Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы Современные вспомогательные вещества в производстве мягких лекарственных форм 13
1.2 Применение продуктов пчеловодства в комплексной терапии различных заболеваний 18
1.3 Воспалительные заболевания половых органов в гинекологии 23
1.3.1 Воспалительные заболевания у женщин. Классификация 23
1.3.2 Этиология и патогенез воспалительных заболеваний женской половой сферы 25
1.3.3 Современные методы лечения воспалительных заболеваний в гинекологии 27
1.4 Острая респираторная вирусная инфекция 29
1.4.1 Этиология и патогенез острых респираторных вирусных инфекций 29
1.4.2 Современные методы лечения острых респираторных вирусных инфекций 31
Выводы к главе 1 33
Глава 2 Материалы и методы исследований 35
2.1 Материалы исследования 35
2.2 Методы исследования 37
Выводы к главе 2 57
Глава 3 Разработка состава, технологии приготовления и биофармацевтические исследования суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса 58
3.1 Анализ рынка лекарственных препаратов в Башкортостане, применяемых для лечения воспалительных заболеваний женских половых органов 58
3.2 Разработка составов суппозиториев, содержащих экстракт мелонеллы и экстракт прополиса. Оценка их качества
3.3 Технологическая схема получения суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса 85
3.4 Изучение фармацевтической доступности in vitro суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса методом равновесного диализа 88
3.5 Структурно-механические свойства суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса 90
3.6 Определение высыхаемости суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса 97
3.7 Оценка in vitro вагинальных суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса по степени распределения по слизистой 99
3.8 Оценка in vitro суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса по степени стекания в модельной среде 100
3.9 Определение адсорбционной активности суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса 102
3.10 Стандартизация экстракта мелонеллы 103
3.11 Стандартизация экстракта прополиса 106
3.12 Стандартизация суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса 108
3.13 Определение стабильности и сроков годности суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса 113
3.14 Определение антибактериальной активности суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса 115
3.15 Определение микробиологической чистоты суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса 118
3.16 Определение антиоксидантной активности экстракта мелонеллы и экстракта прополиса, а также их суппозиториев 119
3.17 Определение способности экстракта мелонеллы и экстракта прополиса и суппозиториев к торможению перекисного окисления липидов 122
Выводы к главе 3 125
Глава 4 Разработка состава, технологии приготовления и биофармацевтические исследования мази «Антивир» с экстрактоммелонеллы и экстрактом прополиса 127
4.1 Анализ рынка лекарственных препаратов в Башкортостане, применяемых для лечения и профилактики воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей (назальные ЛФ) 127
4.2 Разработка состава комплексной мази «Антивир», содержащей экстракт мелонеллы и экстракт прополиса 132
4.2.1 Определение оптимального состава мазевой основы по степени высвобождения действующих веществ in vitro методом тонкослойной хроматографии 137
4.2.2 Определение осмотической активности мазей 139
4.3 Технологическая схема получения назальной мази «Антивир» с экстрактами мелонеллы и прополиса 140
4.4 Определение биодоступности мази «Антивир» методом диффузии в гель 142
4.5 Структурно-механические свойства мази «Антивир» с экстрактами мелонеллы и прополиса 143
4.6 Определение высыхаемости основ и мазей 147
4.7 Определение адсорбционной активности мази «Антивир» 148
4.8 Стандартизация мази «Антивир» с экстрактами мелонеллы и прополиса 150
4.9 Определение стабильности и сроков годности мази «Антивир» 154
4.10 Определение противовирусной активности спиртовых экстрактов мелонеллы и прополиса и мази «Антивир» 156
4.11 Определение антибактериальной активности мази «Антивир» 159
4.12 Определение антиоксидантной активности мази «Антивир» 161
4.13 Определение способности мази «Антивир» к торможению перекисного окисления липидов 164
Выводы к главе 4 165
Заключение 167
Список принятых сокращений 169 Список литературы
- Этиология и патогенез воспалительных заболеваний женской половой сферы
- Методы исследования
- Технологическая схема получения суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса
- Определение осмотической активности мазей
Введение к работе
Актуальность работы. В соответствии с Федеральной целевой программой «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» приоритетным является разработка новых лекарственных препаратов, обладающих эффективностью, высоким профилем безопасности, доступностью для населения и конкурентоспособностью на фармацевтическом рынке [Стратегия развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 года: утв. Приказом Минпромторга России от 23.10.2009 №965].
Продукты пчеловодства имеют высокие терапевтические показатели. Они применяются в различных областях медицины: в отоларингологи в виде спрея «Пропосол» (Россия), в дерматологии мази «Пропоцеум» (Россия), в гинекологии суппозиториев «Мипропол» и «Мипросепт» (Румыния) для лечения воспалительных процессов. Экстракт мелонеллы (ЭМ) обладает противовирусным, противовоспалительным и тонизирующим эффектами. Особый интерес представляют различные комбинации продуктов пчеловодства в одной лекарственной форме.
Потребность в новых средствах, имеющих иммуномодулирующие, репаративные и противовоспалительные эффекты, удовлетворяется не полностью. В связи с этим поиск новых отечественных лекарственных препаратов, произведенных на российском сырье, обладающих антиоксидантной активностью является актуальным.
Обоснованным является применение биологически активных антиоксидантов - ЭМ и
экстракта прополиса (ЭП) - в комплексном лечении воспалительных процессов в
гинекологии, профилактике и лечении острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ)
и гриппа, т.к. так как их противовоспалительный эффект заключается во влиянии на
транспорт АТФазы, фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов, в ингибировании
гиалуронидазы, фосфолипазы А2, циклооксигеназы, гипоксигеназы,
гистидиндекарбоксигеназы и других ферментов, вследствие которых замедляется и уменьшается выделение медиаторов воспаления [Лудянский Э.А., 1994]. Применение указанных экстрактов оказалось весьма эффективным в лечении ряда заболеваний, а имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о широких перспективах расширения показаний для их применения.
Следовательно, разработка мягких лекарственных форм с ЭМ и ЭП в виде суппозиториев для комплексного лечения воспалительных заболеваний в гинекологии и
назальной мази, применяемой с целью профилактики и лечения ОРВИ и гриппа, представляет значительный интерес.
Степень разработанности темы. Рынок мягких лекарственных средств представлен в основном синтетическими препаратами и препаратами, содержащими экстракты растений. Технологические схемы получения мазей и суппозиториев достаточно разработаны, однако отсутствуют сведения о совместном применении различных вспомогательных веществ в сочетании с продуктами пчеловодства. Кроме того, нет данных о совместном применении таких сложных по химическому составу компонентов, как ЭМ и ЭП в одной лекарственной форме.
Цель и задачи работы. Разработка новой технологии мягких лекарственных форм, предназначенных для профилактики, комплексного лечения воспалительных заболеваний в гинекологии, профилактики и комплексного лечения ОРВИ и гриппа.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Разработать и обосновать состав и технологию приготовления, методы анализа суппозиториев и мази, содержащих ЭМ и ЭП;
-
Изучить влияние вспомогательных веществ на показатели качества суппозиториев и мази, содержащих ЭМ и ЭП;
3. Изучить структурно-механические и реологические свойства суппозиториев и
мази, содержащих ЭМ и ЭП;
4. Определить противовирусную биологическую активность мази с ЭМ и ЭП in vivo;
изучить антибактериальную и антиоксидантную биологическую активность суппозиториев
и мази с ЭМ и ЭП in vitro;
5. Определить стабильность и сроки годности разработанных лекарственных форм, содержащих ЭМ и ЭП;
6. Составить проекты нормативной документации в виде фармакопейной статьи предприятия на ЭМ спиртовой, суппозитории «Проложен» и мазь «Антивир».
Научная новизна. На основании технологических и биофармацевтических исследований впервые предложены составы и технология получения мягких лекарственных форм в виде суппозиториев и мази, содержащих ЭМ и ЭП. Разработаны методы анализа и обоснованы показатели норм качества лекарственных форм, установлен их срок годности. Определена биологическая активность суппозиториев и мази: антиоксидантная, антимикробная (суппозитории), противовирусная (мазь).
Научная новизна полученных результатов подтверждена 3 патентами РФ на изобретения: «Способ комплексного лечения неспецифических воспалительных
заболеваний женской половой сферы» № 2481102, «Суппозитории с экстрактом личинок большой восковой моли и экстрактом прополиса для лечения гинекологических заболеваний» № 2429867, «Мазь с экстрактом личинок большой восковой моли и экстрактом прополиса для профилактики и лечения вирусной инфекции» № 2477141.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные экспериментальные данные послужили материалом для создания суппозитория «Проложен» для комплексного лечения воспалительных заболеваний в гинекологии и назальной мази «Антивир» для профилактики и комплексного лечения ОРВИ и гриппа.
По результатам проведенных исследований составлены проекты:
- фармакопейной статьи предприятия «Экстракт мелонеллы спиртовой»;
- фармакопейных статей предприятия на лекарственные формы: «Суппозитории
«Проложен» с ЭМ и ЭП», «Назальная мазь «Антивир» с ЭМ и ЭП»;
- лабораторных регламентов на лекарственные формы «Суппозитории «Проложен» с
ЭМ и ЭП», «Назальная мазь «Антивир» с ЭМ и ЭП».
Полученные данные диссертационной работы включены в учебный процесс кафедры фармацевтической технологии с курсом биотехнологии БГМУ (акт внедрения от 25.12.14 г), кафедры акушерства и гинекологии № 3 БГМУ (акт внедрения от 25.12.14 г), кафедры фармации медицинского факультета Бурятского медицинского университета (акт внедрения от 17.12.14 г), кафедры фармации Южно-уральского государственного медицинского университета (акт внедрения от 30.08.14 г). Дальнейшие исследования по теме диссертационной работы включены в стратегическое планирование развития перспективных научных изысканий Академии наук Республики Башкортостан (справка-подтверждение от 19.01.15 г) и ГАНУ «Центр аграрных исследований» Республики Башкортостан (справка-подтверждение от 19.01.15 г).
Методология и методы исследования. Методология исследования включала оценку различных составов: суппозиториев, мазей на основе современных вспомогательных веществ. Для оценки качества мазей и суппозиториев использовались тесты, характеризующие структурно-механические и реологические свойства: вязкость, текучесть (пластичность), твердость суппозиториев, намазываемость мази. Стабильность лекарственных форм оценивали по показателям качества в условиях естественного хранения в течение 27 месяцев при комнатной температуре (мазь) и в условиях холодильной камеры (суппозитории).
Основные показатели качества разрабатываемых лекарственных форм определяли в соответствии с ГФ XI, XII изданий; содержание ЭМ и ЭП определяли
спектрофотометрически, ТСХ-методом, хемилюминесцентным анализом и биологическим методом.
Качество мягких лекарственных форм оценивали по таким показателям, как внешний вид, средняя масса, растворимость и намазываемость мази. Установление сроков годности препаратов проводили при их хранении в естественных условиях.
Положения, выносимые на защиту
-
Составы и технология получения суппозиториев «Проложен», содержащих ЭМ и ЭП (патент РФ № 2429867, патент РФ 2481102), назальной мази «Антивир» с ЭМ и ЭП (патент РФ № 2477141).
-
Результаты сравнительного исследования влияния вспомогательных веществ на структурно-механические и реологические свойства суппозиториев и мази.
3. Методы анализа разработанных лекарственных форм в виде суппозиториев и мази.
4 Результаты изучения стабильности разработанных лекарственных форм.
-
Результаты изучения фармацевтических и биофармацевтических свойств мягких лекарственных форм с ЭМ и ЭП.
-
Проекты ФСП на экстракт мелонеллы спиртовой, лекарственные средства в форме суппозиториев и мази с ЭМ и ЭП.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов обеспечивалась воспроизводимостью данных, с использованием современных физико-химических, математических методов исследования, большим объемом исследуемой информации.
Основные положения работы апробированы и доложены на: Всероссийской научно-практической интернет-конференции с международным участием «Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм» (Курск, 2011), Всероссийской конференции «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Самара, 2011), XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2011), Международной научно-практической конференции «Пути развития пчеловодства в России через успешный опыт регионов России, стран СНГ и дальнего зарубежья» (Ярославль, 2011), Международной заочной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы науки и образования в 21 веке» (Тамбов, 2012), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012), XVI Международной научной конференции (Венгрия, 2012), 77-й республиканской научной конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической
медицины» (Уфа, 2012), Proceedings of the 1st international academic conference Applied and Fundamental Studies hosted by the Publishing House «Science and Innovation Center»,and the International Journal of Advanced Studies (St. Louis, Missouri, USA, 2012); II международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (Москва, 2012); I съезде терапевтов Забайкальского края (Чита, 2013); Международной научно-практической конференции «Образование и наука: современное состояние и перспективы развития» (Тамбов, 2013); Международной научной конференции "Повышение качества жизни пациентов - тренд современной медицины" (Стерлитамак, 2013); V Всероссийском научно-практическом семинаре с международным участием «Геномные и протеомные технологии при создании новых лекарственных средств» (Волгоград, 2013); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 2013); X международна научна практична конференция, «Найновите научни постижения» (София, 2014); IV межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Проблемы фармацевтической науки и практики» (Владикавказ, 2014); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, «Инновационные технологии в фармации» (Иркутск, 2014); II Всероссийской научной интернет-конференции с международным участием «Спектрофотометрические методы анализа» (Казань, 2014).
Публикации материалов исследования. По теме диссертации опубликованы 44 научные работы, из них 12 научных статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, получено 3 патента на изобретение.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно -исследовательских работ БГМУ по проблеме «Фармакология и фармация» (Номер госрегистрации 01200507996), направлением проблемной комиссии по фармации и фармакологии, а также в рамках программы Академии наук Республики Башкортостан, отделения медицинских наук «Изыскание и изучение новых лекарственных средств» по теме «Разработка составов и технологии лекарственных средств с продуктами пчеловодства».
Личный вклад автора в проведенное исследование и получение научных результатов. Автор диссертационной работы самостоятельно определил план исследования, сформулировал цель и задачи, проанализировал литературу, провел лабораторные исследования и статистическую обработку полученных данных. Научные
положения и выводы диссертации базируются на результатах исследований автора. Доля участия автора в накоплении информации более 85%, в обобщении и анализе - 100%.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 14.04.01 - Технология получения лекарств, а именно пункту 3 - разработка технологий получения субстанции и готовых лекарственных форм, пункту 4 - исследования по изучению особенностей технологии получения готовых лекарственных форм из различных видов субстанций, сырья и вспомогательных веществ, пункту 6 - исследования биофармацевтических аспектов в технологии получения лекарственных средств, их дизайн и изучение факторов, влияющих на биодоступность.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 189 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, а также приложений. Работа содержит 41 таблицу и 40 рисунков. Библиографический указатель включает 159 источников, из них 34 на иностранных языках.
Приложение включает патенты РФ на изобретения, фармакопейные статьи предприятия (проекты) на ЭМ, суппозитории «Проложен», мазь «Антивир», лабораторные регламенты (проекты) на производство разработанных лекарственных форм, акты внедрения в учебный процесс, данные по валидапионной оценке методик количественного определения аминокислот и флавоноидов в ЭМ, ЭП и разработанных лекарственных формах, результаты определения оптимальных суппозиторных и мазевых композиций с использованием методов математического планирования.
Этиология и патогенез воспалительных заболеваний женской половой сферы
В фармацевтической промышленности как наноноситель лекарственных веществ используется неионный детергент лутрол F-68, который подобно другим поверхностно-активным соединениям, встраивается в липидные бислои (биомембраны), увеличивая их проницаемость [93, 113, 146, 149, 154].
Одним из крупнейших производителей полоксамеров является концерн BASF. Он выпускает Poloxamer 407 под торговым названием Lutrol F127 и Poloxamer 188 под названием Lutrol F 68. Основное применение Lutrol F127-это использование в качестве загустителя в гель-формах, в качестве эмульгатора и усилителя вязкости в кремах и жидких эмульсиях. Lutrol F 127 также стабилизирует суспензии для местного и перорального применений и используется при изготовлении зубной пасты и жидкости для полоскания рта. LutrolF 68 применяется как диспергирующее и смачивающее вещество для перорального, местного и парентерального введения лекарственных средств [93, 118, 131, 132, 138, 146, 149, 154, 159].
Полоксамеры (Poloxamers) внесены в Список основных вспомогательных веществ, используемых при производстве лекарственных препаратов (Письмо Росздравнадзора «О контроле качества вспомогательных веществ» от 13.07.2005 №01И-343/05) [93, 113, 134, 156].
Также применимы полоксамеры и при производстве суппозиториев в качестве наполнителей и пролонгаторов лекарственной формы (суппозитории вагинальные «Пимафуцин» производства Astellas Pharma Europe B.V./Yamonouchi, Нидерланды). В качестве основы для суппозиториев и оболочек для вагинальных овулей применяются лутрол Е-400 и лутрол Е-600 совместно с полиэтиленгликолями. Данная смесь применяется при создании таких лекарственных средств как дифенгидрамин, индометацин, парацетамол и ПВП-йодин. Лутрол Е-300, лутрол Е-400, лутрол Е-600 используются в качестве растворителей или сорастворителей в процессах солюбилизации, особенно в гелях и кремах [20, 113, 121, 136, 138].
Cremophor - это неионный солюбилизатор и эмульгатор, который получают из смеси реагирующего касторового масла с окисью этилена в мольном соотношении 1:35. Этот продукт солюбилизирует или эмульгирует растворимые в жирах витамины A, D, Е и К в водных растворах для перорального и наружного введения. В водноспиртовых растворах Cremophor очень легко переводит в растворимую форму эфирные масла. С использованием Cremophor могут быть приготовлены также водные растворы гидрофобных лекарственных препаратов (миконазол, гексетидин, клотримазол, бензокаин) [113, 136].
Выбор вспомогательных веществ играет ключевую роль в разработке лекарственных препаратов ввиду их влияния на конечный фармакологический эффект препарата, реологические параметры, удобства применения и условия хранения. Так, несовместимость компонентов основы и лекарственных составляющих может повлиять на структуру и стабильность лекарственной формы, поэтому ключевой задачей при разработке препаратов является изучение их структурно-механических параметров. Технологические характеристики мягких лекарственных форм и их способность к структурообразованию можно в полной мере оценить определением реологических параметров в процессе возрастания скорости сдвига с последующим ее убыванием. Информативными являются также параметры касательного напряжения сдвига, эффективной вязкости и механической стабильности лекарственной формы. Известно, что площадь петли гистерезиса служит оценкой структурированности системы. Чем зависимость касательного напряжения сдвига от скорости сдвига при ее возрастании с последующим убыванием шире, тем структурированность системы глубже [37, 105, 113]. Первые печатные упоминания об оздоровительных возможностях мелонеллы относятся к XVII веку. Знания о необыкновенных лечебных качествах средств на основе вытяжек из моли на протяжении веков оставались достоянием очень узкого круга пчеловодов и целителей, которые в соответствии с нравами того времени тщательно охраняли секреты. Научная и медицинская общественность узнала о лечебных возможностях вытяжек из мелонеллы в конце XIX века, когда выдающийся российский ученый И.И.Мечников провел исследование этого биоматериала. Обратившись к народному опыту в поисках средств от туберкулеза легких (чахотки), неизлечимого в то время заболевания, И.И.Мечников дал научное объяснение лечебному феномену экстракта мелонеллы, который успешно справлялся с этим заболеванием даже в запущенных случаях. Научная идея И.И.Мечникова состояла в том, что, зная о существовании в туберкулезной бактерии защитной восковой оболочки, он предположил возможность ее разрушения пищеварительными ферментами мелонеллы, питающейся пчелиным воском. В ходе научных исследований его предположение полностью подтвердилось. При этом им было установлено, что старые личинки, готовые к окукливанию, вовсе не переваривают туберкулезные бациллы. Для использования в лечебных целях пригодны только молодые особи, в период их роста, не превышающие размеры 10-15 мм. Попытка И.И.Мечникова создать противотуберкулезную вакцину успехом не увенчалась. Его научные работы были продолжены в России его учениками — профессором С.И.Метельниковым и выдающимся микробиологом И.С.Золотаревым, чья деятельность была прервана в 1937 г.
Методы исследования
Для количественной оценки флавоноидов в лекарственной форме использовали дифференциальную спектрофотомерию на основе реакции с алюминия хлоридом. Около 3 г суппозиторной массы (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, расплавляли на водной бане, прибавляли около 15 мл спирта этилового 95% и взбалтывали в течение 10 минут. Доводили спиртом этиловым 95% до метки, перемешивали и фильтровали, отбрасывая первые порции фильтрата. 5 мл фильтрата переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 5 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, доводили спиртом этиловым до метки, перемешивали и оставляли на 20 минут [8]. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ 56 при длине волны 420 ± 2 нм.
Количество суммы флавоноидов рассчитывали по формуле: С = Ах асТ 25 /(Аст ах), (2.2.15.2) где Ах- оптическая плотность суппозитория; аст - навеска рутина, г; Аст - оптическая плотность стандартного раствора рутина; ах - навеска суппозитория, г. 2.2.16 Стандартизация мази «Антивир» с экстрактами мелонеллы и прополиса
Для идентификации мази с экстрактами мелонеллы и прополиса по сумме аминокислот использовали смесь растворителей бутанол: ледяная уксусная кислота: вода (4:5:1). Около 1 г мази взбалтывали в течение 10 минут с 5 мл горячей воды, фильтровали, отбрасывая первые порции фильтрата. Полученный фильтрат после охлаждения разбавляли спиртом этиловым 95% (1:1). На линию «старта» хроматографической пластинки Сорбфил, снабженной УФ-детектором, наносили микрошприцем 10 мкл полученного раствора. Стандартом служили 0,01% растворы аминокислот. Хроматограмму обрабатывали 1% раствором нингидрина в ацетоне и нагревали.
Для качественного анализа флавоноидов в мази использовали метод хроматографии в тонком слое сорбента, Определение проводили на пластинках Сорбфил, снабженных УФ-детектором. В качестве стандартного образца использовали 0,1% раствор РСО рутина и коричной кислоты. Подвижная фаза -система растворителей, содержащая спирт бутиловый: кислоту ледяную уксусную: воду очищенную (4:3:2). Около 1 г мази взбалтывали в течение 10 минут с 10 мл спирта этилового 95%, фильтровали, отбрасывая первые порции фильтрата. На линию «старта» хроматографической пластинки, наносили микрошприцем 10 мкл полученного раствора. Проявляли хроматограммы в УФ-свете.
Для количественной характеристики мази по сумме аминокислот использовали спектрофотометрический анализ на основе реакции с нингидрином. Для этого около 1 г (точная навеска) мази помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли около 10 мл спирта этилового 95% и взбалтывали около 20 минут, доводили до метки, перемешивали, фильтровали отбрасывая первые порции фильтрата. 5 мл фильтрата переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 1 мл 0,2% раствора нингидрина в спирте этиловом, нагревали на кипящей водяной бане в течение двух трех минут, охлаждали и доводили спиртом этиловым до метки. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ 56 [22].
С целью исключить влияние вспомогательных веществ мази на результаты эксперимента расчет проводили по второй производной спектрофотометрии, используя полиномы Чебышева второй степени при длинах волн 268, 269, 270, 271 и 272 нм. Количество суммы флавоноидов рассчитывали по формуле 2.2.15.1.
Флавоноиды в лекарственной форме количественно определяли с помощью дифференциальной спектрофотомерии на основе реакции с алюминия хлоридом. Определение проводили по методике: около 1 г мази (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли около 10 мл спирта этилового 95% и взбалтывали в течение 10 минут. Доводили до метки спиртом этиловым, перемешивали и фильтровали, отбрасывая первые порции фильтрата. 5 мл фильтрата переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 5 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, доводили спиртом этиловым до метки, перемешивали и оставляли на 20 минут.
Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ 56 при длине волны 420 ± 2 нм. Количество суммы флавоноидов рассчитывали по формуле 2.2.15.2. В качестве мембраны использовали целлофан марки МСАТ-200, с толщиной пленки 0,3 мм. Целлофановую пленку предварительно обрабатывали путем погружения в диализную среду с последующей выдержкой в течение 30 минут. В качестве модельной среды использовали воду очищенную, подкисленную 0,1н соляную кислоту до значения 4,5 - 5,0. Точную навеску 1,0 г измельченных суппозиториев, содержащих 5% экстракта мелонеллы и экстракта прополиса от общей массы основы, равномерно распределяли тонким слоем по всей площади (200 мм ) целлофановой мембраны, закрепленной на диализной трубке. Диализную трубку погружали на 1-1,5 мм в стакан с диализной средой в объеме 30 мл. Пробы диализата в количестве 2 мл отбирали через 15, 30, 45, 60 минут с обязательным восполнением диализной среды при температуре 37С. Количественное содержание высвободившихся действующих веществ (в том числе суммы аминокислот) из основы в диализную среду определяли спектрофотометрическим методом в пересчете на кислоту глутаминовую на приборе СФ-56 и HEWLETT PACKARD 8452А при длине волны 314±2 нм в кювете толщиной слоя 10 мм. В качестве стандартного образца использовали водное извлечение из суппозиторной основы.
При исследовании антиоксидантной активности лекарственных форм, содержащих экстракт мелонеллы и спиртовой экстракт прополиса, использовали метод хемилюминисцеции, при этом исследования проводились в модельной системе.
Регистрацию сверхслабого свечения проводили на приборе хемилюминомере ХЛ-003. Извлечения из лекарственных форм в количестве 0,1 мл добавляли в тест-системы, где генерировались активные формы кислорода (АФК) - процесс, наиболее часто встречающийся в организме. В качестве модельной системы использовали 20 мл фосфатного буфера (20 мМ фосфорнокислого калия, 105 мМ калия хлорида) с добавлением раствора люминола (10"5М) и цитрата натрия (50мМ). Величину рН полученного раствора доводили до 7,45 ед. титрованием насыщенным раствором едкого калия. Для инициирования реакций, сопровождающихся образованием АФК, вводили 1 мл 50 мМ раствора солей железа (II). Регистрация свечения продолжалась в течение пяти минут при постоянном перемешивании.
Технологическая схема получения суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса
В соответствии с полученными результатами данные сопоставимы с полученными ранее количественными характеристиками экстракта мелонеллы, а методика воспроизводима и имеет незначительную погрешность. Таким образом, методика количественного определения аминокислот в суппозиториях составов № 14 и № 35 в пересчете на кислоту глутаминовую валидирована по параметрам: правильность, прецизионность (сходимость и воспроизводимость), специфичность, линейность и диапазон.
Для количественной оценки флавоноидов в лекарственной форме использовали дифференциальную спектрофотомерию на основе реакции с алюминия хлоридом. Определение проводили по методике: около 3 г суппозиторной массы (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, расплавляли на водяной бане, прибавляли около 15 мл спирта и взбалтывали в течение 10 минут Доводили спиртом этиловым до метки, перемешивали и фильтровали, отбрасывая первые порции фильтрата. 5 мл фильтрата переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 5 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, доводили спиртом этиловым до метки, перемешивали и оставляли на 20 минут [8].
Дифференциальный спектр поглощения извлечения из суппозиторной массы совпадал по положению максимума РСО рутина (при длине волны 420 ± 2 нм), что позволило проводить количественное определение флавоноидов в лекарственной форме в пересчете на рутин (таблица 3.12.2).
Для разработанной методики количественного определения флавоноидов в лекарственной форме проведена валидационная оценка, описанная в придожении И [16, 59, 140, 141].
Таким образом, методика количественного определения флавоноидов в суппозиториях в пересчете на рутин валидирована по параметрам: правильность, прецизионность (сходимость и воспроизводимость), специфичность, линейность и диапазон. Определение стабильности и сроков годности суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса
Одним из важнейших требований, предъявляемых к лекарственным препаратам, является их стабильность в процессе хранения. Стабильность лекарственного средства и его качество тесно связаны между собой. Исследование стабильности лекарств в зависимости от различных факторов, установление оптимальных сроков годности - одна из важнейших проблем фармации.
Качество образцов проверялось после их приготовления и через 3, 6, 12, 18, 24 и 27 месяцев хранения. В процессе хранения изучались следующие показатели: однородность, подлинность, количественное содержание, время растворения, кислотное, йодное числа.
Подлинность и количественное содержание суммы флавоноидных и фенольных соединений, аминокислот, время растворения, а также определение качественных числовых показателей проводили по методикам, приведенным в п. 2.2.12, 2.2.13, 2.2.14, 2.2.18, 2.2.19, 2.2.20, 2.2.21. Результаты исследований приведены в таблице 3.13.1.
Анализ данных, приведенных в таблице 3.13.1, показал, что при хранении суппозиториев описанных составов в герметичных полиэтиленовых (контурно-ячейковых или блистерных) упаковках в течение срока наблюдения все основные показатели их качества существенно не меняются, на хроматограммах не обнаружено дополнительных пятен продуктов разложения экстракта прополиса и экстракта мелонеллы. Соответственно, суппозитории целесообразно хранить в течение двух лет в герметичных контурно-ячейковых или блистерных упаковках.
Определение антибактериальной активности суппозиториев с экстрактом мелонеллы и экстрактом прополиса
При возникновении воспалительных процессов в гинекологии основными возбудителями заболевания являются бактериальные агенты неспецифической этиологии, такие как стафилококки, кишечная палочка, стафилококки, синегнойная палочка. Кроме того, определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам или активным компонентам имеет все большее значение в связи с широким распространением антибиотикорезистентности бактерий. В связи с этим проведены исследования по определению антибактериальной активности суппозиториев относительно указанных возбудителей.
Исследования проводили под руководством профессора Габидуллина З.Г. на кафедре микробиологии Башкирского государственного университета согласно методике, описанной в Государственной Фармакопее XII издания, п. 2.2.10. Анализ проведен на пяти пробах каждой из тест-культур в соответствии с NCCLS-стандартами. По данным литературных источников, критерием оценки результатов эксперимента явилась зона задержки роста микрофлоры до 10 мм или ее отсутствие - микроорганизмы не чувствительны к препарату; от 11 до 15 мм -обладали малой чувствительностью и более 15 мм - чувствительные штаммы. Результаты эксперимента отражены в таблице 3.14.1.
В ходе исследований показано, что суппозитории на желатинно-глицериновой основе и основе, содержащей полиэтиленгликоль, лутрол и кремофор, сохраняют активность как против грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Наибольший антимикробный эффект наблюдался относительно Hafnia alvei. Немного ниже активность препарата против Serratia marcenscens, Enterobacteriaceae и Enterococcus faecalis, следует отметить, что энтерококки - один из наиболее резистентных видов кокковой флоры. Малая активность лекарственной формы наблюдается относительно Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeuruginosa, но последний обладает природной устойчивостью ко многим антимикробным средствам, в том числе к фурациллину. При этом при зонах задержки роста микроорганизмов до 10 мм фактически можно говорить о бактериостатическом эффекте, более 10 мм - о бактерицидном действии. В то же время даже при отсутствии зоны задержки роста (0 мм) над частью образцов препаратов роста микрофлоры не отмечено, что также говорит об их бактериостатическом действии [2, 39, 5353, 73, 92, 133, 142, 143, 153].
Определение осмотической активности мазей
Разведение вируса для проб 1, 2, 3 и 4 производили на 2% пептоне, в случае для проб 1, 2 и 3 взят 1 пассаж, а пробы 4 - главный посевной материал вируса гриппа типа А Калифорния (HiNi), в пробы 5 и 6 вирус и препарат вводили в аллантоисную жидкость куриного эмбриона.
По результатам опыта по изучению противовирусной активности мази с продуктами пчеловодства видно, что исследуемая мазь обладает как прямым противовирусным действием (пробы 1, 2, 3, 4), так и непрямым (пробы 5 и 6).
Предположительно прямое действие, как препарата, так и экстракта прополиса связано с инактивацией компонентов стенок вируса, отвечающих за антигенную активность, что не позволяет антигенам связываться с эритроцитами, вызывая их агглютинацию. При непрямом действии на вирус мазь и вируссодержащая жидкость вводятся в аллантоисную жидкость куриного эмбриона и инкубируются. При проведении реакции гемагглютинации с полученной после инкубации куриного эмбриона аллантоисной жидкостью вирус не обнаруживается и агглютинации не происходит.
На основании полученных данных можно предположить о том, что экстракт прополиса обладает прямым противовирусным действием, что дает предпосылки к его изучению на других штаммах вирусов. Кроме того, введение экстракта прополиса в состав лекарственных форм с подобранной структурой вспомогательных веществ в виде мази позволяет сохранить антивирусный эффект входящих в нее компонентов и использовать мазь назально в качестве профилактики и комплексного лечения вирусных инфекций.Основным проявлением подавляющего большинства заболеваний полости носа и околоносовых пазух является затруднение носового дыхания, вызванное усилением кровенаполнения носовых раковин и отеком слизистой оболочки. Отек слизистой оболочки полости носа может быть следствием воспаления, вирусного или бактериального, аллергической реакции на респираторные аллергены. Поэтому обоснованным является изучение наряду с противовирусной активностью интраназальной мази, содержащей спиртовые экстракты мелонеллы и прополиса, применяемой для профилактики и комплексного лечения гриппа и острой респираторной вирусной инфекции, антимикробной активности.
Исследования проводили на кафедре микробиологии Башкирского государственного медицинского университета под руководством профессора Габидуллина З.Г. Антибактериальное действие препарата оценивали методом диффузии в агаре. Для этого в мясопептонном агаре после посева на него тест-культуры методом газона выделялись лунки диаметром 10 мм, в которые вносился исследуемый препарат в цельном виде [110, 125, 126, 133].
В качестве контроля использовали касторовое масло. В качестве тест-культур применяли музейные штаммы Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Pseudomonas auruginosa, Enterobacteriaceae, Candida albicans, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumonia, Serratia marcenscens, Hafhia alvei в соответствии с NCCLS-стандартами. Чашки Петри выдерживали 24 часа при температуре 37 + 1 С, после чего определяли наличие зоны отсутствия роста тест-культуры бактерий вокруг лунки. Учет антибактериальной активности проводили как средний показатель диаметра задержки роста в пяти пробах каждой культуры в миллиметрах. Результаты эксперимента отражены в таблице 4.11.1.
По данным литературных источников, критерием оценки результатов эксперимента явилась зона задержки роста микрофлоры: до 10 мм или при ее отсутствии - микроорганизмы не чувствительны к препарату; от 11 до 15 мм -обладали малой чувствительностью, более 15 мм - чувствительные штаммы. [2, 39, 53, 92, 143, 153].
В соответствии с этим разрабатываемая мазь «Антивир» не обладает противобактериальным эффектом. Это предположительно связано с тем, что лекарственная форма обладает только местным действием и не высвобождает действующие вещества в агаровый гель.
Основными и ведущими метаболическими процессамив организме человека являются окислительно-восстановительные реакции. Среди них особую роль играют свободнорадикальные реакции, при которых в результате метаболических процессов образуются перекисные соединения. В образовании таких соединений инициативную роль обычно играют свободные радикалы — молекулы или фрагменты молекул, имеющие в одном из атомов кислорода неспаренный электрон. Активные формы кислорода чаще всего представлены супероксидным и гидрооксипероксидным радикалами. Эти радикалы вступают во взаимодействие между собой с образованием перекиси водорода или могут непосредственно окислять органические молекулы жирных кислот, участки белковых комплексов с образованием свободнорадикальных фрагментов таких молекул или перекисных соединений, образующих новые радикалы и гидроперекиси, распад которых также ведет к появлению радикалов, т. е. при отсутствии реакции обрывания цепи процессы свободнорадикального окисления могут иметь лавинообразный неконтролируемый характер [10, 31, 85].
Основным субстратом для свободнорадикальных реакций служат липиды, в первую очередь молекулы полиненасыщенных жирных кислот, липидные компоненты липопротеидов низкой и очень низкой плотности. В результате окисления жирных кислот образуются гидроперекиси (диеновые конъюгаты), которые затем метаболизируются во вторичные — малоновый диальдегид и третичные продукты перекисного окисления липидов — шиффовы основания. Процессы ПОЛ протекают во всех клетках, однако наиболее мощным генератором свободных радикалов служат лейкоциты и тромбоциты, гепатоциты.
Физиологическая роль свободных радикалов достаточно велика. Большая часть свободных радикалов при воспалительных реакциях генерируется фагоцитами, Т-лимфоцитами и выполняет защитную роль, лизируя патогенные микроорганизмы, мутировавшие (раковые) клетки. Свободнорадикальные процессы лежат в основе синтеза циклических и алифатических гидроперекисей, служащих интермедиаторами ферментативного синтеза простагландинов и лейкотриенов. Сами по себе свободные радикалы, перекиси крайне токсичны. Они окисляют фосфолипиды и белки клеточных мембран, нарушая их целостность, инактивируют клеточные и мембранные ферменты. Противоположная роль отведена антиоксидантной системе, представленной в первую очередь системой антиоксидантных ферментов.
Антиокислительную активность мази определяли по угнетению хемилюминесценции (ХЛ) модельных систем, в которых вызывали генерацию активных форм кислорода и процессы перекисного окисления липидов. Регистрацию сверхслабого свечения проводили на приборе ХЛМ - 003. Проверку стабильности работы установки проводили перед каждым измерением по эталону ЖС-19 (ГОСТ 9411-81), интенсивность свечения которого составляет 5,1 х105 квантов в секунду. Эта величина была принята за относительную единицу. Основными и наиболее информативными характеристиками хемилюминесценции служили светосумма свечения, определявшаяся по интенсивности излучения, и амплитуда максимального свечения. ХЛ модельных систем характеризовалась спонтанным свечением, быстрой вспышкой, возникающей при введении солей железа, и развивающейся затем медленной вспышкой. Интегральным и наиболее информативным показателем является величина светосуммы свечения. Ее изменения в модельных системах при добавлении исследуемых растворов в исследованиях in vitro в процентах от контроля приведены в таблице 4.12.1.