Содержание к диссертации
Введение
1. Следовые амины и рецепторы к следовым аминам (обзор литературы) 16
1.1. Следовые амины 16
1.2. Следовые амины как маркеры нейропсихических расстройств 18
1.3. Физиологические эффекты следовых аминов у позвоночных 20
1.4. Рецепторы к следовым аминам 23
1.4.1. Рецепторы к следовым аминам у беспозвоночных 23
1.4.2. Рецепторы к следовым аминам у позвоночных 24
1.4.3. Экспрессия TAAR 26
1.4.4. Внутриклеточная передача сигнала от TAAR 30
1.4.6. Физиологическое значение TAAR 38
1.5. Фармакологическое значение TAAR1 45
1.5.1. Шизофрения 45
1.5.2. Болезни лекарственной зависимости 48
1.5.3. Болезнь Паркинсона 51
1.5.4. Депрессия и тревожные расстройства 52
1.5.5. Заболевания с нарушениями импульсивно-компульсивного контроля 52
2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Животные 54
2.2. Вещества 55
2.3. Методики для оценки влияния выключения TAAR1 на изменение функции дофаминергической системы у мышей 57
2.3.1. Оборудование 57
2.3.2. Опыты с апоморфином 58
2.3.3. Опыты с сочетанным введением D1- и D2- дофаминомиметиков 59
2.3.4. Исследование реактивности на стимулы, ассоциированные с действием амфетамина 60
2.4. Методики для оценки влияния выключения TAAR1 на изменение функции глутаматергической системы у мышей 63
2.4.1. Опыты с NMDA-антагонистами 63
2.4.2. Метод иммуноблота 63
2.5. Методики для доклинической оценки агонистов TAAR1 как потенциальных средств терапии СДВГ 64
2.5.1. Методики для оценки гиперактивности 64
2.5.2. Методики для оценки импульсивности 67
2.5.3. Методики для оценки активного внимания 72
2.5.4. Методики для оценки когнитивной гибкости 77
2.5.5. Дополнительные методики, использованные для фенотипирования DAT-KO крыс 78
2.6. Методики для оценки противокомпульсивного действия агонистов TAAR1 80
2.6.1. Полидипсия, обусловленная режимом подкрепления 80
2.6.2. Локомоторная активность 85
2.6.3. Оценка питьевого поведения 85
2.7. Выявление и проверка фармакологических свойств новых агонистов TAAR1 c in vivo активностью 86
2.7.1. Локомоторная активность 86
2.7.2. Полидипсия, обусловленная режимом подкрепления «фиксированный интервал 60 секунд» 87
2.8. Фенотипирование TAAR5-KO мышей 87
2.8.1. Общая оценка состояния животных и неврологическая проверка 87
2.8.2. Оценка температуры 88
2.8.3. Оценка локомоторной активности 88
2.8.4. Оценка социального поведения 90
2.8.5. Акустическая стартл-реакция и преимпульсное торможение 90
2.8.6. Оценка тревожности мышей 91
2.8.7. Оценка депрессивно-подобного поведения у мышей 91
2.8.8. Методы для оценки импульсивности 92
2.8.9. Специфические фармакологические тесты 93
2.9. Методы статистического анализа результатов 93
3. Влияние выключения TAAR1 на функцию дофамин- и глутаматергической системы у мышей 95
3.1. Опыты с апоморфином 95
3.1.1. Двигательная гипоактивность 95
3.1.2. Феномен «вертикализации» 97
3.1.3. Стереотипические реакции 100
3.1.4. Опыты с сочетанным введением D1- и D2- дофаминомиметиков 101
3.1.4. Обсуждение результатов 104
3.2. Исследование реактивности на стимулы, ассоциированные с действием амфетамина 107
3.2.1. Условно-рефлекторная гиперактивность и контекст-обусловленная сенситизация к стимулирующему действию амфетамина на двигательную активность 108
3.2.2. Условнорефлекторная реакция предпочтения места, ассоциированного с амфетамином 111
3.2.3. Обсуждение результатов 113
3.3. Влияние выключения TAAR1 на изменение функции глутаматергической системы у мышей 116
3.3.1. Опыты с NMDA-антагонистами 116
3.3.2. Экспрессия глутаматных рецепторов 117
3.3.3. Обсуждение результатов 119
4. Экспериментальное обоснование терапевтического потенциала агонистов TAAR1 на доклинических моделях синдрома дефицита внимания с гиперактивностью 123
4.1. Оценка антигиперактивного действия агонистов TAAR1 124
4.1.1. Фармакологические модели 124
4.1.2. Генетические модели 134
4.2. Оценка противоимпульсивного действия агонистов TAAR1 150
4.2.1. Влияние активации TAAR1 на ингибиторный контроль 150
4.2.2. Влияние активации TAAR1 на устойчивость к задержке подкрепления 161
4.2.3. Влияние активации TAAR1 на преждевременное принятие решений 165
4.3. Оценка влияния фармакологической активации TAAR1 на активное внимание у крыс 166
4.3.1. Тест распознавания зрительного стимула 166
4.3.2. Двухпедальный тест для оценки внимания 169
4.4. Экспериментальная оценка влияния фармакологической активации TAAR1 на когнитивную гибкость 171
4.4.1. Новый тест для оценки когнитивной гибкости у крыс 171
4.4.2. Опыты с RO5263397 182
4.5. Обсуждение результатов 182
5. Экспериментальное обоснование терапевтического потенциала агонистов TAAR1 на модели компульсивного поведения 190
5.1. Оценка противокомпульсивного действия агонистов TAAR1 190
5.1.1. Полидипсия, обусловленная режимом пищевого подкрепления «Фиксированное время 60 секунд» 190
5.1.2. Полидипсия, обусловленная режимом пищевого подкрепления «Фиксированный интервал 60 секунд» 192
5.1.3. Оценка действия RO5263397 на двигательную активность и потребление жидкости 195
5.1.4. Оценка толерантности к фармакологическим эффектам RO5263397 при повторном введении 198
5.2. Обсуждение результатов 202
6. Активность in vivo новых агонистов TAAR1 210
6.1. Опыты с MK-801 210
6.2. Моторные эффекты LK00764 213
6.3. Антигиперактивное действие LK00764 217
6.3.1. Гиперактивность, вызванная острым введением никотина 217
6.3.2. Двигательная гиперактивность DAT-KO крыс 218
6.4. Противокомпульсивное действие LK00764 218
6.5. Обсуждение результатов 220
7. Доклиническая оценка TAAR5 как потенциальной мишени для фармакотерапии нейропсихических расстройств 224
7.1. Общая оценка состояния животных 225
7.2. Проверка состояния дофамин- и глутаматергической нейропередачи 226
7.3. Оценка терморегуляции 229
7.4. Оценка серотонинергической нейропередачи 230
7.5. Исследование общей тревожности, формирования депрессивно-подобного поведения и импульсивности 234
7.5.1. Общая тревожность 234
7.5.2. Депрессивно-подобное поведение 236
7.5.3. Импульсивность 236
7.6. Обсуждение 238
Заключение 243
Выводы 252
Практические рекоммендации 254
Перечень сокращений и условных обозначений 255
Список литературы 258
- Экспрессия TAAR
- Условно-рефлекторная гиперактивность и контекст-обусловленная сенситизация к стимулирующему действию амфетамина на двигательную активность
- Новый тест для оценки когнитивной гибкости у крыс
- Обсуждение
Экспрессия TAAR
В исследованиях показана широкая экспрессия TAAR в различных периферических органах и тканях. Иммуногистохимическое исследование образцов тканей с помощью человеческих антител к TAAR1 позволило обнаружить экспрессию рецепторов в -клетках островков Лангерганса поджелудочной железы (Michael, Covic, Kuliopulos, 2019; Raab et al., 2016), в клетках стенки тонкого кишечника (Raab et al., 2016) и в различных клетках плаценты (Stavrou et al., 2018). Эти данные подтверждают результаты предшествующих работ, полученные с помощью метода ПЦР с обратной транскрипцией. В этих работах экспрессия TAAR1 показана в различных типах клеток тонкого кишечника (Ito et al., 2009; Kidd et al., 2008; Revel et al., 2013). Однако с помощью иммуногистохимического метода на образцах тканей мышей и человека не удалось подтвердить показанную раннее экспрессию TAAR1 в сердце, семенниках (Chiellini et al., 2007), жировой ткани (Regard, Sato, Coughlin, 2008), клетках почек, лёгких, желудка, печени, простаты, скелетной мускулатуры и селезёнки (Borowsky et al., 2001). Помимо этого, с помощью ПЦР методов экспрессия TAAR1 показана в лейкоцитах (Babusyte et al., 2013; Bugda Gwilt et al., 2019; Nelson et al., 2007; Wasik et al., 2012). Кроме TAAR1, в этих клетках крови у людей и грызунов также экспрессировались и другие TAAR: TAAR2, TAAR3, TAAR4, TAAR5, TAAR6 (Babusyte et al., 2013; D Andrea et al., 2003; Nelson et al., 2007). мРНК TAAR2, TAAR3 и TAAR4 обнаруживали в сердечной ткани крысы, хотя уровень экспрессии мРНК этих рецепторов был крайне невысок (Chiellini et al., 2007). В клетках почки мыши, кроме TAAR1, методом ПЦР также определили экспрессию TAAR9 (Borowsky et al., 2001) и TAAR8 (Borowsky et al., 2001). В соответствии с результатами экспериментальной работы Chiellini и коллег (2007) TAAR8 также могут быть представлены в семенниках мышей (Chiellini et al., 2007). Наконец, мРНК TAAR9 обнаружили в скелетной мускулатуре (Vanti et al., 2003).
Наиболее характерным местом экспрессии TAAR в ЦНС является обонятельный эпителий, причём там были обнаружены все TAAR, за исключением TAAR1 (Dinter et al., 2015a; Liberles, 2009; Liberles, Buck, 2006; Regard, Sato, Coughlin, 2008; Wallrabenstein et al., 2013). Также с помощью метода ПЦР с обратной транскрипцией экспрессия всех TAAR выявлена в спинном мозге новорождённой крысы (Gozal et al., 2014). В этом же исследовании с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ на образцах тканей новорождённой крысы наличие транскриптов TAAR1 сумели показать, как в нейронах около центрального канала спинного мозга, так и в области передних рогов, где находятся мотонейроны. Дополнительно данные подтверждены методом иммуногистохимии, причём в тех же зонах спинного мозга удалось показать наличие не только TAAR1, но и TAAR4 (Gozal et al., 2014).
По данным литературы, к наиболее распространённым в ЦНС TAAR относятся TAAR1, TAAR5, TAAR6 и TAAR8. При исследовании образцов тканей пациентов из семей с наследственной шизофренией методом ПЦР экспрессия TAAR6 была показана во фронтальной коре, миндалевидном теле и гиппокампе (Duan et al., 2004). При изучении образцов мозга мыши мРНК TAAR5 с помощью гибридизации in situ была выявлена в аркуатном ядре гипоталамуса, вентромедиальном гипоталамусе и миндалевидном теле (Dinter et al., 2015a). Наконец, использование ПЦР в реальном времени позволило определить экспрессию мРНК TAAR8 в образцах коры больших полушарий, белом веществе и мозжечке (более 50 копий комплиментарной ДНК / мкг общего РНК), хотя необходимо отметить, что в данном исследовании все данные были получены на образцах всего от двух животных, поэтому количественный анализ данных вызывает сомнения (Chiellini et al., 2012). Отметим также работу, в которой методом northern blot экспрессия мРНК TAAR9 показана в гипофизе человека (Vanti et al., 2003), однако, как и в случае работы Chiellini и коллег (2012), это исследование было проведено на чрезвычайно малом числе образцов.
При анализе данных литературы хорошо видно, что наиболее тщательно изучена экспрессия TAAR1. Актуальная информация представлена на Рисунке 1.3. Первым исследованием в этой области была работа 2001 года (Borowsky et al., 2001). В этом исследовании для определения экспрессии TAAR1 использовано два метода. На образцах ткани мозга человека методом ПЦР в реальном времени небольшие количества копий мРНК TAAR1 (15-100) были обнаружены в образцах миндалевидного тела и следовые количества ( 15) в образцах мозжечка, спинальном ганглии, гиппокампе, гипоталамусе, гипофизе, ретикулярной формации моста. Для исследования экспрессии TAAR1 в ЦНС у мышей использовали иммуногистохимическую гибридизацию in sito. Наиболее выраженная экспрессия TAAR1 была выявлена в обонятельных зонах: слое митральных клетках обонятельного бугорка и пириформной коре; а также в дугообразном пучке, ядрах тройничного (двигательном, чувствительном и мостовом) и подъязычного нерва, боковом ядре ретикулярной формации, клетках Пуркинье в мозжечке. Также TAAR1 выявили в нескольких зонах (фронтальной, энторинальной и агранулярной) коры больших полушарий, передней части бледного шара, таламусе, гиппокампе и нескольких гипоталамических ядрах, ядре языкоглоточного нерва, ядрах дорсального шва и гигантоклеточном ядре ретикулярной формации, прозрачной перегородке, миндалевидном теле, луковице головного мозга, вентральной области покрышки и голубом пятне. Во многом аналогичные результаты показаны Bunzow и коллегами, опубликовавшими результаты своих исследований в том же 2001 году (Bunzow et al., 2001). В их работе для анализа экспрессии использовали только метод ПЦР с обратной транскриптазой и изучали образцы головного мозга крысы. Экспрессия TAAR1 показана в обонятельной луковице, обонятельном бугорке, прилежащем ядре перегородки, префронтальной коре и других кортикальных областях, чёрном веществе, вентральной области покрышки, мозжечке и мосте. Таким образом, уже в первых работах двумя независимыми группами на образцах от разных биологических видов обнаружено, что TAAR1 экспрессируется довольно широко и что этот рецептор, по-видимому, хорошо представлен в различных катехоламинергических зонах ЦНС. Этот вывод подтверждён в работе на макаках резус (Macaca mulatta), которая была опубликована в 2007 (Xie et al., 2007). В этой работе экспрессия TAAR1 показана в голубом пятне, хвостатом ядре, миндалевидном теле, ядре шва, бледном шаре, прилежащем ядре перегородки, чёрном веществе, скорлупе, таламусе и мозжечке. Для анализа образцов, полученных всего от двух обезьян, использовали иммунногистохимический метод и ПЦР в реальном времени.
Следующая работа, в которой подробно исследовали возможные места экспрессии TAAR1, вышла в 2008 году (Lindemann et al., 2008). В этом исследовании экспрессию TAAR1 изучали с использованием технологии репортёрных генов: направленным добавлением гена LacZ, кодирующего -галактозидазу, к референтной генетической последовательности, что позволяет визуализировать тканеспецифичную экспрессию референтного гена (Kothary et al., 1989; Watson et al., 2008). Экспрессия TAAR1 была обнаружена в гипоталамусе, в том числе в его преоптической области, вентральной области покрышки среднего мозга, миндалевидном теле, ядрах дорсального шва, ядре одиночного шва, ринальной коре и основании гиппокампа. Любопытно, что в этом исследовании не удалось подтвердить наличие TAAR1 в обонятельной луковице и клетках Пуркинье. Похожий метод, в котором на крысах в качестве репортёрного гена был использован флуоресцентный маркер dsRed (Hadjantonakis et al., 2003), использовали, чтобы точнее определить местоположение TAAR1 в префронтальной коре (Espinoza et al., 2015b). В этой работе установлено, что TAAR1 экспрессируются только в ганглионарном слое префронтальной коры. Необходимо также отметить исследование Ferragud и коллег, в котором экспрессия TAAR1 была обнаружена в медиальной префронтальной коре (mPFC) у крыс при помощи вестерн-блоттинга (Ferragud et al., 2017), и работу Cisneros и Ghorpade, в которой иммуногистохимически получены экспериментальные свидетельства, что TAAR1 могут находиться на клетках астроцитарной глии (Cisneros, Ghorpade, 2014).
Условно-рефлекторная гиперактивность и контекст-обусловленная сенситизация к стимулирующему действию амфетамина на двигательную активность
Как можно видеть на Рисунке 3.5, мыши без TAAR1 и животные «дикого типа», как и животные различных групп не отличались по уровню исходной горизонтальной и вертикальной активности. Для статистической обработки данных был использован двухфакторный дисперсионный анализ с межгрупповыми факторами «Группа» и «Генотип». Анализ подтвердил, что статистические различия между мышами различных генотипов отсутствуют (влияние фактора «Генотип»: на горизонтальную активность — F(1,64) = 0,07, P = 0,79; вертикальную активность — F(1,64) = 0,05, P = 0,82). Нам также удалось обнаружить достоверное влияние фактора «Группа» (горизонтальная активность — F(2,64) = 1,42, P = 0,25; вертикальная активность — F(2,64) = 1,09, P = 0,34).
На следующий день после измерения начальной двигательной активности была начата выработка КЗС к стимулирующему действию амфетамина на двигательную активность. В полном соответствии с предшествующими работами (Achat-Mendes et al., 2012; Engelke et al., 2017; Herrmann et al., 2017; Zurkovsky et al., 2017) повторное введение амфетамина мышам из «истинно-обусловленной» группы приводило к постепенному усилению стимулирующего действия этого фармакологического агента на двигательную активность, то есть к развитию сенситизации. Для статистической обработки данных использовали трёхфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями (внутригрупповой фактор «День» и межгрупповые факторы «Генотип» и «Группа»). Статистический анализ подтвердил, что введение амфетамина статистически значимо повышало уровень двигательной активности у мышей «истино-обусловленной» группы (фактор «Группа»: горизонтальная активность — F(2,59) = 79, P 0,001; вертикальная активность — F(2,59) = 8,11, P 0,01). Развитие сенситизации подтверждается выявленным статистически значимым влияние взаимодействия факторов «Группа» и «День» на горизонтальную активность (F(9,27) = 6,1, P 0,001). Влияние взаимодействие этих факторов на вертикальную активность выявить не удалось (F(7,27) = 1,17, P = 0,32). Как и при измерении начальной двигательной активности различия между мышами разных генотипов обнаружить не удалось (фактор «Генотип»: горизонтальная активность — F(1,59) = 1,31, P = 0,26; вертикальная активность — F(1,59) = 0,42, P = 0,52). Мыши с и без TAAR1 также не различались по характеру развития сенситизации (взаимодействие факторов «День» и «Генотип»: горизонтальная активность — F(5,27) = 0,6; P=0,68; вертикальная активность — F(4,21) = 0,29; P = 0,86).
После индукции сенситизации к стимулирующему действию амфетамина на двигательную активность, мы оценили УРГ и выработанную КЗС к стимулирующему действию амфетамина на двигательную активность (Рисунок 3.5.Б,Г). Для этого после окончания последней сессии индукции сенситизации были выполнены два теста через 24 и 48 часов, соответственно. Перед Тестом 1 всем животным вводили изотонический раствор NaCl, а перед Тестом 2 все мыши получили инъекцию амфетамина 2 мг/кг. Как можно видеть на Рисунке 3.5, во время Теста 1 двигательная активность мышей «истинно-обусловленной» группы было намного выше, чем у грызунов «ложно-обусловленной» и контрольной групп, то есть у животных развивалась условнорефлекторная гиперактивность. В соответствии с данными, полученными во время Теста 2, наибольший уровень горизонтальной и вертикальной активности был зафиксирован у мышей «истинно-обусловленной» группы, при этом двигательная активность животных из «ложно-обусловленной» группы была выше, чем у грызунов из контрольной группы. Таким образом, результаты Теста 2 подтверждают, что у животных развивалась контекст-обусловленная сенситизация. Для статистической обработки данных был использован трёхфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями с одним внутригрупповым фактором («тест») и двумя межгрупповыми факторами («генотип» и «группа»). Результаты статистического анализа представлены в Таблице 3.3.
Важно отметить, что TAAR1–/– мыши демонстрировали более высокие показатели двигательной активности во время обоих тестов, чем животные «дикого типа». Апостериорные сравнения (тест Бонферрони) выявил, что уровни горизонтальной и вертикальной двигательной активности в обоих тестах в «истинно-обусловленной» группе были значительно выше у мышей без TAAR1 по сравнению с животными «дикого типа» (P 0,05). Кроме того, при post hoc сравнениях установлено, что в «ложно-обусловленной» группе уровень вертикальной, но не горизонтальной активности в тесте контекст-зависимой сенситизации был достоверно выше у животных TAAR1–/– по сравнению с мышами «дикого типа» (P 0,05).
Новый тест для оценки когнитивной гибкости у крыс
Когнитивные расстройства сопровождают множество психопатологических состояний, в том числе шизофрению, аффективные расстройства, аутизм, синдром дефицита внимания с гиперактивностью. Они могут быть как функциональными (преходящими, как, например, при депрессии), так и связанными с органическими изменениями головного мозга (в том числе возрастного характера). В последние годы активно разрабатывают методы оценки нарушений когнитивных функций, которые могут быть использованы как в обследовании людей, так и в экспериментах на животных для разработки новых способов лечения (Young et al., 2009).
Способность к изменению стратегий в новых условиях является одной из ключевых адаптационных функций. Когнитивная гибкость подразумевает способность адаптировать мышление или внимание в ответ на изменение целей и/или внешних стимулов (Scott, 1962). В частности, исследователи описывают это понятие как способность переключать или изменять ход мыслей и внимание между различными задачами или операциями — обычно в ответ на изменение правил или требований эксперимента (Miyake et al., 2000). Когнитивная гибкость является одним из доменов, которые относятся к исполнительным функциям (англ. executive functions), и определяет способность к целенаправленной деятельности (Gilbert, Burgess, 2008). Ее нарушения наблюдаются при различных неврологических и психических расстройствах, например, болезни Паркинсона, шизофрении, аутизме, наркоманиях и ОКР (Ceaser et al., 2008; Chamberlain et al., 2006; Cools et al., 2001; Verdejo-Garca et al., 2006; Yerys et al., 2009). В экспериментальных работах было также показано, что когнитивную гибкость обеспечивают такие области головного мозга, как медиальная и орбитальная префронтальная кора (Chase, Tait, Brown, 2012). В частности, роль медиальной префронтальной коры (mPFC) продемонстрирована при её разрушении у животных, обученных исполнению задачи смещения цели (англ. set-shifting) (Floresco, Zhang, Enomoto, 2009).
Оперантная деятельность животных изучается уже более века, и за это время было описано множество различных режимов подкрепления. Даже простые режимы подкрепления, основанные на заданном соотношении оперантных реакций и подкрепления или подкреплении реакций животного, наблюдаемых через некие временные интервалы, приводят к выработке поведения, заметно различающегося по частоте и паттерну (распределению во времени) оперантных реакций. Например, режим переменного интервала может быть использован для получения относительно высокой частоты и стабильного распределения оперантных реакций на протяжении экспериментальной сессии. В отличие от него, в условиях подкрепления реакций в режиме фиксированного интервала частота ответов ниже, повышается к концу интервала, за чем следуют паузы с отсутствием реакций после получения подкрепления. Данный паттерн, включая паузы после подкрепления, зависит от величины временного интервала (чем продолжительней интервал, тем длиннее пауза) (Ferster, Skinner, 1957). Что самое важное, эти различия в распределении ответов при фиксированном и переменном интервале наблюдаются при равной интенсивности подкрепления (то есть одинаковой частоте получения подкрепления за экспериментальную сессию).
Целью исследования явилась разработка нового экспериментального метода изучения когнитивной гибкости. Данная работа была разделена на три этапа. Задачей первого этапа была постановка метода, позволяющего охарактеризовать способность адаптироваться к новым условиям по изменению паттерна оперантной реакции. Задачей второго этапа была фармакологическая валидация метода с использованием однократного и повторного введения канального блокатора NMDA-рецепторов МК-801 как агента, способного нарушать когнитивную гибкость (Blot et al., 2015). Задачей третьего этапа стала апробация данного метода на животных после разрушения mPFC.
Эксперимент выполняли так, как описано в п. 2.5.4.1. Все крысы из первой экспериментальной когорты (n = 12) обучились навыку нажатия на педаль, а также получению подкрепления на оперантном режим ПИ 30 с.
Обучение в условиях ПИ 30 с привело к установлению паттерна ответов с практически неизменными короткими паузами после подкрепления, составлявшими в среднем 6,4 ± 0,12 с. При изменении режима подкрепления в тестах на ФИ 30 с на протяжении сессии наблюдалось постепенное увеличение длительности временных промежутков (пауз), когда животные не нажимали на педаль экспериментальной камеры после получения подкрепления, в последний из 6 отрезков сессии до 19,6 ± 2,52 с (см. Рисунок 4.21.А). Как можно видеть на Рисунке 4.21.Б,В, при изменении режима подкрепления на ФИ 30 с у животных повышались коэффициенты приспособления и регрессии, которые мы использовали для оценки адаптации крыс к изменению режима подкрепления. Различия подтверждены при статистической обработке данных. При проведении теста Вилкоксона выявлены достоверные различия при сравнении показателей, полученных при ФИ 30 с, с показателями, полученными при режиме подкрепления ПИ 30 с (P 0,001). Стоит отметить, что при этом смена режима подкрепления не влияла на частоту нажатия у крыс (0,5 ± 0,08 vs. 0,4 ± 0,06; P = 0,34 по W-критерию Вилкоксона).
Таким образом, результаты первой фазы эксперимента подтверждают предположение, что поведение крыс будет изменяться, адаптируясь к смене режима подкрепления и доказывают, что экспериментаторы могут зафиксировать эти изменения с помощью предложенных нами коэффициентов.
Как можно видеть на Рисунке 4.22.А,Б, переход к паттерну ответов, характерному для режима подкрепления ФИ 30 с, нарушался при однократном введении неконкурентного антагониста NMDA-рецепторов МК-801 (0,025; 0,05 и 0,1 мг/кг). Для статистической обработки результатов использовали тест Фридмана. При его проведении выявлено достоверное влияние фактора «доза MK-801» на коэффициент приспособления (2 = 8,10; df = 3; P 0,05), мы обнаружили, также, статистический тренд к дозозависимому снижению коэффициента регрессии под действием MK-801 (2 = 6,60; df = 3; P = 0,09). При апостериорных сравнениях (тест Даннета) выявили достоверное снижение коэффициента приспособления при однократном введении МК-801 в дозах 0,05 и 0,1 мг/кг по сравнению с данными, которые были получены при инфузии изотонического раствора NaCl.
Следует отметить, что однократное введение МК-801 в дозах 0,025 и 0,05 мг/кг приводило к учащению нажатий на педаль, а наиболее высокая доза (0,1 мг/кг) вызывала снижение частоты ответов до уровня ниже, чем в контрольных условиях (Рисунок 4.22.В: 2 = 18,30; df = 3; P 0,001), что в последнем случае, скорее всего, отражает появление нарушений двигательной активности/координации движений у животных и лишает возможности рассматривать наблюдаемые изменения как имеющие отношение к когнитивным способностям животных.
Зачастую в работах, где у животных показаны когнитивные нарушения, вызванные антагонистами глутаматных рецепторов NMDA-подтипа, используют не однократное, а повторное введение соединений из этой фармакологической группы. Считается, что такие режимы введения фенциклидина, кетамина и MK-801 могут быть эффективнее для моделирования когнитивных дефицитов (Neill et al., 2014), в том числе благодаря снижению объёма серого вещества во фронтальной коре (Chesters et al., 2017; Liao et al., 2011) и, как возможное следствие, снижению функции этой структуры ЦНС (Jentsch et al., 1997a; Jentsch et al., 1997b).
Все крысы (n = 12) из второй экспериментальной когорты обучились навыку нажатия на педаль, а также получению подкрепления на оперантном режим ПИ 30 с. Крысы из экспериментальной и контрольной групп не отличались по адаптации к режиму подкрепления ФИ 30 с до начала повторного введения MK-801 0,1 мг/кг.
Как можно видеть на Рисунке 4.23, семидневное введение NMDA-антагониста привело к изменениям в адаптации крыс: у крыс экспериментальной группы снижался и коэффициент приспособления, и угол наклона линии регрессии. Для статистического анализа данных использовали дисперсионный анализ смешанного типа на предварительно ранжированных данных с внутригрупповым фактором «MK-801», межгрупповым фактором «группа» и случайным фактором «порядковый номер крысы». Результаты статистического анализа представлены в Таблице 4.13.
Обсуждение
Эксперименты, проведённые в рамках настоящего фрагмента, являются первой попыткой охарактеризовать влияние TAAR5 на поведение животных и действие фармакологически активных веществ.
При выполнении исследований первой фазы нами установлено, что экспрессия TAAR5 не влияла на общее состояние, выраженность сенсорных рефлексов и моторных реакций, на болевую чувствительность и обоняние у мышей. TAAR5–/– животные не отличались от TAAR5+/– и TAAR5+/+ мышей по двигательной активности и сенсомоторному сопряжению. Нам также не удалось обнаружить различия в социальном поведении между мышами без TAAR5 и животными «дикого типа».
На втором этапе мы провели всесторонний анализ дофамин- и глутаматергической систем нейропередачи с использование агентов с установленным фармакологическим действием. Нам не удалось обнаружить какие-либо изменения в действии дофамин- и глутаматергических лигандов при однократном и повторном введении у TAAR5–/– животные по сравнению с TAAR5+/+ мышами. Такие результаты в целом соответствуют данным последующих работ, в которых экспрессия рецепторов данного подтипа не была показана в дофаминергических структурах.
На основании данных из работы Dinter и коллег (Dinter et al., 2015a) нами было высказано предположение, что TAAR5 могут быть вовлечены в контроль температуры у животных. Нам не удалось обнаружить различия между генетически модифицированными мышами и животными контрольной группы. Однако гипотермическое действие агониста 5-HT1A-рецепторов 8-OH-DPAT было выражено у TAAR5–/– мышей сильнее, чем у контрольных животных. Следует отметить, что снижение температуры после введения 8-OH-DPAT связано с действием данного фармакологического агента на центральные звенья терморегуляции. Дополнительно, для проверки возможных различий в периферических звеньях терморегуляции, мы протестировали гипотермическое действие агониста M-холинорецепторов оксотреморина на данной линии мышей. Нам не удалось обнаружить межгрупповые различия в снижении температуры, вызванном введением данного вещества.
Результаты, полученные в опытах с 8-OH-DPAT, а также информация об экспрессии TAAR5 в миндалевидном теле позволили сформулировать гипотезу, что выключение TAAR данного подтипа может приводить к изменению активности серотонинергической нейропередачи. Для проверки гипотезы мы протестировали фармакологические эффекты нескольких лигандов серотониновых рецепторов. В ходе экспериментов установлено, что введение MDMA 10 мг/кг оказывало анксиолитическое действие у мышей без TAAR5, но не у TAAR5+/+, хотя по данным литературы известно, что данная доза обычно не влияет на тревожность у животных (Lin, 1999). Можно предположить, что действие MDMA на тревожность также связано с активацией 5-HT1A, так как в предшествующих исследованиях было показано анксиолитическое действие агонистов рецепторов данного подтипа (Kwieciski, Nowak, 2009; Lalonde, Strazielle, 2010). При этом нам не удалось обнаружить изменения функции 5-HT2- и 5-HT3-рецепторов у животных без TAAR5.
5-HT1A-рецепторы относятся к семейству GPCR (Kaufman et al., 2016). Известно, что активация 5-HT1A рецепторов приводит к повышению уровня цАМФ внутри нейронов (De Vivo, Maayani, 1986). Однако в ряде исследований были продемонстрированы доказательства, что в сигнальные пути данных рецепторов могут быть вовлечены и другие системы внутриклеточной передачи сигнала (Carmena et al., 1998; Lscher et al., 1997). Как упоминалось выше, хорошо известно, что 5-HT1А-рецепторы вовлечены в регуляцию тревожности, импульсивности, а также формирование аффективных состояний у животных (Blasio et al., 2012; Collinson, Dawson, 1997; Kwieciski, Nowak, 2009; Lalonde, Strazielle, 2010; Savitz, Lucki, Drevets, 2009). Соответственно, можно предположить, что выключение TAAR5 благодаря влиянию на функцию 5-HT1A рецепторов может оказывать влияние и на эти поведенческие характеристики у мышей. Это предположение было проверено при выполнении экспериментов последней фазы.
При проведении опытов установлено, что у мышей без TAAR5 снижена общая тревожность в тестах «приподнятый О-образный лабиринт» и «тёмно-светлая камера», хуже формируется выученная беспомощность, а также снижен ингибиторный контроль в тесте «ФИ 30 с». Полученные результаты 1) подтверждают гипотезу о том, что выключение TAAR5 может приводить к изменению функции 5-HT1A рецепторов у мышей; 2) позволяют высказать гипотезу о том, что антагонисты TAAR5 могут обладать анксиолитическим, антидепрессивным и противоимпульсивным действием.
Важно отметить, что 5-HT1A могут быть расположены как на пресинаптической, так и постсинаптической мембране (Kaufman et al., 2016). Пресинаптические рецепторы вовлечены в механизмы обратной связи: их активация приводит к снижению высвобождения серотонина (Kaufman et al., 2016). Также показано, что активация пре-или постсинаптических 5-HT1A рецепторов приводит к прямо противоположным изменениям. Так, например, активация пресинаптических 5-HT1A повышает уровень дофамина (Arborelius et al., 1993b; Chen, Reith, 2002; Gronier, 2008), а постсинаптических, наоборот, снижает (Arborelius et al., 1993a; Ichikawa, Meltzer, 2000; Rasmusson et al., 1994). Аналогичным образом активация пресинаптических 5-HT1A вызывает анксиолитическое действие (Kwieciski, Nowak, 2009; Lalonde, Strazielle, 2010), а постсинаптических, наоборот, повышает тревожность животных (Miheau, Barbara, 1999). Среди других фактов, демонстрирующих особенности пре- и постсинаптических 5-HT1А нельзя не отметить, что антидепрессивное действие ингибиторов обратного захвата серотонина связывают именно с повышением экспрессии именно пресинаптических 5-HT1А. Данные, полученные в наших экспериментах, не позволяют сделать вывод: связаны ли выявленные изменения в поведении TAAR5–/– мышей с повышением активации пресинаптических 5-HT1A или же наоборот — со снижением активации рецепторов, расположенных на постсинаптической мембране.
Как и в случае TAAR1 трудно охарактеризовать клеточные механизмы изменения функции 5-HT1A рецепторов у животных без TAAR5. Для решения этой задачи требуются дальнейшие эксперименты, чтобы расширить наши представления о том, на каком уровне и как может происходить взаимодействие 5-HT1A и TAAR5 рецепторов. Основываясь на том, что TAAR5 принадлежат к той же группе, что и TAAR1, можно предположить, что среди подобных механизмов возможно формирование гетеродимеров 5-HT1A и TAAR5, поскольку в предшествующих работах in vitro была показана возможность образования комплексов 5-HT1A с другими GPSR (Renner et al., 2012; Salim et al., 2002).
Результаты представленной серии опытов с RO5263397 опубликованы и доступны по ссылке: Espinoza S., Sukhanov I., Efimova E.V., Kozlova A.A., Antonova K.A., Illiano P., Leo D., Merkulyeva N., Kalinina D., Musienko P., Rocchi A., Mus L., Sotnikova T.D., Gainetdinov R.R. Trace amine-associated receptor 5 (TAAR5) provides olfactory input into limbic brain areas and modulates emotional behaviors and serotonin transmission // Frontiers in Molecular Neuroscience. — 2020. — V. 13. — A. 18. — doi: 10.3389/fnmol.2020.00018.