе с введением глибенкламида и KUD975 показатель скорости клубочковой фильтрации достоверно не отличался от показателей группы с моделированием патологии и применением KUD975, достигая 0,3±0,02 мл/мин.
Предварительное введение L-NAME приводило к устранению нефропротективных свойств как асиалированного эритропоэтина, так и селективного ингибитора аргиназы II.
Сывороточная концентрация мочевины также нарастала на фоне предварительного введения ингибитора eNOS, как в группах с коррекцией асиалированным эритропоэтином, так и в группах с применением KUD975, однако блокада K+АТФ каналов не приводила к росту уровня мочевины в группе на фоне коррекции KUD975 (рисунок 3.5.5, рисунок 3.5.6).
При оценке функционального состояния почечных канальцев отмечалось нарастание повреждения канальцевого аппарата в группе с предварительным введением глибенкламида на фоне применения асиалированного эритропоэтина и отсутствие динамики на фоне применения селективного ингибитора аргиназы II. Блокада синтеза NO приводила к нивелированию эффектов обоих классов препаратов, что выражалось в нарастании фракционной экскреции натрия как через 24, так и через 72 часа реперфузии (таблица 3.5.1).
Во всех временных отрезках при измерении уровня микроциркуляции на фоне введения глибенкламида отмечалось исчезновение защитных эффектов асиалированного эритропоэтина, выражавшееся в нарастании микроциркуляторных нарушений до показателей группы контроля (таблица 3.5.2). В группе с профилактическим введением KUD975 не было выявлено вклада K+АТФ каналов в реализацию нефропротективных свойств. Предварительное введение L-NAME в дозе 25 мг/кг приводило к устранению нефропротективных свойств как асиалированного эритропоэтина, так и селективного ингибитора аргиназы II.
При морфологическом исследовании было выявлено, что высота эпителия проксимальных и дистальных канальцев, а также площадь клубочковых структур при коррекции асиалированным эритропоэтином на фоне глибенкламида и L-NAME приближается к показателям животных с моделированием патологии (таблица 3.5.3, таблица 3.5.4). При коррекции селективным ингибитором аргиназы II KUD975 на фоне глибенкламида эффект терапии сохраняется, при коррекции селективным ингибитором аргиназы II KUD975 на фоне L-NAME нивелируется.
Полученные результаты свидетельствуют о реализации нефропротективных свойств асиалированного эритропоэтина через активацию K+АТФ каналов и систему оксида азота, что было продемонстрировано в экспериментах с глибенкламидом и блокатором eNOS соответственно.
Механизм нефропротективных эффектов селективного ингибитора аргиназы II также тесно связан с системой оксида азота и не зависит от K+АТФ каналов.