Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Ишемия сетчатки как патогенетическое звено ряда сосудистых заболеваний глазного дна 13
1.2 Обобщенный анализ результатов исследования эффективности эмоксипина. Выбор эмоксипина как препарата сравнения 21
1.3 Роль механизма прекондиционирования в повышении устойчивости тканей и органов к гипоксии и профилактика ишемических состояний 23
1.4 Виды прекондиционирования 28
1.5 Эритропоэтин как агент фармакологического прекондиционирования 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Моделирование ишемии сетчатки 38
2.2 Оценка уровня микроциркуляции в сетчатке глаза крыс методом лазерной допплеровской флоуметрии 40
2.3 Оценка электрофизиологических показателей сетчатки глаза крыс методом электроретинографии 42
2.4. Методы морфологического исследования 43
2.5 Обоснование доз исследуемых веществ и дизайн исследования 45
2.6 Статистическая обработка результатов исследования 59
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 60
3.1 Оценка временного режима моделирования ишемии сетчатки крыс и выбор оптимального режима с использованием инструментальных методов анализа и результатов морфометрических исследований 60
3.1.1 Оценка уровня микроциркуляции методом ЛДФ 60
3.1.2 Оценка функционального состояния сетчатки крыс методом ЭРГ 63
3.1.3 Оценка морфометрических изменений в сетчатке лабораторных животных 65
3.2 Результаты исследования протективного действия дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина в сравнении с эмоксипином. Фармакологический анализ пути реализации ретинопротективного действия 77
3.2.1 Оценка уровня микроциркуляции в сетчатке 77
3.2.2 Оценка электрофизиологического состояния сетчатки 79
3.2.3 Результаты морфометрии слоев сетчатки крыс 86
Обсуждение результатов 101
Заключение 108
Выводы 110
Перечень сокращений и условных обозначений 112
Список литературы
- Обобщенный анализ результатов исследования эффективности эмоксипина. Выбор эмоксипина как препарата сравнения
- Роль механизма прекондиционирования в повышении устойчивости тканей и органов к гипоксии и профилактика ишемических состояний
- Оценка электрофизиологических показателей сетчатки глаза крыс методом электроретинографии
- Оценка морфометрических изменений в сетчатке лабораторных животных
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В последние годы отмечается рост ишемических заболеваний глаз, связанных с распространением атеросклероза, артериальной гипертензии (АГ), ишемической болезни сердца (ИБС), сахарного диабета, которые приводят к патологии сосудистой системы глаза. Ишемия является одной из ведущих причин слабовидения, слепоты и инвалидности по зрению у людей различных возрастных групп (Камилов Х.М., 2015). Местные нарушения кровообращения в ветвях центральной артерии сетчатки (ЦАС) наблюдаются при диабетической ретинопатии, дистрофических заболеваниях сетчатки, атрофии зрительного нерва сосудистого генеза, травматических повреждениях глаза, ишемической нейропатии. Ишемия сетчатки (ИС) развивается в 35% случаях при атеросклеротических изменениях сердечно-сосудистой системы, в 25% случаях при АГ (Танковский В.Э., 2000; Худяков А.Ю., 2014). Ежегодно почти 14% случаев потери зрения у взрослых связано с сахарным диабетом. При инсулинозависимом сахарном диабете ухудшение зрения наступает спустя 3-5 лет с момента постановки диагноза, у больных с инсулинонезависимым сахарным диабетом ретинопатия имеется уже у 20% на момент постановки диагноза (Астахов Ю.С., 2009). Именно поэтому, изучение способов повышения толерантности тканей к ишемии, является актуальной проблемой современной экспериментальной и клинической фармакологии. Решением данной проблемы может служить прекондиционирование фармакологическими средствами. Наиболее перспективным для изучения, с нашей точки зрения, является рекомбинантный эритропоэтин.
Степень разработанности темы
Прекондиционирование означает метаболическую адаптацию тканей к ишемии, развивающуюся после повторяющихся кратковременных эпизодов ишемии. Данный феномен изучался многими авторами и показал своё защитное действие в предупреждении ишемического повреждения тканей (Писаренко О.И., 2005), на сердце (Weinbrenner C., 2002), сосудах (Desai M., 2011), почках (Zarbock A., 2015), печени (Clavien P.A., 2000) и так далее.
Эффекты фармакологического прекондиционирования на сетчатке лабораторных животных изучали при введении триметазидина, что оказывает благоприятное воздействие на неё, ингибируя процесс перекисного окисления липидов и нивелируя гистопатологические изменения, связанные с ишемией-реперфузией (Demir T., 2010). Изучено действие Е-64d – искусственного селективного ингибитора кальпаина, на синтез кальпаина и кальпастатина в сетчатке глаза крыс после экспериментально вызванной ишемии-реперфузии. Толщину сетчатки и морфологические изменения определяли гистологически (Чен З., 2008). Показано, что введение диборнола оказывает положительный эффект на гемодинамику сетчатки, ограничивая тромбообразование и способствуя сохранности открытых функционирующих сосудов при моделировании ишемии мозга (Цой Ю.Р., 2010).
Интравитреальное введение эритропоэтина в большой дозе (5000 МЕ/кг) обладает защитным действием на ряд клеток сетчатки. В экспериментах показано улучшение показателей жизнедеятельности слоя ганглиозных клеток в условиях гипоксии сетчатки и предотвращение развития ишемических осложнений у животных (Carraway M.S., 2010).
Данный фармакологический агент зарекомендовал себя в ранее проведенных работах по изучению протективного действия фармакологического прекондиционирования на модели ишемии-реперфузии головного мозга (Buemi M., 2002; Brines M.L., 2000), сердца (Артюшкова Е.Б., 2009; Parsa C.J., 2004), задней конечности (Колесник И.М., 2011), почках (Покровский М.В., 2012), плаценты (Покровский М.В., 2012), печени (Алехин С.А., 2012). Учитывая данные экспериментальных исследований феномена фармакологического прекондиционирования на разных органах и тканях, можно предположить, что рекомбинантный эритропоэтин в субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг будет обладать протективными свойствами на модели ишемии сетчатки лабораторных крыс за счет эффекта прекондиционирования, ключевую роль в котором играют АТФ-зависимые калиевые каналы.
При анализе литературных и экспериментальных данных по фармакологическому прекондиционированию сетчатки, а также при патентном поиске сведений о применении рекомбинантного эритропоэтина для коррекции ишемических состояний сетчатки в качестве агента фармакологического прекондиционирования нами не обнаружено, что указывает на целесообразность изучения прекондиционирующих свойств данного фармакологического агента на модели ишемии сетчатки.
Цель исследования: повышение эффективности фармакологической коррекции ишемии сетчатки с использованием дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином.
Задачи:
-
Провести оценку временного режима моделирования ишемии сетчатки крыс и выбор оптимального режима с использованием инструментальных методов анализа и результатов морфометрических исследований.
-
Исследовать протективное действие рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг на модели ишемии сетчатки крыс.
-
Исследовать протективное действие дистантного ишемического прекондиционирования на модели ишемии сетчатки крыс.
-
Исследовать протективное действие эмоксипина на модели ишемии сетчатки крыс.
-
Подтвердить механизм реализации ретинопротективного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг через активацию АТФ-зависимых калиевых каналов.
Научная новизна исследования
В работе впервые проведена оценка количественных изменений уровня микроциркуляции, электроретинографии и морфометрии в сетчатке при моделировании ишемии различной продолжительности. Впервые показано, что дистантное ишемическое и фармакологическое прекондиционирование рекомбинантным эритропоэтином (ЭПО) в дозе 50 МЕ/кг обладают протективным действием на модели ИС лабораторных крыс. Наличие протективных свойств дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП) и ЭПО в дозе 50 МЕ/кг подтверждается достоверным предотвращением повышения уровня микроциркуляции через 1 ч реперфузии и более высокими значениями по сравнению с группой контроля через 72 ч реперфузии. Параллельно ДИП и ЭПО в дозе 50 МЕ/кг нормализовали значения коэффициента b/a электроретинограммы и морфометрических показателей слоев сетчатки. Количественные значения протективных эффектов ЭПО превосходят ДИП и эмоксипин, которые имеют сопоставимые значения. Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом в дозе 5 мг/кг предотвращала развитие протективных эффектов ДИП и ЭПО, что свидетельствует об участии АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации ретинопротекции за счет механизма прекондиционирования.
Теоретическая и практическая значимость работы
В работе обоснована эффективность применения рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг и дистантного ишемического прекондиционирования для коррекции ишемических повреждений сетчатки в эксперименте.
Результаты исследования позволяют констатировать выраженное
протективное действие рекомбинантного эритропоэтина в
субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг и дистантного ишемического прекондиционирования на модели ишемии сетчатки крыс, что может быть использовано для дальнейшего исследования в качестве нового (специфического) подхода в коррекции ишемических повреждений сетчатки.
Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные
клинические испытания рекомбинантного эритропоэтина в
субэритростимулирующей дозе при состояниях, сопровождающихся ишемией сетчатки.
Методология и методы диссертационного исследования
Экспериментальные исследования были выполнены согласно методическим рекомендациям по доклиническому изучению лекарственных средств (Миронов А.Н., 2012). Исследование проводили на крысах линии Wistar, с использованием комплекса современных физиологических, электрофизиологических и морфометрических методов на кафедре фармакологии и в центре доклинических и клинических исследований ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».
Положения, выносимые на защиту:
-
30-минутная модель ишемии сетчатки с последующей реперфузией сопровождается комплексом микроциркуляторных, электрофизиологических и морфометрических изменений, что позволяет использовать данную модель для оценки протективных эффектов фармакологических агентов.
-
Протективное действие рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг превосходит по эффективности дистантное ишемическое прекондиционирование и эмоксипин в дозе 2 мг/кг в эксперименте на модели ишемии сетчатки крыс.
-
Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом в дозе 5 мг/кг предотвращает развитие протективных эффектов ДИП и ЭПО, что свидетельствует об участии АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации ретинопротекции за счет механизма прекондиционирования.
Степень достоверности и апробация результатов
Высокая степень достоверности полученных результатов обусловлена достаточным объемом экспериментальных исследований, проведенных на животных с использованием современных методов, высокотехнологичного оборудования, а также параметрических и непараметрических критериев статистической обработки данных. Материалы диссертационной работы представлены на XXIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2016), 5-й ежегодной научно-практической конференции «Лабораторные животные: наука, фармакология, ветеринария» (Белгород, 2015), 79-й итоговой Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2014), XXII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Волгоград, 2013). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, акушерства и гинекологии, биохимии, центра доклинических и клинических исследований НИУ «БелГУ».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 1 статья в издании, входящем в базы данных Scopus, 2 патента на изобретения РФ.
Личный вклад автора
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии во всех этапах диссертационного исследования, в наборе экспериментального материала, углубленном анализе отечественной и зарубежной научной литературы по теме диссертационного исследования, анализе и интерпретации лабораторных и инструментальных данных, их систематизации, статистической обработке с последующим описанием полученных результатов, написании и оформлении рукописи диссертации, основных публикаций по выполненной работе.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста, проиллюстрирована 39 рисунками, 8 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), экспериментальной части (глава 3), обсуждения результатов,
заключения, выводов и списка литературы, включающего 231 источник, в том числе 138 зарубежных.
Обобщенный анализ результатов исследования эффективности эмоксипина. Выбор эмоксипина как препарата сравнения
Исход ишемического повреждения сетчатки зависит от ряда факторов. Скорость развития ишемии, диаметр пораженного сосуда, состояние сосудистой системы сетчатки глаза, а также степень развития и скорость активации коллатерального кровообращения, являются наиболее значимыми факторами, решающими исход ишемического повреждения [17].
Наиболее часто острые ишемические повреждения сетчатки и зрительного нерва возникают при ГБ и атеросклерозе, и связаны с нарушением кровообращения в сосудах сетчатки, что может привести к частичной или полной утрате зрения [25, 219, 160]. Сосудистые заболевания, снижение функциональной активности сердца, связанное с возрастными изменениями, осложняют течение глаукомы, не смотря на нормализацию внутриглазного давления (ВГД). Таким образом, развитие возрастной дегенерации сетчатки, атрофии зрительного нерва и глаукомы напрямую связано с сосудистым фактором [17].
Увеличение потребности тканями кислорода и необходимыми метаболитами и снижение притока артериальной крови, являются основными причинами, приводящими к возникновению ишемии. Наиболее часто ишемическое повреждение глаза возникает при недостаточности притока крови. К снижению притока крови ведут следующие факторы: 1. Нейрогенный фактор – связан с вазоконстрикцией артериол, вследствие преобладания симпатических влияний над активностью парасимпатических влияний. 2. Увеличение вазоконстрикторных агентов и (или) повышение чувствительности к ним стенки сосудов, что также приводит к вазоконстрикции – гуморальный фактор. 3. Нарушение притока крови из-за сдавления сосуда или уменьшения просвета артериол – «механический» [17, 54]. Нарушение микроциркуляторного русла (МЦР) происходит в приносящих и отводящих отделах МЦР. Микроциркуляция представляет собой процесс однонаправленного движения биологических жидкостей (крови, лимфы, тканевой жидкости) в кровеносных и лимфатических микрососудах (диаметр 2–200 мкм) и межклеточных пространствах [17, 49, 54]. Чрезвычайно разветвленная сеть сосудов малого калибра и прекапиллярных сфинктеров, а также несоответствие размера эритроцита диаметру капилляров является особенностью МЦР, вследствие этого сопротивление кровотока в МЦР определяется реологическими свойствами крови и состоянием прекапиллярных сфинктеров [5, 33, 24].
Дистрофические изменения сетчатки являются наиболее тяжелыми поражениями глаза, предрасполагающими факторами возникновения являются: наследственность, близорукость, ГБ, сахарный диабет, атеросклероз и т.д.. Данные изменения прогрессируя ухудшают зрение и приводят к инвалидности, возникая у всех возрастных групп как женщин, так и мужчин [17].
Ишемические процессы, происходящие в сетчатке, делят на острые и хронические. Нарушение кровообращения в ЦАС или центральной вене сетчатки (ЦВС), вызывает развитие острой ишемии сетчатки, что проявляется передней или задней ишемической нейропатией. Острая ишемия сетчатки может возникать на фоне хронической ишемии обусловленной стенозом сонной артерии, стенозом глазничной артерии, диабетической ангиоретинопатией, дегенеративными изменениями сетчатки и т.д.) [44].
К ишемическим повреждениям приводят травмы глаза, головы, ангиоспастические заболевания. Помимо развития ишемической нейропатии при нарушении кровообращения в ЦАС, ЦВС, возникновение ишемии возможно на фоне гипотонии, хирургических вмешательств, после приема некоторых лекарственных препаратов, предрасполагающими факторами риска являются анемия, микроэмболизация, нарушения свертывающей и противосвертывающей системы крови [44].
Острые ишемические процессы в сетчатке, возникающие из-за нарушения кровоснабжения сетчатки и зрительного нерва, приводят к частичной потере зрения или к слепоте. Улучшение и стабилизация данного процесса, возможна при своевременном лечении, с повторными курсами лечения [44]. Острые нарушения кровообращения в сосудах сетчатки Окклюзия центральной артерии сетчатки Окклюзия ЦАС и её ветвей чаще возникает при вегетососудистых расстройствах, органических изменениях сосудистой стенки в связи с ГБ, атеросклерозом и др., у лиц пожилого возраста и может быть связана со спазмом, эмболией или тромбозом сосудов [44]. Клинические признаки и симптомы Наблюдается резкое и стойкое снижение зрения или выпадение поля зрения. Кратковременная слепота до развития полной окклюзии ЦАС встречается в 10– 15 % случаев. Значительно снижается острота зрения: в 10 % случаев развивается слепота, 50 % – счет пальцев у лица, 20% – острота зрения 0,1–0,2. При эндокринных заболеваниях, острых инфекциях, ревматизме эмболия ЦАС и её ветвей наблюдается чаще у молодых людей. Сохранение остроты зрения при выпадении поля зрения или развитии его дефектов, наблюдается при поражении одной из ветвей ЦАС [44].
Прогноз при эмболии ЦАС пессимистический. У молодых людей при спазме зрение может вернуться почти полностью, у пожилых людей прогноз значительно хуже [44]. При закупорке одной из ветвей ЦАС, наблюдается выпадение соответствующего участка поля зрения [44]. Клинические рекомендации
Лечение заключается в восстановлении кровотока в артериальных сосудах, уменьшении площади ишемии, устранении метаболических нарушений и отека сетчатки. При наличии холестеринового эмбола в первые трое суток проводят массаж глазного яблока способствующий продвижению эмбола в дистальные отделы сосудистого русла (осуществляют давящие круговые движения на глазное яблоко по 10–15 мин 5–6 р/сут) [62, 47, 50, 70].
Лечение включает два этапа. Первый этап: парабульбарное введение дексаметазона 2 мг 1 р/сут, 10 сут + (через 40 мин после введения дексаметазона) папаверин, 2% раствор, парабульбарное введение 0,3 мл 1 р/сут, 10 сут + (через 40 мин после введения дексаметазона) прокаин, 2% раствор, парабульбарно 0,2 мл 1 р/сут, 10 сут + натрия хлорид раствор внутривенно капельно 250 мл 1 р/сут, 4–7 сут + пентоксифиллин внутривенно капельно 5–15 мл 1 р/сут, 4–7 сут + никотиновая кислота, 1% раствор, внутримышечно 1 мл 2 р/сут, 10–12 сут + ацетазоламид внутрь 250 мг 1 р/2 сут, 2 нед [62, 47, 50, 70].
При окклюзии центральной артерии сетчатки (ОЦАС), обусловленной эмболией, необходимо снижение внутриглазного давления и восстановление кровотока в артериях сетчатки, что возможно при проведении парацентеза передней камеры. Данное вмешательство приводит к быстрому снижению внутриглазного давления и восстановлению кровотока в артериях сетчатки.
Роль механизма прекондиционирования в повышении устойчивости тканей и органов к гипоксии и профилактика ишемических состояний
Измерение уровня микроциркуляции в сетчатке глаза крыс осуществляли методом ЛДФ. Регистрацию осуществляли при помощи программно-аппаратного комплекса Biopac-systems MP-150 и датчика игольчатого типа TSD-144 (США) при помощи программы AcqKnowledge 4.2. После наркотизации животного оценку уровня микроциркуляции осуществляли в десяти точках по окружности глазного яблока, длительность записи показаний уровня микроциркуляции в одной точке составляла двадцать секунд. Из результатов уровня микроциркуляции в каждой точке выводили среднее, которое принимали за показатель уровня микроциркуляции в сетчатке у данного экспериментального животного. Показатель микроциркуляции в группе животных рассчитывали как среднее из значений, полученных у каждого экспериментального животного в группе.
Общий вид регистрируемой кривой изображен на рисунке 2.1. При оценке состояния сетчатки особого внимания требует состояние микрогемодинамики и контроль её изменения. ЛДФ позволяет определить перфузионные параметры микрокровотока. При флоуметрии зондирующее лазерное излучение позволяет получить отраженный сигнал из слоя толщиной до 1 мм, объем зондируемой ткани определяется оптическими параметрами световая датчика и составляет около 1 мм3. Учитывая, что толщина склеры, хориоидеи и сетчатки глаза крыс составляет менее 0,5 мм, применение контактной методики лазерного исследования позволяет оценить микроциркуляцию по всей глубине зондируемой области [217, 195, 67].
В связи с тем, что ИС приводит к характерным изменениям в сетчатке, электроретинография позволяет объективно оценить её состояние. Принцип ЭРГ заключается в регистрации потенциалов клеток сетчатки в ответ на освещение. Оценку электрофизиологической активности сетчатки проводили по её основным компонентам, по амплитуде а- и b-волн. Функциональную активность фоторецепторов позволяет оценить негативная a-волна. Электрическую активность биполяров и мюллеровских клеток с возможным вкладом горизонтальных и амакриновых клеток отражает позитивная b-волна (рисунок 2.2). В исследованиях показано, что угнетение волны b является наиболее чувствительным показателем ишемического повреждения ткани и отражает функциональное состояние сетчатки даже при отсутствии заметных структурных повреждений [30].
Для проведения регистрации ЭРГ животных выдерживали в темноте 30 мин [129], далее наркотизировали (хлоралгидрат, 300 мг/кг, в/б) и фиксировали на столике, изолированном от электромагнитного излучения. Роговичный серебряный электрод помещали на роговицу, предварительно смоченную физраствором для более полного контакта, референтный игольчатый электрод EL452 помещали подкожно в области черепа, заземляющий игольчатый электрод EL450 помещали подкожно в области основания хвоста. Стробоскоп со вспышкой белого света, подключенный к стимулятору STM200 фирмы Biopac System, Inc. (США), размещали за спиной животного, регистрацию ЭРГ проводили в ответ на одиночную стимуляцию. Вызванные биопотенциалы пропускались на частоте 1–1000 Гц, усиливались, усреднялись и представлялись графически на экране при помощи Biopac-systems MP-150 с компьютерной программой AcqKnowledge 4.2 (США). Запись ЭРГ проводили в течение 0,5 секунд у каждой крысы в группах. Для оценки степени развития ишемии сетчатки оценивали соотношение амплитуд b- и а-волн ЭРГ – коэффициент b/a (Нероев В.В. и др., 2004) [30]. Из полученных десяти значений в каждой группе выводили среднее, которое вносили в протокол. Общий вид регистрируемой кривой электроретинограммы изображен на рисунке 2.2.
После проведения ЛДФ и ЭРГ глаз с прилегающими тканями подлежал энуклеации. Полученный образец фиксировали в 10 % растворе формалина на фосфатном буфере иммерсионным способом в течение 24 ч.
1 Морфологические исследования проведены в лаборатории Научно-образовательного центра «Прикладная иммуноморфология и цитогенетика» НИУ «БелГУ» при консультативной и методической помощи руководителя центра, профессора, д.м.н. А.А. Должикова и на базе Курского областного клинического онкологического диспансера с участием заведующего отделением гистологической диагностики опухолей А.В. Пирогова, за что выражаем глубокую благодарность. Образцы для гистологического исследования и изготовление микропрепаратов осуществлялось с использованием сертифицированного оборудования фирмы Leica (Германия). Фиксированный материал подлежал заливке в стандартном режиме в парафин в автомате карусельного типа «TP-1020» с использованием батареи из этилового спирта и ксилола. Заливку блоков со стандартной ориентацией кусочков осуществляли на станции для заливки биологического материала в парафин «EG1150H» с охлаждающим модулем «EG1150C». Кусочки ориентировали в блоках таким образом, чтобы при изготовлении срезов получить препараты в меридианном направлении строго через середину глазного яблока – осью глазного яблока параллельно поверхности блока. На ротационном микротоме RM2245 с использованием одноразовых ножей изготавливали срезы для гистологического исследования толщиной 4 мкм, после чего срезы окрашивали гематоксилином и эозином в автомате для окраски гистологических срезов и мазков. Вид стандартизованного микропрепарата сетчатки глаза животного представлен на рисунке 2.3.
Описание гистологических препаратов выполнено под микроскопом Axio Scope A1 (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия). Основная часть морфологического исследования выполнена после создания электронной галереи изображений с помощью полуавтоматического сканера микропрепаратов Mirax Desk (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия), что позволяет максимально стандартизовать режимы морфометрического исследования, а также с помощью микроскопа «Leica DM 4000 B», оснащенного комплексом для видеорегистрации изображений и пакетом программного обеспечения для морфометрии.
Оценка электрофизиологических показателей сетчатки глаза крыс методом электроретинографии
После моделирования патологии измерение уровня микроциркуляции осуществляли через 1 ч и 72 ч реперфузии методом ЛДФ. Результаты, полученные через 1 ч реперфузии, представлены в таблице 3.3.
Уровень микроциркуляции в сетчатке интактных крыс составил 738,9±37,6 п.е. Уровень микроциркуляции после моделирования ишемии в группе контроля составил после 1 ч реперфузии 1155,0±51,9 п.е., что достоверно выше значения в группе интактных животных (р 0,05).
Примечания: здесь и везде далее – р 0,05 в сравнении с группой интактных животных; у – р 0,05 в сравнении с группой контроля; ДИП – дистантное ишемическое прекондиционирование; ЭПО – рекомбинантный эритропоэтин. На фоне коррекции патологии ДИП уровень микроциркуляции в сетчатке после 1 ч реперфузии снижается до 952,0±25,8 п.е. (р 0,05), что достоверно отличается от группы интактных животных и группы контроля.
При коррекции моделируемой патологии ЭПО уровень микроциркуляции в группе снижается до 798,5±12,3 п.е. и так же достоверно отличается от значений в группе контроля (р 0,05). Предварительное введение эмоксипина приводило к снижению уровня микроциркуляции до 998,0±19,4 п.е. Введение глибенкламида, блокатора АТФ-зависимых калиевых каналов в группах с коррекцией ДИП и ЭПО предотвращало снижение уровня микроциркуляции, что подтверждает наличие прекондиционирующего действия у рекомбинантного ЭПО в дозе 50 МЕ/кг на модели ишемии сетчатки крыс после 1 ч реперфузии.
Результаты оценки уровня микроциркуляции в сетчатке крыс через 72 ч реперфузии после моделирования ИС и ее коррекции ДИП, ЭПО в дозе 50 МЕ/кг и эмоксипином в дозе 2 мг/кг представлены в таблице 3.4.
Уровень микроциркуляции в сетчатке интактных крыс составил 743,9±5,0 п.е. Уровень микроциркуляции после моделирования ИС в группе контроля составил после 72 ч реперфузии 353,3±11,7 п.е., что достоверно ниже значения в группе интактных животных (р 0,05), и свидетельствует о формировании ишемии к 72 ч реперфузии. На фоне коррекции патологии ДИП уровень микроциркуляции в сетчатке после 72 ч реперфузии достоверно возрастает до 638,5±15,8 п.е. (р 0,05), что достоверное отличается от показателя в группе интактных животных и группы контроля.
При коррекции моделируемой патологии ЭПО уровень микроциркуляции в группе увеличивается до 724,0±4,1 п.е., что достоверно отличается от значений в группе контроля (р 0,05) и стремится к значению в группе интактных животных. В группе животных, получавших эмоксипин, уровень микроциркуляции составил 672,3±12,7 п.е., что достоверно отличается от значений в группе интактных животных и группе контроля (р 0,05).
Введение глибенкламида в группах с коррекцией ДИП и ЭПО предотвращало повышение уровня микроциркуляции, что подтверждает наличие прекондиционирующего эффекта у рекомбинантного ЭПО в дозе 50 МЕ/кг на модели ишемии сетчатки крыс после 72 ч реперфузии.
После моделирования ишемии и измерения уровня микроциркуляции в сетчатке проводили электроретинографию на вызванный потенциал. Полученные данные представлены в таблице 3.5.
Коэффициент b/a в группе контроля составил 2,0±0,09 усл. ед., что достоверно отличается от значения в группе интактных животных. Повышение данного показателя в группах с коррекцией рекомбинантным ЭПО до 2,5±0,07 отн. ед. и ДИП – до 2,3±0,07 отн. ед. говорит о сохранении электрофизиологической функции сетчатки после моделирования патологии. В группе животных с коррекцией эмоксипином коэффициент b/a составил 2,3±0,09 отн. ед., что достоверно отличается от показателей в группе с ишемией сетчатки и приближается к значениям в группе интактных животных. Таблица 3.5 – Результаты оценки электрофизиологического состояния сетчатки через 1 ч реперфузии (М±т; п=10). № п.п. Экспериментальные группы Ь/а, отн. ед. 1. Интактные 2,6±0,09у 2. Контроль 2,0±0,09 3. Коррекция ДИП 2,3±0,07 у 4. Коррекция ЭПО, 50 МЕ/кг 2,5±0,07у 5. Контроль + глибенкламид, 5 мг/кг 2,2±0,06 6. Коррекция ДИП + глибенкламид, 5 мг/кг 2,1±0,08 7. Коррекция ЭПО, 50 МЕ/кг + глибенкламид, 5 мг/кг 2,2±0,09 8. Коррекция эмоксипином, 2 мг/кг(n=10) 2,3±0,09 у
Предварительное введение глибенкламида в группах животных с коррекцией ЭПО и ДИП приводило к снижению коэффициента b/a до значений, достоверно отличающихся от показателей группы интактных животных, что говорит о блокаде АТФ-зависимых калиевых каналов и подтверждает наличие прекондиционирующих свойств ЭПО в дозе 50 МЕ/кг и ДИП на модели ИС после 1 ч реперфузии.
Проведение ЭРГ через 72 ч реперфузии осуществляли после измерения уровня микроциркуляции в сетчатке экспериментальных животных. Результаты, полученные в ходе исследования, представлены в таблице 3.6.
Коэффициент b/a в группе контроля составил 1,2±0,04 отн. ед., что статистически достоверно отличается от показателей группы интактных животных. Увеличение данного показателя в группах с коррекцией рекомбинантным ЭПО до 2,3±0,06 отн. ед., ДИП – до 2,0±0,08 отн. ед. и эмоксипина до 2,1±0,07 отн. ед. говорит о сохранении электрофизиологической функции сетчатки после моделирования ИС. Таблица 3.6 – Результаты оценки электрофизиологического состояния сетчатки через 72 реперфузии (М±m; n=10). № п.п. ч Экспериментальные группы b/a, отн. ед. 1. Интактные 2,5±0,10у 2. Контроль 1,2±0,04 3. Коррекция ДИП 2,0±0,08у 4. Коррекция ЭПО, 50 МЕ/кг 2,3±0,06у 5. Контроль + глибенкламид, 5 мг/кг 1,2±0,05 6. Коррекция ДИП + глибенкламид, 5 мг/кг 1,2±0,04 7. Коррекция ЭПО, 50 МЕ/кг + глибенкламид, 5 мг/кг 1,2±0,06 8. Коррекция эмоксипином, 2 мг/кг(n=10) 2,1±0,07 у
Введение глибенкламида в группах крыс с коррекцией ЭПО и ДИП приводило к снижению коэффициента b/a до значений, достоверно отличающихся от группы интактных крыс, что говорит о блокаде АТФ-зависимых калиевых каналов и подтверждает наличие прекондиционирующих свойств ЭПО в дозе 50 МЕ/кг и ДИП на модели ИС после 72 ч реперфузии.
Снижение коэффициента b/a у животных с моделированием ишемии (контроль) вызвано угнетением позитивной волны b ЭРГ, что говорит о нарушении электрофизиологической функции биполяров и мюллеровских клеток с возможным вкладом горизонтальных и амакриновых клеток. Сохранение электрофизиологической функции слоя фоторецепторов подтверждено отсутствием изменений в негативной волне a. Пример угнетения волны b электроретинограммы представлен на рисунке 3.13.
Оценка морфометрических изменений в сетчатке лабораторных животных
На сегодняшний день актуальным является изучение эндогенных механизмов, посредством которых организм защищает себя от ишемии и восстанавливается после ее повреждающего действия. Этим объясняется возрастающий интерес учёных к явлению ишемического прекондиционирования, суть которого состоит в том, что короткие подпороговые периоды ишемии активируют эндогенные защитные механизмы, снижающие степень повреждения клеток в результате последующего продленного ишемического эпизода. Исследования последних лет показали, что одного эпизода преходящей ишемии достаточно, чтобы вызвать прекондиционирование. Защитные свойства проявляются уже через 5 мин реперфузии. Тогда наступает первая защитная фаза. Продолжительность её – 1–2 часа. Затем эффект исчезает и возобновляется в промежуток времени от 24 до 96 ч. Это вторая защитная фаза [4, 124, 155].
Понимание того, что воздействие ишемической атакой на патологически измененную ткань рискованно и не всегда выполнимо, подтверждает целесообразность изучения эффектов ДИП. Еще более перспективным является изучение гуморальных агентов (триггеров) ишемического прекондиционирования, которые способны стимулировать его полезные эффекты без ишемии, то есть вызывать ФП [15].
Гипоксия, возникающая как на местном уровне из-за капиляростаза, микротромбоза и отёка тканей, так и на системном уровне при различной патологии дыхательной и сердечно-сосудистой систем во многом определяет клинические проявления, эффективность лечения и прогноз к выздоровлению. В историческом аспекте пути решения проблемы толерантности тканей к ишемии искали давно. Известно, что различные ткани имеют разную стойкость к гипоксии. Это связывают с особенностями метаболизма конкретного органа [177].
Сетчатка является нервной тканью с высокой метаболической активностью, поэтому она является наиболее чувствительной к изменению концентрации кислорода по сравнению с мозговой тканью, но в отличие от мозговой ткани имеет более длительный период резистентности к гипоксии [26, 207].
Основными факторами развития ИС являются: нарушения общей гемодинамики, локальные изменения в стенках сосудов и коагуляционные и липопротеидные сдвиги в крови. Первый фактор обычно обусловлен ГБ, гипотонией, атеросклерозом, диабетом, окклюзирующими заболеваниями крупных сосудов, болезнями крови. Из локальных изменений наибольшее значение имеют атероматоз сосудов, нарушения эндотелия сосудов [44, 154, 225].
В связи с этим возникает потребность в поиске новых методов ретинопротекции для возможного снижения повреждающего влияния ишемии и реперфузии на сетчатку глаза. Сегмент лекарственных препаратов для лечения болезней сосудистой оболочки глаза как осложнений системных заболеваний целесообразно расширять вследствие роста заболеваемости ими и отсутствия средств для направленной коррекции ишемических повреждений сосудистой оболочки глаза [2].
Так как лекарственные препараты для коррекции ишемических повреждений сетчатки являются неспецифической терапией и не оказывают желаемого результата, то данную проблему можно решить с помощью ФП, которое способно защитить сетчатку от ишемического повреждения.
Роль ДИП и ФП доказана многими авторами на различных органах и тканях организма. Универсальность механизма прекондиционирования дает предпосылки к изучению данного феномена на сетчатке глаза. Одним из наиболее перспективных агентов ФП является ЭПО, его прекондиционирующее действие уже изучено на головном мозге [191], спинном мозге [139], почках [188], тонком кишечнике [185], сердце [199, 95].
Главным фактором, регулирующим продукцию ЭПО, является гипоксия. В ответ на снижение кислорода фактор индукции гипоксии (HIF1) активирует выработку ЭПО. Под влиянием гипоксии количество циркулирующего в плазме эндогенного эритропоэтина возрастает примерно в 1000 раз [20, 146].
Рецепторы ЭПО широко распространены в сердечно-сосудистой системе, включая эндотелиальные, гладкомышечные и другие типы клеток, а негемопоэтические эффекты рекомбинантного ЭПО становятся все более очевидными. В настоящее время ЭПО рассматривают как мощный защитный тканевой цитокин [32].
АТФ-зависимые калиевые каналы, открывающиеся в процессе ишемии, играют центральную роль в механизме цитопротекторного эффекта ИП. Первоначально их активность была выявлена на уровне сарколеммальной мембраны, а позднее на митохондриальном уровне. И те, и другие изоформы ингибируются физиологическими внутриклеточными концентрациями АТФ и открываются, когда существенно снижается концентрация АТФ, то есть действуют как сенсоры (датчики) наличия достаточного количества кислорода и глюкозы (источников АТФ) [41].