Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Общая характеристика группы производных индолокарбазолов 14
1.1.1. N-Гликозиды замещенных индоло[2,3-a]карбазолов 14
1.1.2. Производное индоло[2,3-a]карбазола ЛХС-1208 16
1.2. Применение методов повышения растворимости ЛП 17
1.2.1. Солюбилизация гидрофобных ЛВ 20
ПВП 22
ПЭГ 23
ДМСО 25
Растительные масла 28
Спирт этиловый 28
Глицерин 31
1.2.2. Получение ТДС 33
1.2.3. Комплексообразование с ЦД 35
1.2.4. Модификация структуры и изменение pH 1.36
2.5. Повышение растворимости за счет создания наноструктурированных ЛФ 37
Липосомы 40
Мицеллы 42
1.3. Стерилизующая фильтрация ЛП 43
1.4. Лиофилизация ЛП 46
Заключение 48
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Материалы и реактивы 50
2.2. Оборудование 52
2.3. Методы исследований 53
2.3.1. Метод получения ИЛФ ЛХС-1208 53
2.3.2. Стерилизация ИЛФ ЛХС-1208 53
2.3.3. Лиофилизация ИЛФ ЛХС-1208 53
2.3.4. Методы анализа ИЛФ-лио ЛХС-1208 54
Качественный хроматографический анализ ИЛФ-лио ЛХС 1208 54
Количественный спектрофотометрический анализ ЛХС-1208 в ИЛФ и ИЛФ лио 54
Валидация методики спектрофотометрического анализа ЛХС-1208 54
Определение рН ИЛФ-лио ЛХС-1208 55
Методика определения значения рН ИЛФ-лио ЛХС-1208 55
Методика определения потери в массе при высушивании 55
2.3.5. Статистическая обработка данных 55
Результаты собственных исследований
Глава 3. Разработка состава и технологии получения ИЛФ-лио ЛХС 1208 56
3.1. Разработка состава ИЛФ ЛХС-1208 56
3.1.1. Определение максимальной концентрации ЛХС-1208 в ДМСО 56
3.1.2. Выбор состава модельной ЛФ ЛХС-1208 для внутривенного введения 56
Использование Cremophor ELP в качестве солюбилизатора 56
Использование Kolliphor HS15 в качестве солюбилизатора 57
Использование Kollidon 17PF в качестве солюбилизатора 60
3.1.3. Оценка влияния стерилизующей фильтрации на содержание ЛХС-1208 в моделях ЛФ 61
3.1.4. Изучение стабильности моделей ЛФ ЛХС-1208 в процессе хранения 64
3.2. Разработка технологии получения ИЛФ ЛХС 1208 64
3.2.1. Оптимизация технологии получения раствора ЛХС-1208 64
3.2.2. Оценка качества раствора ЛХС-1208 в процессе хранения 67
3.3. Разработка технологии лиофилизации ИЛФ ЛХС 1208 68
3.3.1. Исследования по разработке методики лиофилизации ЛФ ЛХС-1208 с Kollidon 17PF 68
3.3.2. Усовершенствование режима лиофилизации ИЛФ ЛХС-1208 71
3.3.3. Изучение стабильности раствора, полученного после растворения ИЛФ-лио ЛХС-1208 74
3.4. Технологическая схема получения и состав ИЛФ-лио ЛХС 1208 75
Заключение 77
Глава 4. Разработка методик контроля качества ИЛФ-лио ЛХС 1208 79
4.1. Разработка методики ТСХ для качественного анализа ИЛФ-лио ЛХС 1208 79
4.1.1. Методика ТСХ-анализа ЛХС-1208 и Kollidon 17 PF 79
4.1.2. Методика ТСХ-анализа Kollidon 17 PF 81
4.1.3. Выбор подвижных фаз для ТСХ ЛХС-1208 и Kollidon 17 PF 82
4.1.4. Оценка пригодности хроматографических систем 84
4.2. Разработка методики спектрофотометрического анализа ЛХС-1208 в ИЛФ лио 88
4.2.1. Изучение спектральных характеристик ЛХС-1208 и его идентификация (определение подлинности) в ЛФ 88
4.2.2. Изучение влияния ВВ на спектрофотометрическое определение ЛХС-1208 в ЛФ (оценка специфичности) 89
4.2.3. Оценка соблюдения закона Бугера–Ламберта–Бера 90
4.2.4. Определение максимума поглощения для количественного спектрофотометрического анализа ЛХС-1208 в ЛФ 91
4.2.5. Количественное определение ЛХС-1208 в ИЛФ до и после лиофилизации 92
А. Методика спектрофотометрического определения ЛХС-1208 в ИЛФ 92
Б. Методика спектрофотометрического определения ЛХС-1208 в лиофилизате 93
4.2.6. Валидация методики спектрофотометрического анализа ЛХС 1208 94
Специфичность 95
Линейность 95
Правильность (точность) 97
Прецизионность 98
А. Повторяемость (сходимость) 98
Б. Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность 99
Заключение 101
Глава 5. Стандартизация и изучение стабильности в процессе хранения ИЛФ-лио ЛХС-1208 102
5.1. Показатели качества для стандартизации ИЛФ-лио ЛХС 1208 102
5.2. Изучение стабильности ИЛФ-лио ЛХС-1208 при хранении 105
Заключение 107
Общее заключение 108
Общие выводы 111
Список сокращений 113
Список иллюстрационного материала 115
Список литературы 117
Приложения 132
Приложение 1 133
Приложение 2 134
Приложение 3 135
- Применение методов повышения растворимости ЛП
- Оптимизация технологии получения раствора ЛХС-1208
- Оценка пригодности хроматографических систем
- Показатели качества для стандартизации ИЛФ-лио ЛХС 1208
Применение методов повышения растворимости ЛП
Разработка оптимальной ЛФ отобранного в экспериментальных исследованиях активного фармакологического вещества составляет основополагающее звено в алгоритме комплексных исследований по созданию терапевтического препарата. Для того чтобы получить требуемый фармакологический эффект, необходимо доставить ЛВ к пораженному органу. Задачей ЛФ является обеспечение оптимальных условий для максимальной биодоступности ЛВ. Всасыванию ЛВ в кровь предшествует его растворение в биологических жидкостях, после чего проникновение через физиологические мембраны проходит на уровне молекул активного вещества. Поэтому важным вопросом фармацевтической технологии является повышение растворимости гидрофобных и трудно растворимых ЛВ в воде и органических растворителях, поскольку их биологическая доступность в значительной степени зависит от растворимости и мембранной проницаемости [55]. Известно, что процесс растворения вещества связан с явлениями фазового перехода на границе твердое вещество – раствор. Интенсивность этого процесса зависит от площади поверхности раздела фаз. Однако микронизация (измельчение частиц) далеко не всегда приводит к увеличению скорости растворения и абсорбции ЛВ, что объясняется явлениями агломерации и агрегации. При микронизации происходит резкое увеличение удельной поверхности частиц и вместе с тем усиление сил ван-дер-ваальсова притяжения между неполярными молекулами, что и способствует процессам агломерации и агрегации [80].
Также при разных путях введения абсорбция ЛВ отличается за счёт взаимодействия его с биологическими жидкостями и тканями. Все это не позволяет получить водные растворы плохо растворимых веществ, а значит, и избежать таких нежелательных явлений, как абсцессы, денатурация белков, некрозы, обезвоживание тканей, эмболии и прочих осложнений, которые наблюдаются при применении масляных и спиртовых растворов в виде инъекций. Проявления токсичности способны стать критерием отбора перспективных лекарственных соединений, если не удается подобрать безопасные композиции, способ и режимы введения готовых ЛФ [47, 51].
Для большинства гидрофобных и труднорастворимых субстанций создание ЛФ достаточно трудоемкая задача, так как молекулы таких веществ неполярны и не смешиваются с таким полярным растворителем как вода, но хорошо растворимы в органических растворителях. Улучшение растворимости ЛВ в воде и органических растворителях предполагает значительное повышение их эффективности и биологической доступности, для достижения этих целей необходимо улучшить растворимость активных фармацевтических субстанций [57].
Ряд препаратов из-за низкой растворимости в воде либо не могут применяться в медицинской практике, либо в значительной степени теряют свой терапевтический эффект. Разработчикам ЛФ приходится учитывать ряд характеристик противоопухолевых препаратов: химическая лабильность, небольшая широта фармакологического действия, высокая токсичность, низкие терапевтические дозы, отсутствие специфичности. С учётом данных факторов большинство противоопухолевых препаратов выпускают в виде жидких или лиофилизированных растворов и применяют в виде внутривенных инфузий [49].
Онкологи должны пользоваться всем арсеналом противоопухолевых лекарств и вести борьбу за месяцы и годы жизни пациентов. Однако низкая избирательность противоопухолевого действия некоторых цитотоксических препаратов приводит к дозозависимому эффекту, ограничивающему их применение в клинике. Чем больше доза препарата, тем выше терапевтический эффект и тем больше токсических проявлений. Терапевтические подходы к совершенствованию лекарственной терапии опухолей сфокусированы на разработке новых систем доставки ЛС непосредственно к злокачественной клетке без повреждения нормальной ткани [13].
Для улучшения растворимости гидрофобных соединений используют различные методы и подходы, среди которых выделяют: физические, химические и физико-химические методы, а также некоторые технологические приемы (табл. 1).
Методы повышения растворимости:
1. Физические методы – получение твердых дисперсных систем (ТДС).
2. Химические методы – модификация структуры.
3. Физико-химические методы:
A) добавление сорастворителя;
Б) изменение pH;
B) введение в состав веществ липидной природы (масла);
Г) комплексообразование.
4. Технологические приемы:
А) измельчение;
Б) нагревание;
В) ультразвуковая обработка;
Г) эмульгирование;
Д) применение наноструктурированных систем доставки ЛВ к мишеням (липосомы, мицеллы).
Оптимизация технологии получения раствора ЛХС-1208
На предыдущем этапе исследований была выбрана модель ЛФ, содержащая 3 мг/мл – ЛХС-1208, 200 мг/мл – Kollidon 17PF и 55 мг/мл – ДМСО. На следующем этапе исследований необходимо было отработать основные критические параметры технологического процесса, к которым относятся:
1) скорость добавления раствора ЛХС-1208 в ДМСО к водному раствору Kollidon 17PF;
2) скорость перемешивания получаемого раствора.
Скорость добавления раствора ЛХС-1208 в ДМСО к водному раствору Kollidon 17PF так же как и скорость вращения пропеллерной мешалки оказывало влияние на концентрацию ЛХС-1208 в растворе, получаемом после стерилизующей фильтрации (содержание ЛХС-1208 до и после фильтрации определяли спектрофотометрически при длине волны 320±2 нм). В связи с этим проводили ряд исследований для выбора оптимальных значений этих параметров, в которых варьировали скорость добавления раствора ЛХС-1208 в ДМСО к водному раствору Kollidon 17PF в пределах от 5 до 20 мл/мин и скоростью вращения пропеллерной мешалки от 200 до 800 rpm (об/мин). Выяснилось, что при скорости добавления раствора ЛХС-1208 5 мл/мин увеличение скорости вращения мешалки не оказывало влияния на концентрацию ЛХС-1208 в конечном стерильном растворе (рис. 4).
Увеличение скорости добавления раствора ЛХС-1208 до 10 мл/мин позволяло обеспечить необходимую концентрацию ДВ при скорости вращения мешалки 400 rpm (об/мин), 600 rpm (об/мин) и 800 rpm (об/мин). При повышении скорости добавления раствора ЛХС-1208 до 15 и 20 мл/мин вне зависимости от скорости вращения мешалки добиться необходимого уровня ЛВ в стерильном растворе не удается.
На основании результатов проведенных экспериментов можно было сделать вывод, что в данных условиях наиболее приемлемыми являются следующие параметры технологического процесса:
1) скорость добавления раствора ЛХС-1208 в ДМСО к водному раствору Kollidon 17PF – 5 мл/мин, 10 мл/мин;
2) скорость вращения пропеллерной мешалки – 400 rpm (об/мин), 600 rpm (об/мин) и 800 rpm (об/мин).
Оптимизированная технология получения раствора ЛХС-1208
К массе субстанции ЛХС-1208 – 2970 мг добавляют отмеренное количество ДМСО – 50 мл, перемешивают до получения прозрачного оранжевого раствора (раствор А). Отдельно готовят раствор Kollidon 17 PF в воде для инъекций. Массу субстанции Kollidon 17 PF – 192 г растворяют с помощью мешалки в отмеренном объеме воды для инъекций – 720 мл до получения прозрачного слегка желтоватого раствора (раствор Б). Затем в раствор Б, не убирая мешалки, приливают по частям раствор А. Скорость добавления раствора А к раствору Б – 5 мл/мин, 10 мл/мин. Скорость вращения пропеллерной мешалки – 400 rpm (об/мин), 600 rpm (об/мин) и 800 rpm (об/мин). С целью стерилизации полученный раствор ЛХС-1208 фильтруют через ПЭС-фильтры, имеющие размер пор 0,22 мкм.
Оценка пригодности хроматографических систем
Пригодность системы – это характеристика аналитической методики, которая показывает надежность анализа в заданных условиях его проведения. Параметры пригодности системы обеспечивают применение метода в тех случаях, когда в процессе анализа возникают некоторые внутрилабораторные изменения условий анализа [9].
Оценку пригодности выбранных хроматографических систем проводили путем определения предела обнаружения вещества. В результате проведенных исследований установили, что предел обнаружения (минимальное содержание анализируемого вещества, определяемого данным методом) ЛХС-1208 в системе бензол/спирт 95% (1:1) составил 1 мкг. Предел обнаружения Kollidon 17 PF в системе спирт 95% /25% аммиак (3:2) составил 1 мкг. Оценка пригодности системы бензол/спирт 95% (1:1)
Приготовление раствора исследуемого образца ИЛФ-лио ЛХС-1208 К содержимому флакона ИЛФ-лио ЛХС-1208 добавляют 9 мл ДМСО и перемешивают. Концентрация ЛХС-1208 в полученном образце 1,0 мг/мл.
Приготовление СОВС
СОВС-1 – раствор ЛХС-1208 в ДМСО 1,0 мг/мл. Навеску ЛХС-1208 1,0 мг растворяют в 1 мл ДМСО.
Методика проведения анализа
На линию старта хроматографической пластинки наносят пробы:
1 – 5 мкл исследуемого образца ИЛФ-лио (ЛХС-1208 – 5,0 мкг, Kollidon 17PF – 335,0 мкг),
2 – 5 мкл СОВС-1 (ЛХС-1208 – 5,0 мкг),
3 – 1 мкл СОВС-1 (ЛХС-1208 – 1,0 мкг).
После подсушивания на воздухе в течение 10-15 мин. пластинку с нанесенными пробами помещают в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную смесью бензол/спирт 95% (1:1), плотно закрывают крышкой и хроматографируют восходящим способом. Когда расстояние от фронта растворителей до конца пластины составляет 1 см, т.е. после достижения фронтом элюента линии финиша (пробег 12 см), пластинку вынимают из камеры и высушивают в потоке теплого воздуха до полного удаления запаха растворителя. ЛХС-1208 идентифицируют на пластинке визуально по характерным желтым пятнам без использования специфических реактивов.
Значения Rf при проверке пригодности системы растворителей бензол/спирт 95% (1:1) составили (рис. 11):
1 – исследуемый образец ИЛФ-лио: ЛХС-1208 – 0,66;
2 – СОВС-1 5,0 мкг – 0,66;
3 – СОВС-1 1,0 мкг – 0,66.
Таким образом, хроматографическую систему бензол/спирт 95% (1:1) можно считать пригодной, если на пластинке напротив СОВС-1 (ЛХС-1208 1,0 мкг) видно округлое пятно желтого цвета.
Оценка пригодности системы спирт 95% /25% аммиак (3:2)
Приготовление раствора исследуемого образца ИЛФ-лио ЛХС-1208
К содержимому флакона ИЛФ-лио ЛХС-1208 добавляют 9 мл ДМСО и перемешивают. Концентрация ЛХС-1208 в полученном образце 1,0 мг/мл. Приготовление стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) СОВС-2 – раствор Kollidon 17PF в ДМСО 67,0 мг/мл. Навеску Kollidon 17PF 67,0 мг растворяют в 1 мл ДМСО. Методика проведения анализа
На линию старта хроматографической пластинки наносят пробы: 1 – 5 мкл исследуемого образца ИЛФ-лио (ЛХС-1208 – 5,0 мкг, Kollidon 17PF – 335,0 мкг), 2 – 5 мкл СОВС-1 (Kollidon 17PF – 335,0 мкг), 3 – 1 мкл СОВС-1 (Kollidon 17PF – 67,0 мкг).
После подсушивания на воздухе в течение 10-15 мин. пластинку с нанесенными пробами помещают в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную смесью спирт 95% /25% аммиак (3:2), плотно закрывают крышкой и хроматографируют восходящим способом. Когда расстояние от фронта растворителей до конца пластины составляет 1 см, т.е. после достижения фронтом элюента линии финиша (пробег 12 см), пластинку вынимают из камеры и высушивают в потоке теплого воздуха до полного удаления запаха растворителя. Для обнаружения Kollidon 17PF пластинку помещают в камеру, насыщенную парами йода, и выдерживают около 1 мин до появления светло-желтых пятен.
Значения Rf при проверке пригодности системы растворителей спирт 95% /25% аммиак (3:2) составили (рис. 12):
1 – исследуемый образец ИЛФ-лио: Kollidon 17PF – 0,69;
2 – СОВС-1 335,0 мкг – 0,69;
3 – СОВС-1 67,0 мкг – 0,69
Таким образом, хроматографическую систему спирт 95% /25% аммиак (3:2) можно считать пригодной, если на пластинке напротив СОВС-2 (Kollidon 17PF 67,0 мкг) присутствует хорошо очерченное светло-желтое пятно.
Показатели качества для стандартизации ИЛФ-лио ЛХС 1208
Для разработки проекта НД на «ЛХС-1208, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 9 мг» требовалось определить критерии, по которым следует контролировать качество данного препарата после получения и в процессе хранения. Для стандартизации данной ЛФ согласно ГФ XIII были выбраны следующие показатели качества: описание, растворимость, подлинность, количественное определение, однородность дозирования, средняя масса содержимого флакона, значение рН, потеря в массе при высушивании. Приведенные критерии качества были приняты на основании результатов, полученных в ходе исследования образцов разработанной ЛФ, с учетом требований НД.
Описание. По внешнему виду все наработанные серии препарата представляли собой сухую пористую массу желтого цвета.
Растворимост ь. При добавлении к содержимому флакона 2,8 мл воды и перемешивании в течение 10 мин образовывался однородный раствор оранжевого цвета.
Подлинность.
Спектрофотометрический анализ (методика представлена в разделе 4.2.5.Б.). В области от 200 до 800 нм электронные спектры поглощения растворов, приготовленных для количественного определения ЛХС-1208 в ЛФ, имели максимумы поглощения при длинах волн: (287±2) и (320±2) нм. ТСХ-анализ (методика представлена в разделе 4.1.1). При использовании системы бензол/спирт 95% (1:1) на хроматограмме наблюдали округлое пятно желтого цвета на уровне СОВС-1 ЛХС-1208 (Rf=0,66). При использовании системы спирт 95% /25% аммиак (3:2) и после помещения хроматограммы в йодную камеру проявлялось хорошо очерченное светло-желтое пятно Kollidon 17PF на уровне СОВС-2 (Rf=0,69).
Количественное определение ЛХС-1208 в ЛФ осуществляли методом спектрофотометрии с использованием раствора СО (методика представлена в разделе 4.2.5.Б.)
Однородность дозирования. Испытание на «однородность дозирования» проводили способом количественного определения содержания ЛХС-1208 по отдельности в каждом отобранном образце препарата. С этой целью отбирали случайным образом по 10 флаконов от испытуемой серии. Каждый из полученных результатов выражали в процентах от номинального содержания действующего вещества в одном флаконе (100%) – 9,3 мг для серии 090414; 9,4 мг для серии 100414; 9,5 мг для серии 110414. Согласно ОФС.1.4.2.0008.15 «Однородность дозирования», для 10 отобранных единиц анализа отклонение от номинала не должно превышать 15% [17].
Из результатов, представленных в табл. 22, видно, что содержание ЛХС-1208 во флаконе для 3 наработанных серий препарата находилось в пределах 95 – 109% от номинала, что укладывается в допустимые нормы отклонения.
Средняя масса содержимого флакона. Определение средней массы проводили на 20 флаконах каждой серии. Согласно требованию нормативной документации допускается отклонение от средней массы ±10% (ОФС.1.4.2.0009.15 «Однородность массы дозированных лекарственных форм») [17].
Средняя масса содержимого флаконов указанных серий колебалась в пределах от 0,620 г до 0,760 г (табл. 22). При этом номинальная масса содержимого флакона 0,750 г.
рН. Определение проводили потенциометрически согласно ГФ XIII Т.1. [16]. Предварительно к содержимому флакона добавляли 10 мл воды для инъекций и перемешивали в течение 10 мин до образования однородной дисперсии. Для всех наработанных серий ИЛФ-лио ЛХС-1208 значение рН находилось в диапазоне 3,5–4,5.
Потеря в массе при высушивании. Во всех исследованных образцах потеря в массе при высушивании не превышала значения 7%.
Спецификация на «ЛХС- 1208, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 9 мг» представлена в прил. 1.