Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 17
1.1 Общие сведения об этиологии и эпидемиологии хронической обструктивной болезни легких 17
1.2 Патогенез хронической обструктивной болезни легких 19
1.2.1 Воспаление, оксидативный стресс, протеиназы 19
1.2.2 Ангиогенез 22
1.2.3 Сигнальная система Notch 25
1.2.4 Эндотелиальные прогениторные клетки 28
1.3 Дофамин и его роль в регуляции сосудистого гомеостаза 31
1.4 Эффекты и механизм действия спиперона 36
1.5 Модели эмфиземы легких 40
1.6 Заключение 44
Глава 2 Материалы и методы 46
2.1 Материал исследования 46
2.2 Реагенты 48
2.3 Экспериментальные модели 49
2.4 Дизайн исследования 52
2.5 Методы исследования 53
2.5.1 Гистологическое исследование легких 53
2.5.2 Иммуногистохимическое исследование ткани легких 54
2.5.3 Иммуноферментный анализ 55
2.5.4 Определение экспрессии мембранных рецепторов на мононуклеарах 55
2.5.5 Определение экспрессии Notch1 рецепторов на мононуклеарах легких 56
2.5.6 Исследование влияния спиперона и дофамина на эндотелиальные клетки in vitro 57
2.5.7 Методы статистической обработки экспериментальных данных 59
Глава 3 Результаты собственных исследований 60
3.1 Влияние спиперона на воспаление и гистологическую картину при повреждении легких, индуцированном введением D-галактозамина гидрохлорида, эластазой и экстрактом сигаретного дыма 60
3.1.1 Гистологическое исследование легких 60
3.1.2 Гистологическое исследование печени 65
3.1.3 Иммуногистохимическое исследование экспрессии CD16, CD31, пан-цитокератина и 1-антитрипсина в легких 66
3.1.4 Определение концентрации 1-антитрипсина в гомогенате легких и сыворотке крови 70
3.2 Влияние спиперона на содержание предшественников эндотелиальных клеток при моделировании эмфиземы легких 71
3.2.1 Влияние спиперона на содержание предшественников эндотелиальных клеток в условиях повреждения легких, индуцированного введением D-галактозамина гидрохлорида 71
3.2.2 Влияние спиперона на содержание предшественников эндотелиальных клеток в условиях введения эластазы 74
3.3.1 Влияние спиперона на содержание предшественников эндотелиальных клеток в условиях введения экстракт сигаретного дыма 76
3.3 Влияние спиперона на предшественники эндотелиальных клеток, экспрессирующие маркер Notch1, при моделировании эмфиземы легких 78
3.3.1 Влияние спиперона на предшественники эндотелиальных клеток, экспрессирующие маркер Notch1, при повреждении легких, вызванном введением D-галактозамина гидрохлорида 78
3.3.2 Влияние спиперона на предшественники эндотелиальных клеток, экспрессирующие маркер Notch1, при повреждении легких, вызванном введением эластазы 79
3.3.3 Влияние спиперона на предшественники эндотелиальных клеток, экспрессирующие маркер Notch1, при повреждении легких, вызванном введением экстракта сигаретного дыма 80
3.4 Влияние дофамина и спиперона на эндотелиальные предшественники in vitro 81
Глава 4 Обсуждение результатов исследования 84
Заключение 102
Выводы 104
Список сокращений и условных обозначений 106
Список литературы 107
- Воспаление, оксидативный стресс, протеиназы
- Модели эмфиземы легких
- Иммуногистохимическое исследование экспрессии CD16, CD31, пан-цитокератина и 1-антитрипсина в легких
- Влияние дофамина и спиперона на эндотелиальные предшественники in vitro
Воспаление, оксидативный стресс, протеиназы
При ХОБЛ развитие структурных изменений в легких обусловлено целым рядом механизмов: усиление миграции иммунокомпетентных клеток, повышение продукции провоспалительных цитокинов, оксидативный стресс, повышением активности протеиназ.
Нейтрофилы являются одними из основных клеток, которые принимают участие в развитие воспаления дыхательных путей при ХОБЛ. Миграция нейтрофилов из капиллярного русла в альвеолы регулируется рядом таких цитокинов как ФНО-, ИЛ-1 и эндогенными хемоаттрактантами (лейкотриен В4, ИЛ-8). Интегрины семейства 2 регулируют трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов. Секретируемые нейтрофилами протеазы (нейтрофильная эластаза, протеиназа – 3, катепсин G) и матриксные металлопротеиназы (анг. Matrix metalloproteinases, MMP) вызывают деструкцию эластического матрикса легких [189].
Как известно макрофаги принимают участие во многих процессах, протекающих в организме: поддерживают тканевой гомеостаз, регулируют ангиогенез, участвуют в воспалительном ответе [275]. Активация альвеолярных макрофагов при ХОБЛ происходит напрямую через Toll – подобные рецепторы 2, 4 и 9 типов или опосредованно через фрагменты апоптотических или некротизированных клеток. Активированные макрофаги секретируют многие цитокины (ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-, лейкотриен B4), MMP-2, 9, 12 и активные формы кислорода (анг. Reactive oxygen species, ROS). Высвобождение трансформирующего ростового фактора и фактора роста соединительной ткани стимулирует пролиферацию фибробластов и развитие фиброза. Активированные макрофаги способны индуцировать окислительный стресс, стимулируя апоптоз эндотелиальных и эпителиальных клеток [200].
Роль Т-лимфоцитов в развитие ХОБЛ однозначно не определена. Результаты клинических и экспериментальных исследований позволяют сделать предположение, что развитие эмфиземы легких при ХОБЛ опосредуется цитотоксическими CD8+ Т-лимфоцитами [104].
Важную роль в формировании и поддержании воспаления при ХОБЛ играют цитокины (Таблица 1.1). Так, сигаретный дым индуцирует продукцию ФНО-, ИЛ-1 и ИЛ-8 эпителиальными клетками и альвеолярными макрофагами. При ХОБЛ имеет место увеличение экспрессии хемотаксических факторов: лейкотриена B4, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5 и CXCL8 [71].
Одним из патогенетических факторов ХОБЛ является развитие окислительного стресса. При заболевании наблюдается значительное увеличение продукции ROS. ROS продуцируются эпителиальными клетками дыхательных путей в ответ на карбонильный стресс, клетками гладкой мускулатуры – в ответ на воспаление [144]. Увеличение концентрации ROS у курильщиков связано с повышенным его образованием нейтрофилами и макрофагами. Сигаретный дым также является источником активных форм азота, которые способны вызывать нитрозативный стресс [112].
Повышение окислительной нагрузки при ХОБЛ вносит свой вклад в инактивацию антипротеаз, развитие бронхиального воспаления, гиперплазию бронхиальных желез и гиперсекрецию слизи, активацию иммунокомпетентных клеток (макрофаги, нейтрофилы), фиброз, апоптоз клеток альвеолярного эпителия и эндотелия [78].
Под влиянием окислительного стресса, происходит активация натуральных киллеров и усиливается опосредованное ими воспаление тканей [197], увеличивается продукция многих провоспалительных цитокинов и хемокинов, в частности таких как ядерный фактор «каппа-би» (анг. Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-B), ИЛ-1, ИЛ-8. Избыток ROS замедляет скорость разрешения воспаления, ускоряет процессы разрушения легочной ткани [136].
В легких больных ХОБЛ отмечается нарушение баланса между расщепляющими компоненты соединительной ткани протеиназами (сериновые протеазы – нейтрофильная эластаза, катепсин G, цистеиновые протеазы – катепсины В, К, L, S) и антипротеиназами (1-антитрипсин, 1-антихимотрипсин, секреторный ингибитор лейкопротеазы). Повышение протеазной активности при ХОБЛ связано с увеличением образования протеиназ клетками воспаления и эпителиальными клетками. Опосредованное протеиназами разрушение главного соединительнотканного компонента паренхимы легких эластина приводит к формированию эмфиземы легких [8].
Модели эмфиземы легких
В литературе описано множество способов моделирования эмфиземы легких у экспериментальных животных. Считается, что эмфизема легких, вызванная ЭСД, наиболее релевантна клиническим ситуациям, так как воспроизводит воздействие основного фактора риска развития эмфиземы легких и ХОБЛ - сигаретного дыма. Сигаретный дым - это смесь более 8 тысяч химических веществ, часть из которых образуется при горении табака [53]. Основными компонентами являются смола, никотин и угарный газ. Табак-специфичные нитрозамины (анг. Tobacco-specific nitrosamines, TSNA), образующиеся в процессе переработки табака, являются канцерогенами [37].
Сигаретный дым способствует активации альвеолярных макрофагов, напрямую индуцируя окислительный стресс через Toll-подобные рецепторы (анг. Toll-like receptor, TLR) 2, 4 и 9 типов или опосредовано через DAMPs {анг. Damage-associated molecular patterns, молекулярный фрагмент, ассоциированный с повреждениями) апоптотических или некротизированных клеток [200].
B.L. Eppert et al. продемонстрировали увеличение количества Th-1 и Th-17 и экспрессию интерферона-у и ФНО- на мембране CD8+ Т-лимфоцитов у лабораторных животных, подвергшихся воздействию сигаретного дыма [104]. Сигаретный дым повышает концентрацию ИЛ-1 в бронхоальвеолярной жидкости человека и лабораторных животных. Воздействие сигаретного дыма вызывает вариабельную экспрессию ИЛ-1 в популяции альвеолярных макрофагов и четкую экспрессию в альвеоцитах I и II типа. Выраженная экспрессия ИЛ-1 наблюдалась в эпителиальных клетках бронхов [130]. Использование животных моделей показало, что ИЛ-1 вызывает нейтрофильную и макрофагальную инфильтрацию легочной ткани, расширение дистальных отделов дыхательных путей и разрушение эластиновых волокон межальвеолярных перегородок, приводя к развитию фиброзных изменений дыхательных путей и плевры [46].
Сигаретный дым является источником активных форм азота, который способен вызвать окислительный (нитрозативный) стресс [112]. Под влиянием окислительного стресса происходит активация NK-клеток (анг. Natural killer T-cell, натуральные киллеры) и усиливается опосредованное ими воспаление тканей [197], наблюдается рост продукции провоспалительных цитокинов и хемокинов: NF-B, ИЛ-1 и ИЛ-8. Избыток ROS замедляет скорость разрешения воспаления и ускоряет процессы разрушения легочной ткани [136].
Сигаретный дым вызывает повышение проницаемости альвеолярной стенки [161]. ЭСД нарушает целостность эндотелия и вызывает эндотелиальную дисфункцию. Так, в экспериментах in vitro ЭСД увеличивает проницаемость монослоя эндотелиальных клеток бычьей легочной артерии и вызывает апоптоз эндотелиальных и эпителиальных клеток легких [161]. Lu Q. et al. связывают это с ингибированием клеточных сигналов, опосредованных VEGF и фокальной адгезивной киназой.
Мыши (C57/BL6, BALB, AKR/J) [202] и морские свинки [274] наиболее чувствительны к воздействию сигаретного дыма. Меньшей чувствительностью к сигаретному дыму обладают крысы [202]. Наиболее часто модель эмфиземы легких воспроизводят у мышей самок линии C57/BL6. Сигаретный дым или экстракт сигаретного дыма (ЭСД) может быть введен непосредственно в дыхательные пути мышей или путем их окуривания в специальной камере (путем подведения в нее сигаретного дыма) [202]. ЭСД получают, пропуская дым тлеющих сигарет (без фильтра) через натрий-фосфатный буфер. Полученный раствор пропускают через бактериальный фильтр [137]. He Z.H. et al. установили отсутствие значимых различий между площадью эмфиземы, вызванной ингаляций сигаретного дыма, и площадью эмфиземы, обусловленной внутрибрюшинным введением ЭСД [65].
Длительность и кратность введения сигаретного дыма при этом может значительно варьироваться. В краткосрочной модели, предложенной Beckett E.L. et al. мыши подвергались воздействию сигаретного дыма 2 раза в сутки, 5 дней в неделю на протяжении 1-12 нед. [16]. McGrath-Morrow S.A. et al. окуривали 3 часа в день 5 дней в неделю на протяжении 6 месяцев [129]. Наиболее стойкая эмфизема легких формируется при ингаляции сигаретного дыма в течение 6-7 мес [269]. Под воздействием сигаретного дыма у самок отмечается усиление ремоделирование дистальных дыхательных путей, снижение экспрессии «антиоксидантых» генов, накопление ROS с развитием окислительного стресса (по сравнению с самцами этой же линии) [225], наблюдается уменьшение числа биения ресничек клеток мерцательного эпителия бронхов [159].
При окуривании животных наблюдается поражение других органов и систем. Beckett E.L. et al. выявили, что ингаляционное воздействие сигаретного дыма приводило к снижению мышечной массы, увеличению массы сердца и количества окружающей его жировой ткани [16].
Другим патогенетическим фактором, приводящим к развитию эмфиземы легких и ХОБЛ, является дисбаланс в системе протеиназ и антипротеиназ. Как известно, контроль протеазной активности осуществляется эндогенными ингибиторами протеаз, основным из которых является 1-антитрипсин [199]. Синтезируется 1-антитрипсин преимущественно гепатоцитами, а также может продуцироваться эпителиальными клетками легких и кишечника, островковыми клетками поджелудочной железы [230]. Дисбаланс в системе протеиназ/антипротеиназ возможен при нарушении синтеза 1-антитрипсина или его чрезмерной инактивации под воздействием окислительного стресса [198]. Повышение миграции нейтрофилов, усиление их дегрануляции под влиянием цитокинов [93], гипоксии [129] приводит к повышению протеазной активности и усилению деструкции эластичного матрикса альвеол, и формированию эмфиземы легких. У пациентов с дефицитом 1-антитрипсина чаще всего наблюдается панлобулярная эмфизема, которая локализована преимущественно в нижних отделах легких [25].
Для моделирования эмфиземы легких, вызванной дисбалансом в системе протеаз и антипротеаз, наиболее часто используется свиная панкреатическая эластаза (анг. Porcine pancreatic elastase, PPE). Возможно применение папаина, нейтрофильной эластазы (анг. Human neutrophil elastase, HNE) [30]. Мыши, крысы и хомяки обладают высокой чувствительностью к этой группе повреждающих факторов. Эластаза назначается интраназально, эндотрахеально или внутрибрюшинно [107]. Уже через три часа после интратрахеального введения эластазы Van de Lest C.H. et al. отмечали признаки острого повреждения легких (воспалительная инфильтрация, кровоизлияния), которые сохранялись в течение трех дней. Эмфизематозные изменения легких регистрировались через две недели после инстилляции эластазы [260]. Выраженность эмфизематозных изменений можно варьировать путем коррекции дозы эластазы. Достоинством модели является простота воспроизведения и относительно низкая стоимость (при использовании эластазы). Эмфизема, индуцированная введением эластазы, во многом воспроизводит структурные и функциональные изменения, которые наблюдаются у пациентов с ХОБЛ [30].
Для воспроизведения дефицита 1-антитрипсина используется D галактозамина гидрохлорид. Это соединение обладает выраженной гепатотоксичностью и широко применяется для моделирования острого и хронического повреждения печени [75, 113, 191, 210]. Под влиянием D галактозамина гидрохлорида увеличивается образование активных форм кислорода и азота, снижается уровень глутатиона [113]. Дефицит уридинтрифосфорной кислоты приводит к снижению синтеза РНК и белка.
Decker K. et al. обнаруживали необратимые изменения гепатоцитов через 3 часа после введения D-галактозамина гидрохлорида [72]. Через 8 часов после внутрибрюшинного введения D-галактозамина гидрохлорида (700 мг/кг) и липополисахарида Wu Y.H. et al. обнаруживали признаки апоптоза гепатоцитов (фрагментация и конденсация хроматина, образование апоптотических телец) [177]. В крови наблюдалось резкое снижение уровня 1-антитрипсина [43] и увеличение содержание аланинаминотрансферазы и ФНО- [177]. В просвете альвеол отмечалось увеличение числа полиморфноядерных лейкоцитов. Введение D-галактозамина гидрохлорида в сочетании с эластазой [39] или эндотоксином Escherichia coli [40] сопровождалось более выраженным расширением воздушного пространства альвеол.
Иммуногистохимическое исследование экспрессии CD16, CD31, пан-цитокератина и 1-антитрипсина в легких
Иммуногистохимическим методом производилась оценка экспрессии маркеров клеток воспаления (нейтрофилов, макрофагов) CD16, специфического маркера эндотелиальных клеток CD31, содержание пан-цитокератина и 1-антитрипсина в легких мышей самок линии C57BL/6.
В легких мышей на 3 сут после введения D-галактозамина гидрохлорида отмечалось повышение экспрессии CD16 в 6,6 раз. Уровень пан-цитокератина при этом достоверно снижался. Достоверных различий между числом CD31-положительных клеток у интактных животных и животных с повреждением легких, вызванным введением D-галактозамина гидрохлорида, не наблюдалось. Курсовое введение спиперона снижало экспрессию CD16 и увеличивало число CD31+ клеток и пан-цитокератина в легких (Таблица 3.4).
На 21 сут после введения эластазы число CD16+ клеток было в 7,2 раза выше, чем интактных животных. Содержание в легких CD31+ клеток уменьшалось в 4 раза, уровень пан-цитокератина снижался в 2 раза.
Введение спиперона в 2,4 раза уменьшало экспрессию CD16 на клетках легких и увеличивало экспрессию CD31 и пан-цитокератина в 4,8 и 1,7 раз соответственно (по сравнению с животными из группы патологического контроля) (Таблица 3.5).
Интратрахеальное введение эластазы сопровождалось уменьшением в легких количества клеток, экспрессирующих 1-антитрипсин (Таблица 3.6).
У животных, получавших ЭСД к 45 сут эксперимента число CD16+ клеток было в 1,6 раз выше по сравнению с животными из группы интактного контроля. Экспрессия CD31 и пан-цитокератина в альвеолах достоверно уменьшалась. Введение спиперона достоверно повышало число CD31-положительных клеток в легких и экспрессию пан-цитокератина по сравнению с количеством клеток у животных, не получавшими лечения. Экспрессия CD16 на клетках легких достоверно снижалась (Таблица 3.7).
Таким образом, введение D-галактозамина гидрохлорида, эластазы или ЭСД сопровождалось увеличением содержания клеток, экспрессирующих антиген CD16, и снижением экспрессии пан-цитокератина в легких. На моделях эмфиземы, вызванной эластазой или ЭСД, отмечалось уменьшение количества CD31+ клеток. Курсовое введение спиперона уменьшало экспрессию маркеров CD16 в легочной ткани и увеличивало содержание клеток, экспрессирующих пан-цитокератин. На моделях эмфиземы легких, вызванной эластазой или ЭСД, спиперон увеличивал количество CD31+ клеток.
Влияние дофамина и спиперона на эндотелиальные предшественники in vitro
Через 6 сут культивирования эндотелиальных клеток, полученных от животных из группы интактного контроля, отмечалось достоверное увеличение количества зрелых эндотелиальных клеток и их предшественников. После предварительной обработки спипероном, количество клеток было сопоставимо с аналогичными показателями в необработанной клеточной культуре. Количество Nectin+ клеток в присутствии дофамина была достоверно ниже по сравнению с клетками, обработанными спипероном. После предварительной обработки культуры спипероном количество клеток в культуре было сопоставимо с количеством клеток группы 1 (Таблица 3.19).
Прирост клеток, полученных от животных с эмфиземой легких, после культивирования был ниже относительно клеток, полученных от животных из группы интактного контроля. Количество клеток после культивирования со спипероном было сопоставимо с количеством клеток группы 2. Количество CD31+CD34+CD146+Nectin+ клеток после обработки дофамином было значительно выше, чем количество клеток в группе 2 и группе 3. После предварительной обработки спипероном количество клеток в культуре было сопоставимо с числом клеток после культивирования (группа 2) (Таблица 3.20).
Таким образом, дофамин значительно уменьшал число эндотелиальных клеток, полученных от животных интактного контроля, in vitro. Спиперон отменял ингибирующее действие дофамина.
Внесение дофамина в культуру эндотелиальных клеток, полученных от животных с эмфиземой легких, значительно увеличивает их количество. Добавление спиперона в культуру эндотелиальных клеток отменяет стимулирующее действие дофамина.