Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1. Фотодинамическая терапия 17
1.1.1. Фотодинамическая терапия в онкологии 17
1.1.2. Сущность метода ФДТ 19
1.1.3. Типы фотореакций и механизмы гибели опухолевой клетки 23
1.1.4. Источники света для ФДТ 26
1.1.5. Фотосенсибилизаторы ФС I поколения 30
ФС II поколения. Хлорины 32
ФС III поколения. Липосомальные ФС 40
Борхлорин – борированное производное хлорина е6 42
1.2. Липосомы 44
1.2.1. Свойства липосом 44
1.2.2. 48
1.2.3. Включение лекарственных веществ в липосомы 53
1.2.4. Классификация липосом 55
1.2.5. Методы получения липосом 59
1.2.6. Стерилизация липосом 63
1.2.7. Лиофилизация липосом 65
1.2.8. Контроль качества ЛЛФ 67
Заключение 69
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 71
2.1. Материалы и реактивы 71
2.2. Оборудование 73
2.3. Методы исследования 74
2.3.1. Методы получения липосом 74
А. Метод получения многослойных липосом борхлорина 74
Б. Методы получения однослойных липосом борхлорина 74 В. Метод получения «пустых» липосом 75
2.3.2. Стерилизация липосом борхлорина 75
2.3.3. Лиофилизация ЛЛФ борхлорина 75
Методика лиофилизации ЛЛФ борхлорина 75
2.3.4. Методы анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина 76
Качественный хроматографический анализ ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина 76
Количественный спектрофотометрический анализ борхлорина в ЛЛФ и
ЛЛФ-лио 76
Валидация методики спектрофотометрического анализа борхлорина 77
Определение эффективности включения борхлорина в липосомы 78
Определение рН липосомальной дисперсии борхлорина 78
Методика определения значения рН ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина 78
Определение диаметра липосом борхлорина 78
Методика определения размера липосом борхлорина 80
Определение формы липосом борхлорина с помощью электронной микроскопии (негативное контрастирование) 80
Методика определения потери в массе при высушивании 80
2.3.5. Статистическая обработка данных 80
Результаты собственных исследований
ГЛАВА 3. Разработка состава и технологии получения ЛЛФ-лио борхлорина 81
3.1. Разработка состава ЛЛФ борхлорина 81
3.2. Разработка технологии получения ЛЛФ-лио борхлорина
3.2.1. Получение липидной пленки 90
3.2.2. Выбор дисперсионной среды для гидратации липидной пленки 92
3.2.3. Получение однослойных липосом борхлорина
Метод экструзии 93
Метод озвучивания 98
Метод гомогенизации 101
3.2.4. Разработка технологии лиофилизации ЛЛФ борхлорина 104
Выбор криопротектора для лиофилизации ЛЛФ борхлорина 104
Изучение влияния концентрации сахарозы в качестве криопротектора для лиофилизации ЛЛФ борхлорина 108
Выбор режима лиофилизации ЛЛФ борхлорина 110
3.2.5. Сравнение технологий получения ЛЛФ-лио борхлорина 114
3.2.6. Технологическая схема получения и состав ЛЛФ-лио борхлорина 116
Заключение 118
ГЛАВА 4. Разработка методик контроля качества ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина 120
4.1. Разработка методики ТСХ для качественного анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина 120
4.1.1. Методика ТСХ-анализа борхлорина и липидных компонентов ЛФ 120
4.1.2. Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа борхлорина и липидных компонентов ЛФ 122
4.1.3. Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа ФХ, входящего в состав ЛФ
борхлорина 125
4.1.4. ТСХ-анализ сахарозы, входящей в состав ЛЛФ-лио борхлорина 129
4.1.5. Оценка пригодности хроматографической системы 131
4.2. Разработка методики спектрофотометрического анализа борхлорина в ЛЛФ и ЛЛФ-лио 137
4.2.1. Изучение спектральных характеристик борхлорина и его идентификация (определение подлинности) в ЛФ 137
4.2.2. Изучение влияния вспомогательных веществ на спектрофотометрическое определение борхлорина в ЛФ (оценка специфичности) 138
4.2.3. Определение максимума поглощения для количественного спектрофотометрического анализа борхлорина в ЛФ 139
4.2.4. Оценка соблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера 140
4.2.5. Количественное определение борхлорина в липосомальной дисперсии до и после лиофилизации 140
А. Методика спектрофотометрического определения борхлорина в ЛЛФ 141
Б. Методика спектрофотометрического определения борхлорина в лиофилизате 142
4.2.6. Валидация методики спектрофотометрического анализа борхлорина 143
Специфичность 143
Диапазон применения 143
Линейность 143
Правильность (точность) 146
Прецизионность 147
А. Повторяемость (сходимость) 147
Б. Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность 148
Робастность 149
Заключение 151
Глава 5. Стандартизация и изучение стабильности в процессе хранения ЛЛФ-лио борхлорина 153
5.1. Показатели для стандартизации ЛЛФ-лио борхлорина 153
5.2. Изучение стабильности ЛЛФ-лио борхлорина в процессе хранения 157
Заключение 159
Общее заключение 160
Общие выводы 163
Список литературы
- Типы фотореакций и механизмы гибели опухолевой клетки
- Методы получения однослойных липосом борхлорина 74 В. Метод получения «пустых» липосом
- Методика определения значения рН ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина
- Изучение спектральных характеристик борхлорина и его идентификация (определение подлинности) в ЛФ
Типы фотореакций и механизмы гибели опухолевой клетки
Борьба со злокачественными новообразованиями продолжает оставаться одной из приоритетных задач в медицине. По прогнозам ВОЗ за 1999-2020 гг. заболеваемость и смертность от онкологических заболеваний во всем мире возрастет в 2 раза, поэтому разработка и внедрение новых, высокотехнологических методов ранней диагностики и лечения рака является актуальной проблемой современной медицины [114].
Возможности современной онкологии значительно расширились с появлением ФДТ, которая по сравнению с традиционными методами лечения рака, обладает целым рядом преимуществ: высокая эффективность, позволяющая добиться 5-летних благоприятных отдаленных результатов; возможность применения ФДТ для лечения больных, у которых стандартные методы лечения оказались неэффективны или противопоказаны [39]; избирательное разрушение опухоли при максимальном сохранении жизнеспособности окружающих опухоль нормальных тканей, обеспечение хорошего косметического и функционального результатов [23, 102, 105]; отсутствие риска хирургического вмешательства, тяжелых местных и системных побочных реакций и осложнений, безопасность многократного повторения при необходимости лечебного сеанса; возможность использования для флюоресцентной диагностики (ФД) [103]. ФДТ является результатом комбинированного действия химиотерапевтических и физических методов воздействия: светочувствительного соединения - ФС, локального светового воздействия и кислорода. Противоопухолевые эффекты данного вида лечения обусловлены комбинацией прямого фотоповреждения клеток, разрушения сосудистой сети опухоли и активации иммунного ответа [118].
ФС применяются как инициаторы химической реакции в биологической ткани. Первое детальное описание «химической фотосенсибилизации» биоткани относится к началу XX века. В 1900 г. О. Рааб установил, что низкие концентрации акридинового и других красителей, химически инертных в темноте, приводят к быстрой гибели парамеции при облучении их солнечным светом. В 1903-1905 гг. Г. Таппинер и А. Джесионек опубликовали результаты клинического применения эозина и флуоресцеина в качестве ФС при лечении герпеса, псориаза и рака кожи [122].
В 20-е гг. XX столетия было обнаружено, что раковая клетка обладает одним чрезвычайно интересным свойством: она может селективно накапливать и удерживать окрашенные вещества, как находящиеся в организме (эндогенные порфирины), так и вводимые в него извне (экзогенные порфирины). Наблюдение А. Поликарда в 1924 г. о том, что накопившиеся в опухоли животного эндогенные порфирины обладают способностью флуоресцировать при облучении светом видимой части спектра, явилось важным шагом на пути к созданию метода ФДТ рака [69].
Современная эпоха применения ФДТ в онкологии началась в начале 60-х гг. XX века с публикаций Р. Липсона, в которых было показано, что введенное внутривенно производное гематопорфирина (HpD) накапливается в опухоли и при облучении синим светом флуоресцирует в красной области спектра. В 1966 г. появилось первое сообщение о применении HpD для ФД и лечения пациентки с раком молочной железы, а спустя десять лет HpD был успешно применен для лечения рака мочевого пузыря [24]. Началом широкого клинического применения ФДТ в онкологии считается 1978 г., когда американский профессор Т. Догерти сообщил об успешном лечении методом ФДТ 25 больных с опухолями кожи [114]. В дальнейшем метод ФДТ получил развитие в Великобритании, Франции, Германии, Италии, Японии, Китае, Южной Корее и ряде других стран. Несмотря на многолетние исследования, в России ФДТ получила развитие только с 1992 г., когда в Московском институте тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова под руководством профессора А.Ф. Миронова был создан первый отечественный ФС – фотогем, относящийся к группе порфиринов [100].
В настоящее время ФДТ применяется при опухолях наружных и висцеральных локализаций, ранних и распространенных стадиях процесса, как компонент комбинированного и комплексного лечения рака различных локализаций [25]. Кроме того, ФДТ нашла широкое применение при целом ряде неопухолевых заболеваний в офтальмологии, оториноларингологии, гинекологии, дерматологии и других областях медицины.
На первом этапе в организм больного вводится ФС. В онкологии применяют в основном внутривенное введение ФС, реже – реже – внутрь полости и перорально, а также в виде наружной аппликации [101].
На втором этапе, который имеет продолжительность от нескольких часов до нескольких суток, происходит распределение и накопление ФС в патологической ткани [69]. При этом препарат, обладающий тропностью к опухолевым клеткам, концентрируется в опухоли и повышает ее чувствительность к свету в спектральных диапазонах, соответствующих полосам поглощения ФС [101].
Полностью не ясен механизм проникновения и селективного удерживания ФС в опухолевых клетках, однако существует несколько гипотез: более длительная задержка опухолью и более быстрое выведение ФС из окружающей нормальной ткани, обусловленные аномальным строением кровеносных и лимфатических сосудов опухоли, их повышенной проницаемостью и связыванием ФС с альбуминами; низкий рН внеклеточной жидкости в опухолях способствует связыванию ФС клетками, так как при снижении рН повышается липофильность порфиринов и облегчается проникновение их в клетки; особенности липидного обмена биомембран опухолевых клеток. В опухоли много рецепторов липопротеинов низкой плотности, связывающих большое количество гидрофобных молекул ФС [137]. Фармакокинетика ФС, в особенности уровень накопления в тканях, проникновение в клетки и характер его внутритканевого и внутриклеточного распределения (Рисунок 2) зависит не только от свойств органов или тканей, но и в значительной степени от физико-химических характеристик самого ФС [88].
Гидрофильные ФС локализуются преимущественно в кровеносных сосудах. Проникновению в клетку полярных ФС препятствует липидный бислой клеточной мембраны. Для анионных красителей дополнительным барьером служит отрицательный заряд клеточной поверхности. Поэтому гидрофильные анионные ФС, такие как N-аспартил-хлорин е6 и фотосенс, попадают в цитоплазму, а затем в эндосомы и лизосомы путем эндоцитоза. При освещении лизосомальные мембраны разрушаются, а ФС может перераспределяться внутри клетки и неспецифически окрашивать внутриклеточные структуры [113, 146]. Катионные красители, например, некоторые производные порфирина, селективно локализуются в митохондриях, матрикс которых имеет высокий отрицательный потенциал порядка 200 мВ относительно цитозоля [140].
Методы получения однослойных липосом борхлорина 74 В. Метод получения «пустых» липосом
Стадию замораживания следует проводить с учетом индивидуальных для каждого вещества эвтектических температур (Тэ). Тэ – наименьшая температура, при которой происходит кристаллизация (замораживание) подлежащего высушиванию материала. Установление Тэ лабильных препаратов обязательно, так как позволяет определить допустимую температуру нагревания при высушивании [67].
Применение лиофилизации для повышения стабильности ЛЛФ основано на предотвращении гидролиза как липосомальных ФЛ, так и лабильных ЛВ, а процессы химической и физической деградации сдерживаются низкой подвижностью липидов в твердой фазе. К сожалению, сама лиофилизация может приводить к разрушению бислойной мембраны липосом, поэтому необходимо проводить ее в определенном режиме и с добавлением вспомогательных веществ (криопротекторов), обеспечивающих сохранение бислойных структур [170]. Криопротектор защищает липосомы от повреждения кристаллами льда при замораживании, а также ингибирует их слияние и агрегацию. Добавление криопротектора в водную фазу липосомальной дисперсии до замораживания с последующей сублимацией позволяет предупредить фазовое разделение липидной композиции и предохранить инкапсулированное ЛВ от вытекания, а также сохранить способность липосом к регидратации [5]. В качестве криопротекторов при лиофилизации липосом наиболее часто используют полимеры (коллидон, ПВП, ПЭГ) и углеводы (сахароза, маннит, лактоза, трегалоза и др.) [4].
Проведение процесса лиофилизации определяется рядом факторов: величиной, зарядом и фосфолипидным составом липосом, физико-химическими свойствами вводимого в них вещества, структурой бислоя и другими факторами. По этой причине режим лиофилизации для каждого препарата необходимо подбирать индивидуально [49]. 1.2.8. Контроль качества ЛЛФ Качественные показатели можно разделить на три группы: I – показатели, характеризующие индивидуальные свойства действующих и вспомогательных веществ; II – показатели качества, характеризующие готовую форму препарата (стерильность, величина рН, токсичность, пирогенность); III – показатели, хаактеризующие свойства липосом (включение ЛВ, размер везикул, дзета-потенциал и др.) [51]. Испытания должны затрагивать те свойства продукта, которые подвержены изменениям при хранении и могут влиять на качество готового препарата, причем методы количественного определения должны позволять характеризовать стабильность.
Особое внимание необходимо уделять структуре и свойствам новых продуктов, образующихся при деградации (разложении) компонентов препарата. В этом случае новые продукты разложения необходимо квалифицировать. Так, например, должны быть идентифицированы и указаны граничные количества образующихся примесей, например, для фосфатидилхолина (лизопродукты или свободные жирные кислоты) [50]. Испытания должны указать на те свойства, которые подвержены изменению при технологии получения препаратов или при их хранении и могут влиять на качество липосомальных препаратов, их эффективность и безопасность применения. Важным вопросом является разработка метода определения количества включенного в липосомы ЛВ, причем такие определения должны проводиться как в процессе изготовления липосом и их лиофилизации, так и при хранении препарата в течение срока его годности. Этот вопрос должен решаться для каждого вида липосом непосредственно разработчиком препарата, при этом валидация аналитических методов является обязательным условием его использования.
К одному из проблемных вопросов можно отнести испытание на механические включения (посторонние частицы). Их определение само по себе сложно, во-первых, так как препарат представляет собой окрашенную эмульсионную жидкость, а во-вторых, препарат лиофилизирован, что требует высокого качества стекла и укупорочных материалов, класса чистоты при изготовлении и розливе препарата (класс А) [51].
Одним из основных требований к препаратам парентерального введения является отсутствие пирогенности. Учитывая, что пирогенные вещества, в большинстве случаев, являются бактериальными липополисахаридами и обладают большой устойчивостью к нагреванию (разрушаются только при длительной обработке при температуре выше 200С), получение липосомальных препаратов, начиная от липидной субстанции до готового препарата, необходимо осуществлять в условиях асептики, предотвращая загрязнение материалов как микроорганизмами, так и продуктами их жизнедеятельности. С учетом этих факторов, ввиду невозможности использования термической обработки отдельных компонентов формируемых липосом, при изготовлении липосомных препаратов следует применять стерильные и апирогенные составляющие: липидные субстанции, воду для инъекций, стабилизаторы [49]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ФДТ представляет перспективный метод лечения злокачественных новообразований и ряда неопухолевых заболеваний, который яляется результатом комбинированного действия двух компонентов – ФС и света. Одним из ведущих направлений развития и совершенствования ФДТ злокачественных новообразований является создание ФС, обладающих высокой фототоксичностью активностью. В течение двух последних десятилетий большой интерес в качестве ФС вызывают производные хлорофилла, в частности хлорины. ФС хлоринового ряда обладают интенсивной полосой поглощения в длинноволновой красной области спектра, оптимальной туморотропностью и высокой фототоксичностью при отсутствии «темновой» токсичности, что обусловлено быстрым выведением препарата из организма.
Борхлорин представляет собой оригинальный отечественный фотосенсибилизатор, борированное производное хлорина е6, с максимумом поглощения около 662 нм, который благодаря своим свойствам является весьма перспективным препаратом для ФДТ злокачественных новообразований. Результаты доклинических исследований показали, что борхлорин обладает достаточно высокой фотодинамической активностью при лечении меланомы В-16, саркомы М-1, карциномы Эрлиха и карциономы Льюиса.
Однако борхлорин имеет существенный недостаток – низкую растворимость в воде, что обуславливает сложность его внутривенного введения при проведении ФДТ.
Одним из возможных способов солюбилизации гидрофобных ФС является их включение в биосовместимые фосфолипидные везикулы – липосомы. Использование липосом позволяет повысить накопление ФС в опухоли посредством пассивного нацеливания и снизить его накопление в здоровых тканях, защитить ФС от деградации и преждевременного клиренса, а также обеспечивает проникновение ФС в опухолевую клетку.
Создание ЛЛФ – многофакторная задача, решение которой требует учета всех ее многочисленных составляющих – от выбора исходных компонентов до контроля качества конечного продукта. А свойства конечного продукта, главным образом, зависят от поставленной цели и технологических возможностей разработчика. Существенным образом на свойства липосом влияют методы их получения. От технологии приготовления зависит размер везикул, степень окисления липидов, входящих в состав оболочки, ЭВ инкапсулируемого вещества, стабильность при хранении и другие показатели.
Методика определения значения рН ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина
При включении в состав подвижной фазы таких высокополярных компонентов как метанол, этанол, ацетон и аммиак (системы 1-3, 6, 7, 10) значительно сокращалось время пробега элюента, однако снижалась подвижность борхлорина и ФХ, и соответствующие им пятна на хроматограмме имели значения Rf менее 0,20, либо оставались на старте. При наличии в системах 11-16 пропанола и бутанола отмечалось значительное увеличение времени пробега элюента и подвижности борхлорина. В системах 4 и 12 пятна борхлорина и холестерина перемещались совместно с фронтом растворителей, а пятно ФХ едва отходило от старта. В системах 5 и 16 (Рисунок 37А, 37Б) наблюдалось хорошее разделение компонентов ЛФ, однако значение Rf для холестерина превысило 0,80. Время пробега подвижной фазы 16 составило более 5 ч, что затрудняет проведение анализа. А в случае использования элюирующей системы 5 отмечено стойкое расхождение в значениях Rf для борхлорина и ФХ в ЛФ и стандартных растворах. Поэтому данные системы непригодны для качественного анализа ЛФ борхлорина. (бутанол/ледяная уксусная кислота/вода (6:3:2)) обеспечивала наилучшее разделение борхлорина (Rf=0,50) и холестерина (Rf=0,67) в течение 3,5 ч, в то время как пятно ФХ практически оставалось на старте (Рисунок 38А). Однако, несмотря на то, что данная система не позволяет одновременно провести ТСХ-анализ всех трех заявленных компонентов ЛФ, ее можно использовать для определения борхлорина и холестерина. Для идентификации холестерина в составе ЛФ также можно использовать систему 7 – хлороформ/аммиак (19:1) (Рисунок 38Б).
Поскольку ни одна из предложенных систем не подходит для обнаружения ФХ, необходимо было подобрать другую систему растворителей для ТСХ-анализа этого компонента. В большинстве случаев для разделения и анализа ФЛ используют элюирующие системы, содержащие в своем составе метанол [3, 93, 119]. Однако метанол является токсичным и труднодоступным растворителем. Поэтому была проведена работа по замене данного растворителя и подбору системы с более приемлемыми составляющими.
С этой целью в качестве подвижных фаз были изучены следующие системы растворителей (Таблица 17):
Выбор подвижной фазы при ТСХ-анализе ФХ в составе ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина Система Значение Rf ФХ Время пробега Растворители Соотношение Е ЛФ СОВС-2 хлороформ/этанол/пропанол/ ледяная уксусная кислота/вода 6:4:2:2:1 18,6 0,33 0,29 2ч 15 хлороформ/этанол/ ледяная уксусная кислота/вода 40:10:7:3 12,8 0,50 0,77 3ч 35
В системах 1, 7 и 8 определение ФХ было затруднено, поскольку наблюдалось нечеткое разделение хроматографических зон – образующиеся пятна имели размытый характер. В системах 3, 5-8 отмечалось хорошее разделение зон, однако подвижность пятен ФХ была низкой и величина Rf имела значение не более 0,21. В элюирующих системах 2 и 4 наблюдалось хорошее разделение пятен ФХ, а величина Rf находилась в пределах 0,37-0,77 (Рисунок 39А, 39Б). Однако значения Rf пятен ФХ в ЛФ и стандартном растворе значительно различались.
На качество разделения хроматографических зон оказывает влияние не только качественный состав подвижной фазы, но и соотношение растворителей, поэтому было решено изменить соотношения компонентов 2 и 4 систем. В подвижной фазе 2 (хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода (40:10:7:3)) изменяли содержание этанола и воды, а в подвижной фазе 4 (хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода (6:2:2:2:1)) варьировали количество ацетона.
При снижении доли этанола до соотношения 40:7:7:5 в системе хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода величина Rf пятен ФХ в ЛФ и СОВС-2 достигла значения 0,41, а при использовании подвижной фазы хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1) пятна ФХ имели еще большее значение Rf – 0,48 (Рисунок 40А, 40Б). Хотя время хроматографирования при использовании системы хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1) больше на 25 мин по сравнению с продолжительностью анализа в системе хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода (40:7:7:5), выбор сделан в пользу первой из-за более высокой подвижности пятен ФХ.
В ходе исследования было доказано, что выбранные системы растворителей подходят для идентификации борхлорина, ФХ и холестерина как в свежеприготовленных липосомах, так и в лиофилизате. Совместный анализ данных компонентов и сахарозы затруднен: из-за высокой концентрации последней при обработке пластины раствором -нафтола проявляются большие размытые пятна, нарушающие общую хроматографическую картину и мешающие определению других веществ. Поэтому качественный анализ сахарозы проводился отдельно.
Изучение спектральных характеристик борхлорина и его идентификация (определение подлинности) в ЛФ
Для стандартизации ЛЛФ-лио борхлорина выбраны показатели, по которым следует контролировать качество препарата после получения и в процессе хранения. К данным показателям относятся: описание, регидратируемость, подлинность, количественное определение, однородность дозирования, средняя масса содержимого флакона, размер везикул, рН, потеря в массе при высушивании. Разработан проект НД на ЛФ «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг». Изучение стабильности по выбранным параметрам качества трех серий ЛЛФ-лио борхлорина при хранении позволило установить срок годности препарата не менее 2 лет.
Приоритетной целью стратегии развития фармацевтической промышленности на период до 2020 г. является разработка и производство инновационных лекарственных средств, создание максимально эффективных лекарственных препаратов, обладающих минимумом побочных реакций. Одним из многообещающих направлений повышения эффективности лекарственной терапии является применение нанотехнологий, в частности – создание систем доставки на основе наноносителей. На протяжении двух последних десятилетий в мировой фармацевтической практике интенсивно разрабатываются и исследуются препараты на основе липосом. Липосомальные препараты обладают рядом несомненных преимуществ – защищают здоровые клетки от токсического действия лекарственных веществ, способны проявлять нацеленную специфичность за счет селективного проникновения из крови в ткани, защищают лекарственные вещества от деградации; изменяют фармакокинетику лекарственных препаратов, повышая их фармакологическую эффективность; позволяют создавать водорастворимые лекарственные формы для гидрофобных субстанций, увеличивая тем самым их биодоступность. Борхлорин является перспективным отечественным фотосенсибилизатором для ФДТ опухолей, однако его введение в организм затруднено, в связи с наличием у него гидрофобных свойств. Поэтому целью проведенного исследования являлось создание лиофилизированной стерически стабилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина, позволяющей вводить препарат внутривенно.
На первоначальном этапе работы разрабатывали состав и технологию получения ЛЛФ-лио борхлорина. В результате технологических исследований из 19 наработанных моделей ЛЛФ выбран оптимальный состав с молярными соотношениями компонентов борхлорин/ФХ 1:200 и ФХ/холестерин/ПЭГ-ДГФА 1:0,33:0,004 (борхлорин/ФХ/холестерин/ПЭГ-ДГФА=1,0:200,0:67,0:0,8). В качестве растворителя для регидратации липидной пленки выбрана вода для инъекций, которая позволяет получить ЛЛФ борхлорина надлежащего качества. В результате сравнительного анализа способов получения ОСЛ борхлорина установлено, что наиболее оптимальным методом является 5-кратная экструзия под давлением с использованием нейлонового фильтра с диаметром пор 0,22 мкм, которая обеспечивает получение стабильной в процессе хранения липосомальной дисперсии с приемлемым размером везикул и высоким уровнем включения борхлорина в липосомы. Для увеличения срока хранения предложена технология сублимационной сушки ЛЛФ борхлорина. Для лиофилизации липосом с борхлорином выбран режим с быстрым снижением температуры на стадии замораживания. С целью обеспечения сохранения качества липосомальной дисперсии в процессе лиофилизации подобран эффективный криопротектор – сахароза в молярном соотношении ФХ/сахароза 1:5, которая обеспечивает стабильность структуры липосом в процессе лиофилизации с сохранением размера везикул и уровня включения борхлорина.
На следующем этапе исследования разрабатывали методики химико-фармацевтического анализа для контроля качества ЛФ борхлорина. Для качественного анализа компонентов ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина предложена хроматографическая методика и выбраны три системы растворителей: бутанол/ледяная уксусная кислота/вода (6:3:2) – для обнаружения борхлорина (Rf=0,50) и холестерина (Rf=0,67), хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1) – для обнаружения ФХ (Rf=0,48) и ацетон/ледяная уксусная кислота/вода (15:3:2) – для идентификации сахарозы (Rf=0,55).
Для количественного определения борхлорина в разработанной ЛФ разработана и валидирована методика спектрофотометрического анализа.
При изучении абсорбционных характеристик борхлорина выявлено, что спектр поглощения липосомального борхлорина идентичен спектру поглощения субстанции борхлорина по положению максимумов и форме кривой. Установлено, что вспомогательные вещества, входящие в состав ЛФ, и спирт 95%, используемый в качестве раствора сравнения, практически не поглощают излучение в области максимумов поглощения борхлорина. В качестве рабочей длины волны для анализа борхлорина в ЛЛФ и ЛЛФ-лио выбрана полоса поглощения средней интенсивности с максимумом 662 нм. Поглощение спиртового раствора борхлорина подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера: линейная зависимость значения оптической плотности от концентрации борхлорина показана в интервале концентраций от 2 до 20 мкг/мл. Относительная ошибка спектрофотометрического определения концентрации борхлорина в липосомальной дисперсии до и после лиофилизации составила менее 2%. При помощи валидационной оценки установлено, что разработанная методика количественного анализа борхлорина является специфичной, линейной, правильной, прецизионной и робастной.
Для стандартизации разработанной ЛФ «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг» выбраны показатели, по которым следует контролировать качество препарата после получения и в процессе хранения. Изучение стабильности по выбранным параметрам качества экспериментальных серий ЛЛФ-лио борхлорина при хранении позволило установить срок годности препарата не менее 2 лет.