Введение к работе
Актуальность работы. Микробиота является важным экстракорпоральным органом человека, влияющим на все стороны его жизнедеятельности. При нарушении количественного и качественного состава нормальных микробиоценозов (дисбактериозе) одновременно происходят трофические и гормональные нарушения, изменяется иммунный статус организма. Состояния дисбактериоза лежат в основе возникновения и развития многих инфекционных и соматических заболеваний человека. Поэтому терапевтическая тактика лечения большинства заболеваний должна включать применение специальных препаратов, предназначенных для восстановления нормальных микробиоценозов.
Причин нарушения равновесия кишечной микрофлоры много, одной из них является прием антибактериальных препаратов, которые подавляют рост и развитие не только патогенных микроорганизмов, но и представителей нормофлоры. В этой связи исключительно важен поиск новых лекарственных препаратов для лечения инфекционных заболеваний путем элиминации из микробиоценозов патогенных штаммов и/или снижения уровня их патогенности без отрицательного воздействия на макроорганизм.
Основным способом коррекции дисбактериозов является прием пробиотических и пребиотических препаратов. Первые из них содержат живые микроорганизмы или вещества микробного происхождения, вторые – вещества немикробного происхождения, стимулирующие рост и повышающие пробиотический потенциал «полезных» представителей нормофлоры. Результат применения подобных препаратов обычно положительный, однако все происходящие изменения в микробиоценозе носят неконтролируемый характер.
В настоящее время к группе наиболее перспективных для регуляции равновесия кишечной микрофлоры относятся препараты на основе бактериальных метаболитов. Однако российский фармацевтический рынок ограничен всего двумя препаратами, которые производятся в ЕС: жидкий пробиотик «Хилак форте», содержащий молочную кислоту и продукты обмена веществ трех представителей нормальной микрофлоры и таблетированный синбиотик «Закофальк», содержащий масляную кислоту и инулин.
Отечественных лекарственных препаратов на основе бактериальных экзометаболитов, регулирующих нарушения состава микрофлоры кишечника и предназначенных для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, в настоящее время не существует.
Цель и задачи исследования
Целью работы является разработка состава и технологии биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов, предназначенных для подавления роста патогенных бактерий и снижения уровня их патогенности, для стимуляции роста и повышения пробиотического потенциала нормофлоры, а также разработка технологии производства комплексов в виде капель и раствора для приема внутрь.
В процессе выполнения работы были поставлены следующие основные задачи:
-
Исследовать состав и динамику низкомолекулярных карбоновых кислот и аминокислот:
а) в процессе роста штаммов E.coli М-17, VL613, №14, О75 и S. enteritidis var.Issatchenko;
б) в процессе роста и инкубации штаммов молочнокислых бактерий Bifidobacterium bifidum 1 и Lactobacillus plantarum 8P-A3;
в) в процессе роста смешанных культур E.coli M-17 и E.coli О75, M-17 и №14, M-17 и S. enteritidis.
-
Изучить действие экзометаболитов на рост E.coli М-17, VL613, №14, О75 и S. enteritidis.
-
Разработать технологию биологически активных комплексов на основе экзометаболитов бактерий.
-
На основе синтетических аналогов экзометаболитов разработать комплекс, подавляющий рост и понижающий уровень патогенности патогенного штамма E.coli О75.
-
На основе синтетических аналогов экзометаболитов разработать биологически активный комплекс, стимулирующий рост пробиотического штамма E.coli VL613.
-
Провести микробиологические и молекулярно-биологические исследования активности комплексов бактериальных экзометаболитов.
-
Разработать технологию производства биологически активного комплекса для подавления роста патогенного штамма E.coli О75 в виде капель для приема внутрь.
-
Предложить показатели качества комплекса бактериальных экзометаболитов для подавления роста и патогенности E.coli O75 в виде капель для приема внутрь и на основании полученных результатов разработать проект фармакопейной статьи предприятия.
-
Разработать технологию производства биологически активного комплекса для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613 в виде раствора для приема внутрь. Предложить показатели качества комплекса и на основании полученных результатов разработать проект технических условий.
Научная новизна
Впервые проведен комплексный анализ состава метаболитов, выделяемых бактериями семи штаммов: E.coli М-17, VL613, №14, О75, S. enteritidis var.Issatchenko, B. bifidum 1, L. plantarum 8P-A3. Идентифицировано более 40 соединений.
Исследована динамика внеклеточных карбоновых кислот и аминокислот в процессе культивирования E.coli М-17, VL613, №14, О75, S. enteritidis var.Issatchenko, B. bifidum 1, L. plantarum 8P-A3. Установлено, что растущая культура активно обменивается экзометаболитами со средой, выделяя их на одних стадиях и поглощая на других, при этом концентрация экзометаболитов (карбоновых кислот) коррелирует со скоростью их роста.
Проведен анализ изменений состава и динамики внеклеточных карбоновых кислот при выращивании смешанных культур E.coli М-17 и О75, М-17 и №14, М-17 и S. enteritidis по сравнению с чистыми культурами. Установлено, что смешанные культуры значительно отличаются от чистых по динамике и концентрации карбоновых кислот.
Показано, что экзометаболиты стимулируют, подавляют либо не оказывают влияния на рост культур E.coli М-17, VL613, №14, О75, S. enteritidis var.Issatchenko.
Впервые разработана технология биологически активных комплексов на основе синтетических аналогов экзометаболитов. Показано, что при получении комплексов может использоваться два подхода. Первый подход основан на анализе активности предварительно идентифицированных экзометаболитов и их сочетаний, второй подход – на использовании в качестве прототипа состава внеклеточной среды с требуемой активностью.
Впервые на основе синтетических аналогов экзометаболитов бактерий разработан биологически активный комплекс, предназначенный для подавления роста патогенного штамма E.coli О75 и обладающий антипатогенной активностью в отношении токсина гемолизина А;
Зарегистрирована заявка на патент «Средство, ингибирующее жизнедеятельность бактерий Escherichia coli О75 №5557» № 2012140940 от 26.09.2012.
Показана возможность использования разработанных подходов для создания комплекса, предназначенного для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613, повышения его антагонистической активности и устойчивости к стрессовым факторам.
Практическая значимость
-
Разработанные подходы позволяют создавать аналогичные комплексы для регуляции роста продуцентов биологически активных веществ; а также лекарственные препараты с антипатогенной активностью.
-
Разработана технология производства биологически активного комплекса для подавления роста и снижения уровня патогенности штамма E.coli О75 в виде капель для приема внутрь, позволяющая добиться эффективного смешения восьми экзометаболитов в соотношении от 0,15 до 77 %. Предложены показатели качества и разработан проект фармакопейной статьи предприятия.
-
Материалы по составу и динамике экзометаболитов семи штаммов бактерий; подходы к конструированию биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии (СПХФА) при изучении дисциплины «Технология продуктов микробного синтеза» (акт внедрения от 14.12.2012).
-
На базе ООО «Биотроф» показана возможность включения в рацион животных совместно с биопрепаратом на основе штамма E.coli VL613 комплекса бактериальных экзометаболитов для стимуляции роста данного штамма. Совместное использование биопрепарата и комплекса в концентрации 10 мкг/голову позволило уменьшить дозировку биопрепарата в 4 раза. Кроме того, среднесуточный привес массы у животных, получавших совместно с биопрепаратом комплекс экзометаболитов, увеличился на 10 % по сравнению с приростом в контрольной группе (акт апробации от 09.01.2013г.).
Апробация работы
Основные результаты исследований были доложены на межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященной 90-летию СПХФА (СПб, 2009), 6-й объединенной научной сессии и 2-ом Международном конгрессе по пробиотикам «Санкт-Петербург-Пробиотики-2009» (СПб, 2009), 12-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2010» (СПб, 2010), 1-ой европейской студенческой конференции по микробной коммуникации «1st European Student Conference on Microbial Communication» (Йена, Германия, 2010), 15-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010), Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация – потенциал будущего» (СПб, 2010, 2011, 2012), 13–ом Славяно-балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро - 2011» (СПб, 2011), Х–ом съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), 9-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (СПб, 2012).
Публикации
Основное содержание диссертации представлено в 18 публикациях, в том числе 5 статей в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованный ВАК РФ.
Связь задач исследования с планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России «Получении и изучение фармакологического действия биологически активных веществ (БАВ) с целью создания инновационных лекарственных средств» (№01201252027 государственной регистрации) и планом научно-исследовательских работ Гос.НИИ ОЧБ ФМБА России.
Основные положения, выносимые на защиту:
Штаммоспецифичность качественного и количественного состава экзометаболитов, а также их действия на рост бактериальных культур.
Технология биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов.
Разработка состава и технологии биологически активного комплекса бактериальных экзометаболитов, предназначенного для подавления роста и экспрессии гена фактора патогенности патогенного штамма E.coli О75.
Разработка состава и технологии биологически активного комплекса бактериальных экзометаболитов для стимуляции роста и повышения пробиотического потенциала пробиотического штамма E.coli VL613.
Технология производства и показатели качества комплексов в виде капель и раствора для приема внутрь.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста, включает 35 таблиц, иллюстрирована 26 рисунками и состоит из введения, обзора литературы по теме исследования и 5 глав экспериментальных исследований, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы, насчитывающего 142 источника, из них 70 на иностранном языке.
