Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы 10
1.1. Этиология и патогенез анальной трещины 10
1.2. Методы лечения анальных трещин 12
1.3. Лекарственные средства, применяемые в России для лечения анальных трещин
1.4. Изосорбида динитрит как активная фармацевтическая субстанция и её применение в современной медицине 22
1.5. Значение использования мягких лекарственных форм при лечении анальных трещин 24
Выводы по главе 1 29
Глава 2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Материалы исследования 31
2.1.1. Активная фармацевтическая субстанция - изосорбида динитрат 31
2.1.2 Вспомогательные вещества 32
2.2. Методы исследования 35
2.2.1 Методики количественного определения ИДН в разработанных лекарственных формах 35
2.2.1.1. Методика количественного определения ИДН в геле – ЯМР 1Н 37
2.2.1.1.1. Валидация методики количественного определения – ЯМР 1Н 40
2.2.1.2 Методика количественного определения ИДН в геле- ВЭЖХ 42
2.2.1.3. Методика количественного определения ИДН в креме – ЯМР 1Н 45
2.2.1.3.1. Валидация методики количественного определения ДН в креме – ЯМР 1Н 48
2.3. Определение физико-химических и структурно механических свойств мягких лекарственных форм 50
2.4. Микробиологическое исследование лекарственных форм 53
2.5. Изучение стабильности лекарственных форм 53
2.6. Изучение биологических свойств геля и крема ИДН 54
2.6.1. Исследование биологической безвредности
на отсутствие местно-раздражающего действия 54
2.6.2. Изучение специфической активности заживляющего действия лекарственных форм 55
Выводы по главе 2 57
Глава 3. Разработка состава и технологии геля ИДН 58
3.1. Разработка состава геля ИДН 58
3.1.1. Обоснование выбора концентрации активной фармацевтической субстанции (ИДН) в геле 58
3.1.2. Изучение растворимости ИДН 60
3.1.3. Обоснование выбора вспомогательных компонентов геля 62
3.2. Разработка технологии геля ИДН 70
3.3. Стандартизация и изучение стабильности геля ИДН 74
3.4. Изучение биологических свойств геля ИДН 79
Выводы по главе 3 79
Глава 4 Разработка состава и технологии крема ИДН 80
4.1. Изучение растворимости ИДН в маслах 80
4.2. Обоснование состава крема ИДН 82
4.3 Разработка технологии крема ИДН 88
4.4. Стандартизация и изучение стабильности крема ИДН 92
4.5 Биофармацевтическое сравнительное изучение аппликационных форм ИДН 98
Выводы по главе 4 103
Общие выводы 105
Заключение 106
Практические рекомендации 106
Перспективы дальнейшей разработки темы 106
Перечень условных обозначений 107
Список используемой литературы
- Лекарственные средства, применяемые в России для лечения анальных трещин
- Определение физико-химических и структурно механических свойств мягких лекарственных форм
- Обоснование выбора концентрации активной фармацевтической субстанции (ИДН) в геле
- Биофармацевтическое сравнительное изучение аппликационных форм ИДН
Лекарственные средства, применяемые в России для лечения анальных трещин
При выборе тактики и метода лечения анальных трещин необходимо учитывать локализацию и степень тяжести заболевания, наличие осложнений, выраженность болевого синдрома, тяжесть общего состояния больного и степень его нетрудоспособности, а также планы пациента, касающиеся лечения.
Использование аппликационных мягких лекарственных форм при лечении анальных трещин позволяет локализовать лечебный эффект, что снижает риск возникновения системных побочных эффектов [135].
Мази (Согласно ГФ XIII издания) – это мягкая лекарственная форма (МЛФ), предназначенная для нанесения на кожу, раны и слизистые оболочки. Мази по составу и свойствам различаются на собственно мази, кремы, гели, линименты и пасты. Гели - мази вязкой консистенции, способные сохранять форму и обладающие упругостью и пластичностью. Кремы - мази мягкой консистенции, представляющие собой эмульсии типа масло в воде или вода в масле. Пасты – это мази, которые содержат порошкообразные вещества в количестве 25% и более. Линименты - мази в виде вязкой жидкости [23].
В составе МЛФ используют разные вспомогательные вещества: консерванты, растворители, антиоксиданты, поверхностно-активные вещества, пластификаторы, однако на такие показатели, как стабильность, консистенция лекарственного препарата и высвобождение лекарственных субстанций большую роль играет основа. К основам предъявляют следующие требования: они должны быть химически индифферентны, не вызывать аллергий, не нарушать физиологических функций кожи, хорошо фиксироваться и равномерно распределяться, так же должны легко удаляться с той поверхности на которую наносятся [3].
Многие работы были посвящены изучению влияния вспомогательных веществ на качество МЛФ [5, 21, 26]. В этих работах было отмечено, что изготовление МЛФ с использованием полимерных основ, имеет множество преимуществ перед традиционными основами. Лекарственная субстанция более полно и равномерно высвобождается из мазей с гидрофильными основами. Полимерные основы хорошо распределяются по кожной поверхности и слизистым. Эмульсионные и гелевые основы на полимерах образуют гладкие тончайшие пленки при нанесении на кожу, что способствует пролонгированию действия этих препаратов. Разрешённые для применения, в фармации, полимерные основы хорошо удаляются водой и не имеют раздражающие и токсические действия [2, 3, 26].
Гели это системы потерявшие текучесть, которые образуются в результате действия молекулярных сил сцепления между макромолекулами или коллоидными частицами полимеров, а растворитель заполняет ячейки пространственных сеток в геле. Механизм гелеобразования заключается в возникновении сетчатой структуры в результате образования связей между молекулами и между надмолекулярными структурами по всей системы. При этом надмолекулярные структуры могут быть частицами новой фазы концентрированного полимера в разбавленном растворе полимера. Гель – это переходное состояние двухкомпонентной системы (полимер-растворитель) с резким увеличением вязкости и потерей текучести [3, 5].
Гели можно делить на: разбавленные и концентрированные, гидрогели и олеогелии. Гидрогели (гидрофильные гели) как правило, готовятся на основах, которые состоят из гидрофильного гелеобразователя (производные целлюлозы, карбомеры, трагакант и другие), и из воды, или из сочетания воды с другими гидрофильными растворителями (спирт этиловый, пропиленгликоль, глицерин, спирт изопропиловый) [57].
Олеогелии (гидрофобные гели) приготовлены на основах, которые состоят из гидрофобного растворителя (растительное масло или вазелиновое и др.) и гидрофобного гелеобразователя (диоксид кремния, полиэтилен и другие) [55, 57].
Крем- это мягкая лекарственная форма, которая состоит из двух несмешивающихся между собой систем.
В основе крема, присутствует дисперсионная фаза, которая равномерна должна распределиться в дисперсионной среде. Исходя из типа эмульсии, кремы бывают: кремы типа масло в воде, и кремы типа вода в масле. При этом дисперсионная фаза находится в дисперсионной среде в виде тончайших капель – размером 0,2-0,5 мкм. В случае, когда размер капель превышает 0,5 мкм, образуется нестабильная эмульсия, которая нуждается в эмульгаторе. Эмульгатор располагаясь на межфазной поверхности снижает свободную поверхностную энергию частиц [14, 23, 57].
По назначению, кремы классифицируют на: медицинские и косметические, по консистенции на: мягкие и жидкие косметические (косметическое молочко), по типу основы на: кремы с гидрофильными основам с гидрофобными основами и с дифильными основами [14, 57, 58, 59].
В качестве гидрофобных основ используют животные жиры, рыбий жир, жир свиной и др.), растительные масла (оливковое, касторовое и др.), углеводороды (вазелиновое масло, вазелин, парафин и др.) и смесь этих основ [58, 59].
Определение физико-химических и структурно механических свойств мягких лекарственных форм
Микроскопическое исследование проводилось с целью подтверждения растворения субстанции в основах геля и крема и для подтверждения гомогенности лекарственных форм. Изучение проводили с помощью микроскопа «Ломо, МИКМЕД – 1» с объективами 9; 10; 40; окуляром 10х и бинокулярной насадкой 2,5х. Микропрепарат субстанции готовили согласно ОФС.1.2.1.0009.15 «Оптическая микроскопия». Порошок с помощью шпателя помещали на предметное стекло в каплю раствора глицерин-вода (1:1), накрывали покровным стеклом.
Для приготовления микропрепаратов геля, образец наносили на предметное стекло и накрывали покровным. Микропрепараты крема готовили двумя способами: первый способ аналогичен приготовлению препаратов геля, второй способ заключался в разбавлении образцов. Для этого на предметное стекло наносили каплю дистиллированной воды, в нее помещали каплю образца и препаровальной иглой смешивали крем с водой, затем накрывали покровным стеклом. Такая пробоподготовка позволила рассмотреть микроструктуру крема. Микрофотосъемку выполняли с помощью цифрового фотоаппарата Pentax Optio A30 на микроскопе с различными объективами. Фотографии обрабатывали в программе Photoshop CS3. Результаты исследования представлены в главе 3 и 4.
Определение рН 10 % водной дисперсии геля и крема Значение рН 10% водных извлечений из геля и крема с ИДН определяли потенциометрически на pH-метре «Mettler Toledo» S 80-К в соответствии с требованиями ГФ ХIII, ОФС.1.2.1.0004.15 «Ионометрия, пункт 3-Потенциометрическое определение рН».
Одним из основных критериев, которые определяют стабильность и качество лекарственных препаратов является микробиологическая чистота. Исследование микробиологической чистоты проводили по ГФ XIII, ОФС 1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота.
Для геля и крема использовали требования категории 2: в 1 г препарата допускается не более 100 аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов суммарно, при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Результаты данного изучения представлены в главах Зи 4.
Процессы, которые происходят в процессе хранения лекарственных препаратов, могут сопровождаться изменением физических свойств, химического состава и частичной или полной потерей их фармакологического действия. Исходя из этого, изучение стабильности лекарственных препаратов при хранении является обязательным требованием при их разработке [46, 55].
Исследования стабильности геля ИДН 0,5% и крема ИДН 0,5% в процессе хранения проводились по следующим показателям: масса содержимого упаковки; микробиологическая чистота. Результаты данных исследований представлены в главах 3 и 4, соответственно.
Биологические исследования по оценке безопасности при местном использовании и заживляющего действия готовых препаратов «гель ИДН 0,5%» и «крем ИДН 0,5%» проведены в Центре доклинических и клинических исследований ЦКП (НОЦ) РУДН. Благодарим Директора Центра диагностических исследований ЦКП(НОЦ) РУДН, канд. ветер.наук, доцента Карамян А.С. за помощь и содействие. Исследования выполнялись согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации № 708н от 23.08.2010, Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (GLP) и «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1,2012 г.».
Эксперименты выполнялись на животных (крысы с массой 180-200 г.) поступивших из питомника «Кролинфо».
Для исследования местно-раздражающего действия разработанных лекарственных форм, животные были разделены на 4 группы, каждая группа состояла из 10 животных (самки и самцы). Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по весу тела (± 20%). С целью данного изучения, разработанные препараты и препараты сравнения (плацебо-основа) наносили на слизистую прямой кишки животных. Для первой группы был использован препарат «ИДН гель 0,5%», для второй группы «ИДН крем 0,5%», для третей группы «Плацебо-гель» и для четвертой «Плацебо-крем». Составы препаратов сравнения (плацебо) представлены в таблице 2.8.
Изучение заживляющего действия разработанных лекарственных форм проводилось на патологической модели повреждений слизистой прямой кишки со сформированной анальной трещиной у лабораторных животных. Создание травматической модели анальной трещины осуществляется следующим образом: по задней стенке анального канала в области перехода кожи в анодерму в подслизистую оболочку анального канала вводится 0,7 мл раствора, состоящий из смеси: 2 частей скипидара и 1 части 2% раствора новокаина. Образованный вдоль анального канала инфильтрат прошивают шелком стежком длиной 10 мм и глубиной 2-3 мм до внутреннего сфинктера. Концы нитей плотно завязывают для прорезывания тканей. Дополнительно под шов на глубину 0,5- 0,7 мм вводится 0,3-0,4 мл смеси раствора скипидара с новокаином. Лигатура в течение двух недель прорезывается и формируется продольная язва анального канала; дно и края которого представлены фиброзной тканью.
Обоснование выбора концентрации активной фармацевтической субстанции (ИДН) в геле
Разработка технологии геля ИДН 0,5% основана на преодолении проблем растворимости субстанции ИДН и необходимости обеспечить равномерное, полное набухание РАП в максимальной полярной среде – воде. Наблюдения за особенностями процесса растворения ИДН при подборе системы растворителей привели к выработке последовательности технологических операций, заключающейся в первичном растворении ИДН в ПЭГ-400, а затем во избежание потерь в процессе медленного растворения, добавлении спирта этилового 95%. Водную составляющую системы растворителей целесообразно использовать для полноценного набухания гелеобразователя.
Предложенная технология получения геля ИДН отражена в принципиальной технологической схеме (рисунок 3.7).
Технологическая схема отражает подготовительный этап и сам процесс получения геля ИДН 0.5%. Подготовительный этап производства включает: изготовление растворов для дезинфекции, так же подготовку производственных помещений, необходимого оборудования, персонала и упаковочного материала (тубы).
Начальным этапом приготовления геля ИДН является подготовка активной фармацевтической субстанции и основы. Подготовка АФС включает следующие операции: приёмка субстанции; оценка качества субстанции по показателям ФС; отвешивание АФС.
В производственной ёмкости готовят раствор ИДН в системе ПЭГ-400: спирт этиловый 95%, путём отвешивания рассчитанного количества ПЭГ-400 и ИДН затем перемешивают до образования раствора, далее туда добавляют необходимое количество СЭ 95%. ТП 5. Приготовление смеси "Аресаол: вода"
Рассчитанное количество ВО отмеривают в производственную ёмкость, затем на поверхность воды добавляют Ареспол и оставляют для набухания в течение 5 часов, после этого смесь, с помощью турбинной мешалки, перемешивают, при скорости 8000 об/мин, до образования равномерной дисперсии. ТП 6. Приготовление геля Ареспола При перемешивании высокоскоростной мешалкой типа (Ultraurrax, скорость 8000 об\мин), к полученной дисперсии Ареспола добавляют необходимое количество ТЭА, для нейтрализации среды до значения рН (7,0 ±0,5). Под влиянием ТЭА происходит загущение данной системы. ТП 7. Приготовление геля ИДН
Раствор ИДН добавляют к гелю Аресаола, затем с помощью (Ultraurrax) перемешивают (скорость перемешивания 8000 об\мин) до момента получения однородного геля.
После этого, полученный гель ИДН по 30,0 г фасуют в алюминиевые тубы (ТУ- 64-7-678-90) с внутренним лакированным покрытием на основе клея БФ-2 (ГОСТ 12-172-74). Гель ИДН, по внешнему виду, представляет собой однородную, прозрачную, гелеобразную массу, с пузырьками воздуха без посторонних механических включений. ВР 2.1. Санитарная подготовка помещений
Ареспола. Технология разработанного геля ИДН характеризуется достаточной воспроизводимостью. Гель однородный, бесцветный, прозрачный. Легко наносится на место аппликации, не обладает липкостью, не пачкает одежду, стабилен при хранении.
Стандартизация лекарственного препарата подразумевает обоснование номенклатуры показателей качества, разработку методик пробоподготовки и их определения, а также создание проекта НД, в соответствии с которым исследуется стабильность лекарственного препарат в процессе хранения для установления срока годности в определенном виде упаковки.
Номенклатура показателей качества геля ИДН соответствует требованиям ГФ ХIII.
Подлинность и количественное содержание ИДН устанавливали с помощью разработанной валидированной методики ЯМР- Н1 изложенной в главе 2.
С целью определения рН 10 % водного извлечения геля ИДН в соответствии с требованиями ГФ ХIII, ОФС.1.2.1.0004.15 «Ионометрия, пункт 3-Потенциометрическое определение рН», были проанализированы образцы геля, изготовленные в разные сроки, что позволило нормировать значение рН 7,0±0,5 .
Однородность и стабильность структурированных систем, таких как гель нуждается в подтверждении на этапах изучения в процессе хранения. С этой целью была исследована микроструктура геля ИДН 0,5% подтверждающая факт присутствия действующего вещества в растворенном виде. Для этого, помимо микропрепаратов геля, были приготовлены микропрепараты субстанции ИДН. Методика описана в главе 2 (раздел 2.4).
Биофармацевтическое сравнительное изучение аппликационных форм ИДН
Как видно из графиков рисунка 4.10., отражающих профиль высвобождения ИДН из разработанных геля и крема, скорость высвобождения ИДН из геля выше, поскольку выход 32% лекарственного вещества достигается в течение первых 20 минут, что примерно в два раза выше чем аналогичных показатель у крема - 18% ИДН. В целом максимальная полнота высвобождения ИДН достигается в течение 60 минут и составляет из геля и крема, 77 и 59% соответственно. Увеличение времени эксперимента нецелесообразно, поскольку взаимодействие аппликационных лекарственных форм с местом нанесения и время ожидаемого ощутимого эффекта ограничивается несколькими минутами.
Таким образам, профиль кинетической кривой и опережающий выход ИДН из геля подтверждает целесообразность выбранных форм и предлагаемую тактику их использования в комплексной терапии АТ, заключающуюся в назначении геля для купирования болевых ощущений при острой фазе и поддерживающей терапии кремом для заживления дефекта слизистой.
Для подтверждения специфической активности и отсутствия местного раздражающего действия было проведено сравнительное исследование на лабораторных животных, по методикам описанным в главе 2.
Через 24 часа после первого введения изучаемых аппликационных препаратов и непосредственно перед следующей процедурой ни в одной из групп не были отмечены и зарегистрированы появление экссудата, изменений внешнего вида видимых слизистых оболочек и у животных в целом, не было признаков эритем и раздражений.
Исследование раздражающего действия на слизистые и мышечные ткани прямой кишки проводилось патоморфологически. Данные представлены в таблице 4.7.
Согласно изложенным результатам в таблице 4.7, видно, что в опытных группах животных, получавших препараты ИДН гель 0,5% и ИДН крем 0,5%, результаты оценки местно-раздражающего действия на слизистую поверхность и мышечную ткань прямой кишки не отличались от результатов групп животных получавших соответствующие препараты-плацебо. Таким образом, по показателям местно-раздражающего действия можно говорить, что препарат ИНД гель 0,5% препарат ИДН крем 0,5% не обладают местно-раздражающим действием. Разность средних баллов, полученных для опытных и контрольных групп, даёт индекс раздражения, установленный индекс раздражения был равен 4 и трактуется как минимальный.
Для подтверждения заживляющего действия у разработанных аппликационных лекарственных форм ИДН проведена сравнительная оценка специфической активности на патологической модели повреждений слизистой прямой кишки со сформированной анальной трещиной у лабораторных животных. Методика исследования описана в главе 2.
Ранозаживляющий эффект геля и крема ИДН, геля и крема плацебо по сравнению с контролем оценивали морфологически в течение трех недель. Первая группа была контрольной, рана оставалась открытой, заживление раны происходило самостоятельно. Экспериментальным группам крыс сразу после формирования патологической модели анальной трещины наносили изучаемое средство в количестве около 0,01 г и затем ежесуточно. Во второй группе на рану наносили гель ИДН 0,5%, в третьей плацебо-гель. В четвертой группе на рану наносили крем ИДН 0,5%, в пятой крем-плацебо.
Измерение площади раны осуществляли 1 раз в 5 суток. Об эффективности применения средств судили на основании наблюдений за динамикой процессов заживления ран. Оценивали общее состояние животных, наличие или отсутствие воспалительного процесса.
Результаты проведенного сравнительного изучения заживляющей способности показали, что местное применение препарата «ИДН гель 0,5%» сокращает сроки регенерации и увеличивает скорость заживления ран почти в 3 раза относительно контроля и в 2 раза относительно плацебо. В случае препарата «ИДН 0,5%, крем» установлена высокая ранозаживляющая способность, его использование сокращает сроки регенерации и увеличивает скорость заживления ран в 2 раза относительно контроля. Заживление ран после применения образцов геля и крема с ИДН на 3-е сутки происходило более эффективно относительно плацебо.
Для выявления морфологических особенностей процесса заживления и способности исследуемых препаратов влиять на клеточный состав и качественно количественное заполнение межклеточного вещества в самих рубцах были проведены гистоморфологические исследования, результаты которых обнаружили преобладание пролиферативных процессов в регенерирующей ткани, которые приводят к образованию очаговых клеточных инфильтратов с разрастанием грануляционной и волокнистой соединительной ткани. Таким образом, сравнительное биофармацевтическое исследование разработанных аппликационных лекарственных форм с ИДН для лечения АТ показало высокую степень фармацевтической доступности действующего вещества и объективность рекомендаций использования геля ИДН 0,5% для острой фазы и крема ИДН 0,5% для окончательного заживления. Результаты оценки применения разработанных лекарственных препаратов у лабораторных животных показали безопасность местного использования и высокую репаративную эффективность при лечении анальной трещины на патологической модели.