Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 17
1.1. Окислительный стресс и роль активных форм кислорода в жизнедеятельности организма 17
1.2. Физиологические механизмы реакции теплокровного организма на холодовое воздействие .24
1.3. Физиологические механизмы реакции теплокровного организма на тепловое воздействие 30
1.4. Физиологические механизмы реакции теплокровного организма на ультрафиолетовое облучение .35
1.5. Защитные механизмы антиоксидантов на основе янтарной кислоты 42
1.6. Арабиногалактан лиственницы – свойства и перспективы использования 56
ГЛАВА 2 Собственные исследования 65
2.1. Материалы и методы исследования 65
2.2. Результаты биохимических исследований
2.2.1. Защитные свойства ремаксола и цитофлавина при воздействии на экспериментальных животных низких температур .82
2.2.2. Влияние ремаксола и цитофлавина на содержание продуктов ПОЛ в организме экспериментальных животных при холодовом воздействии .83
2.2.3. Исследование влияния ремаксола на содержание продуктов ПОЛ в крови крыс при холодовом воздействии .83
2.2.4. Исследование влияния цитофлавина на содержание продуктов ПОЛ в крови крыс при холодовом воздействии 86
2.2.5. Влияние арабиногалактана на содержание продуктов ПОЛ в организме экспериментальных животных при холодовом воздействии 89
2.2.6. Сравнительная оценка антиоксидантного действия
сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на продукты ПОЛ в крови крыс при длительном холодовом стрессе 94
2.2.7. Влияние ремаксола на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при холодовом воздействии .98
2.2.8. Влияние цитофлавина на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при холодовом воздействии .103
2.2.9. Влияние арабиногалактана на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при холодовом воздействии 107
2.2.10. Сравнительная оценка антиоксидантного действия сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на основные компоненты АОС в крови крыс при длительном холодовом стрессе . 109
2.2.11. Защитные свойства ремаксола и цитофлавина при воздействии на экспериментальных животных высоких температур .115
2.2.12. Исследование влияния ремаксола на содержание продуктов ПОЛ в крови крыс при тепловом воздействии 115
2.2.13. Исследование влияния цитофлавина на содержание продуктов ПОЛ в крови крыс при тепловом воздействии 118
2.2.14. Исследование влияния арабиногалактана на содержание продуктов ПОЛ в крови крыс при тепловом воздействии .122
2.2.15. Сравнительная оценка антиоксидантного действия
сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на продукты ПОЛ в крови крыс при длительном тепловом воздействии 125
2.2.16. Влияние ремаксола на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при тепловом воздействии .129
2.2.17. Влияние цитофлавина на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при тепловом воздействии .133
2.2.18. Влияние арабиногалактана на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при тепловом воздействии 137
2.2.19. Сравнительная оценка антиоксидантного действия сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на основные компоненты АОС в крови крыс при длительном тепловом воздействии 141
2.2.20. Защитные свойства ремаксола, цитофлавина и арабиногалактана при воздействии на экспериментальных животных ультрафиолетового облучения .148
2.2.21. Исследование влияния ремаксола на содержание продуктов ПОЛ в крови крыс при ультрафиолетовом облучении .148
2.2.22. Исследование влияния цитофлавина на содержание продуктов ПОЛ в крови крыс при ультрафиолетовом облучении .151
2.2.23. Исследование влияния арабиногалактана на содержание продуктов ПОЛ в крови крыс при ультрафиолетовом облучении 154 2.2.24.Сравнительная оценка антиоксидантного действия
сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на продукты ПОЛ в крови крыс при ультрафиолетовом облучении 157
2.2.25. Влияние ремаксола на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при ультрафиолетовом облучении .161
2.2.26. Влияние цитофлавина на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при ультрафиолетовом облучении .164
2.2.27. Влияние арабиногалактана на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при ультрафиолетовом облучении .168
2.2.28. Сравнительная оценка антиоксидантного действия сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на основные компоненты АОС в крови крыс при ультрафиолетовом облучении .172
2.3. Морфологические исследования 178
2.3.1. Морфофункциональная характеристика органов дыхания интактных крыс 178
2.3.2. Морфофункциональная характеристика органов дыхания при окислительном стрессе 187
2.3.3. Морфофункциональная характеристика органов дыхания при окислительном стрессе на фоне введения арабиногалактана и сукцинатсодержащих препаратов .200
2.3.4. Морфофункциональная характеристика миокарда интактных крыс 210
2.3.5. Морфофункциональная характеристика миокарда крыс при окислительном стрессе 216
2.3.6. Морфофункциональная характеристика миокарда крыс при окислительном стрессе на фоне введения арабиногалактана и сукцинатсодержащих препаратов 227
ГЛАВА 3 Обсуждение результатов исследования 235
4 Материалы по внедрению результатов исследования 270
5 Выводы 271
6 Список литературы
- Физиологические механизмы реакции теплокровного организма на холодовое воздействие
- Защитные свойства ремаксола и цитофлавина при воздействии на экспериментальных животных низких температур
- Сравнительная оценка антиоксидантного действия сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на основные компоненты АОС в крови крыс при длительном холодовом стрессе
- Сравнительная оценка антиоксидантного действия сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на основные компоненты АОС в крови крыс при ультрафиолетовом облучении
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Темпы биологической эволюции существенно отличаются от темпов антропогенного прогресса, и естественные антиоксидантные системы часто не в состоянии сдерживать усиленную продукцию кислородных радикалов, индуцированную загрязнением окружающей среды техногенными соединениями, психологическими и физическими перегрузками, несбалансированным питанием. За последние десятилетия прооксидантное воздействие окружающей среды настолько возросло, что организм не успевает адаптироваться к новым условиям (Беньковская Г.В., 2010).
Изменения климатических условий постоянно оказывают воздействие на человека. В настоящее время одними из наиболее распространенных стрессовых факторов являются холод, перегревание и УФО. Любое изменение в окружающей среде, а именно высокие и низкие температуры, а также УФО воспринимаются организмом как стресс. Длительный и чрезмерный по интенсивности стресс рассматривается как универсальный механизм повреждения биологических мембран, что вызывает патологические изменения в клетках и органах организма и приводит к развитию заболеваний (Ржешевский А.В., 2013).
Выбор экспериментально – терапевтической модели в виде патологического воздействия холода, теплового воздействия и УФО на организм для исследования антиоксидантных свойств лекарственных препаратов на основе янтарной кислоты в сравнении с природными антиоксидантами считается оправданным и актуальным ввиду следующих обстоятельств. Интенсивное освоение природных ресурсов Крайнего Севера, которое в ближайшей перспективе будет только увеличиваться, неизбежная миграция населения в районы высоких широт с низкими температурами окружающей среды, агрессивное воздействие холода, прежде всего на респираторную систему, увеличение случаев бронхо-легочной патологии, регистрируемое в северных территориях, требует разработки, в том числе и фармакологических, методов профилактики (Акимов Т.А., Соколов Ю.И., 2010).
Воздействие холода на организм теплокровных, несомненно, является фактором прооксидантной направленности действия, и, как это было уже показано в многочисленных исследованиях, приводит к активации процессов перекисного окисления липидов, истощению антиоксидантной системы и развитию в последующем деструкции клеточных мембран, угнетению активности ряда ферментативных систем, а, следовательно, приводящее к
снижению резистентности организма и развитию патологии (Доровских В.А., Бородин Е.А., Целуйко С.С., 2001).
На протяжении последних десятилетий не ослабевает интерес исследователей к проблеме перегревания организма человека. Однако проблема коррекции высокого температурного фактора окружающей среды не решена до настоящего времени (Агеев Ф.Т., Свирида О.Н., Смирнова М.Д., 2013). Высокая внешняя температура является экстремальным фактором воздействия на организм. Человек подвергается перегреванию либо при незащищенности от высокой температуры в естественных условиях, либо в обстановке специфического производства. Пребывание в условиях высокой внешней температуры, сопровождающееся повышением температуры тела, приводит к снижению потребления тканями кислорода, уменьшению активности некоторых окислительно-восстановительных ферментов и способствует развитию вторичной гипоксии в метаболически активных органах (Оковитый С.В., Суханов Д.С., Заплутанов В.А., 2012). Следствием гипоксии может стать повреждение мембранного аппарата клеток внутренних органов и развитие ферментемии (Сазонтова Т.Г., Глазачев О.С., Болотова А.В., 2012).
В настоящее время исследование эффектов воздействия ультрафиолетового излучения для здоровья человека и окружающей среды является своевременным ввиду последствий возросших уровней УФ облученности на поверхности земли из-за истощения озона в стратосфере, существенное уменьшение которого в последние 10 лет произошло в глобальном масштабе. С точки зрения науки несомненно, что при постоянстве всех других факторов уменьшение общего содержания озона приведет к увеличению УФ-В излучения на уровне земной поверхности. Разрушение озона происходит, в частности, при участии выбрасываемых в атмосферу антропогенных фторуглеродистых соединений, при загрязнении атмосферы формальдегидом, диоксидами серы, азота и др. (Ольшанская Л.Н., Собгайда Н.А., Валиев Р.Ш., 2014).
УФ лучи подвергают модификации клеточные мембраны, изменяя проницаемость мембран и мембранных транспортных систем, что имеет довольно существенные последствия для теплокровного организма (Симонова Н.В., Доровских В.А., Штарберг М.А., 2007; Young A.R., Potten C.S. et al., 1991).
Постоянно сталкиваясь с проблемой защиты организма от воздействия неблагоприятных температурных факторов окружающей среды, практическая медицина разрабатывает новые методы профилактики, предупреждающие действие неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека. Для решения данной проблемы широкое поле деятельности открывается при
применении фармакологически активных препаратов с выраженными антиоксидантными свойствами, расширяющих пределы адаптации организма к экстремальным воздействиям окружающей среды (Смирнова М.Д., Коновалова Г.Г., Тихазе А.К., 2013).
Актуальность поисковых исследований обусловлена необходимостью пополнения арсенала лекарственных средств более эффективными и менее токсичными препаратами, предназначенными для лечения и профилактики социально-значимых заболеваний (Деннер В.А., Епрынцева Е.С., 2014).
На современном фармакологическом рынке существует весьма ограниченное число препаратов, способных восстанавливать баланс про- и антиоксидантных систем организма (Абидуева Л.Р., Чукаев С.А., 2013).
Разработка новых препаратов с различными механизмами антиоксидантного действия, патогенетическая целесообразность и клиническая эффективность их применения, дифференцированный подход к выбору препарата, а также оптимальный режим дозировок – эти вопросы настоятельно требуют детального и тщательного теоретического обоснования.
В связи с этим, особый интерес представляет исследование препаратов на основе янтарной кислоты, обладающих широким спектром действий, способных предупреждать избыточную активацию процессов свободнорадикального окисления и восстанавливать антиоксидантную активность организма, влиять на метаболизм клеточного дыхания и восстанавливать энергетический потенциал клетки, а также влиять на синтез белков (Доровских В.А., Дудин И.И., Браш Н.Г., 2007; Евглевский А.А., Рыжкова Г.Ф, Евглевская Е.П., 2013).
Кроме того, в практической медицине особое значение для коррекции температурных воздействий и УФО на организм приобрела широко изученная группа природных антиоксидантов, в частности полисахарид лиственницы сибирской - арабиногалактан. Не многочисленный опыт применения арабиногалактана показал, что данное природное соединение обладает способностью значительно повышать устойчивость организма к неблагоприятным факторам окружающей среды (Медведева Е.Н., Бабкин В.А., Остроухова Л.А., 2003; Feirtag J., Robinson R.R., Slavin J.L., 2001).
Цель исследования
Изучение эффективности применения сукцинатсодержащих препаратов в разных дозах для коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран в условиях холодового стресса, теплового воздействия и ультрафиолетового облучения и сравнительный анализ их антиокислительной активности с природным полисахаридом в условиях эксперимента.
Задачи исследования
-
Изучить уровень реакций перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы организма в условиях низких и высоких температур, а также воздействия ультрафиолетового облучения на фоне применения сукцинатсодержащих препаратов и природного полисахарида в разных дозах in vivo;
-
Выявить наиболее оптимальную дозу сукцинатсодержащих препаратов и природного полисахарида, способную предотвратить прооксидантное действие низких и высоких температур, ультрафиолетового облучения в условиях in vivo в различные сроки эксперимента;
-
Провести сравнительный анализ антиокислительного эффекта сукцинатсодержащих препаратов с аналогичным у природного полисахарида в экспериментах in vivo в условиях холодового стресса, теплового воздействия и ультрафиолетового облучения;
-
Изучить морфофункциональные параметры органов дыхания и ткани сердца при охлаждении, тепловом стрессе и воздействии ультрафиолетового облучения в различные сроки на фоне введения сукцинатсодержащих препаратов и природного полисахарида в разных дозах;
-
Обосновать целесообразность применения сукцинатсодержащих препаратов для повышения адаптационных реакций организма к стресс-факторам окружающей среды и провести сравнительный анализ с действием в этих условиях природного полисахарида;
-
Разработать рекомендации по профилактическому использованию исследуемых сукцинатсодержащих препаратов и природного полисахарида для повышения адаптационных возможностей организма к воздействию стресс-факторов окружающей среды.
Научная новизна работы
Впервые изучены антиоксидантные свойства сукцинатсодержащих препаратов и природного полисахарида при холодовом стрессе, тепловом воздействии и ультрафиолетовом облучении.
Впервые проведено биохимическое исследование крови лабораторных животных при действии холода, теплового стресса и ультрафиолетового облучения на фоне применения сукцинатсодержащих препаратов и природного полисахарида.
Впервые изучено влияние сукцинатсодержащих препаратов и природного полисахарида на теплокровный организм в условиях длительного холодового стресса, теплового воздействия и ультрафиолетового облучения, на сроки адаптации к стрессирующим факторам, мембраномодулирующее действие, защитное действие на мукоциллюлярную систему воздухоносного отдела
легких в условиях воздействия низких температур.
Впервые проведен сравнительный анализ антиокислительного эффекта сукцинатсодержащих препаратов с антиокислительным эффектом природного полисахарида при воздействии на организм холодового стресса, теплового воздействия и ультрафиолетового облучения, и при этом оценено и зафиксировано состояние антиокислительной системы организма и процессов перекисного окисления липидов in vivo.
Впервые проведено изучение органов дыхания и ткани сердца на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях при воздействии на организм низких и высоких температур, а также ультрафиолетового облучения на фоне введения сукцинатсодержащих препаратов и природного полисахарида в разных дозах.
Получены данные о значительном влиянии сукцинатсодержащих препаратов на характер адаптационных процессов, развивающихся в организме при воздействии высоких, низких температур и УФО.
Теоретическая и практическая значимость работы
Получены новые факты о лечебной ценности, а, следовательно, о дополнительных направлениях применения сукцинатсодержащих препаратов (ремаксол, цитофлавин) и арабиногалактана в практической медицине, в частности, для повышения антиоксидантного потенциала организма в условиях хронического холодового и теплового стресса, а также УФО.
На основании проведенного биохимического, морфологического и морфометрического исследования выявлены значительные изменения воздухоносного отдела лёгких (трахея) и органов сердечно-сосудистой системы (миокард) у животных, подвергнутых длительному воздействию низких, высоких температур и УФО на организм в эксперименте. Показана выраженная антиоксидантная эффективность ремаксола и цитофлавина по воздействию на процессы ПОЛ и компонентов АОС по сравнению с арабиногалактаном, а также защитное действие на состояние структур, обеспечивающих мукоциллиарный транспорт в слизистой оболочке трахеи и морфологические параметры миокарда лабораторных животных в условиях холодового, теплового воздействия и УФО. Это даёт возможность рекомендовать данные препараты как средство, повышающее антиоксидантный статус организма в условиях окислительного стресса.
Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на кафедрах фармакологии и гистологии с биологией при подготовке специалистов в системе высшего профессионального медицинского образования и постдипломного образования ГБОУ ВПО Амурская ГМА Минздрава России.
Получены патенты России на изобретение.
Выполненная работа является одним из этапов разрешения и внедрения в практическое здравоохранение новых антиоксидантов.
Апробация результатов
Основные результаты работы были представлены на научных конференциях и симпозиумах международного, российского и регионального, уровня: научно-практической VI Международной российско-китайской конференции (Россия, Благовещенск, 2009); The 2th China, Japan and Korea international conference for TCM and The 7th Sino-Russia Biomedical Forum (Китай, Харбин, 2010); The 9th Sino-Russia Biomedical Forum (Китай, Харбин, 2012); ХIV региональной научно-практической конференции с межрегиональным и международным участием «Молодёжь ХХI века: шаг в будущее (Благовещенск, 2012); научно-практической Х Международной российско-китайской конференции (Россия, Благовещенск, 2013); ХV региональной научно-практической конференции с межрегиональным и международным участием «Молодёжь ХХI века: шаг в будущее» (Благовещенск, 2013); «Бюллетень физиологии и патологии дыхания» Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН (Благовещенск, 2013); ХII Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием по клинической фармакологии «Клиническая фармакология и фармакотерапия заболеваний в свете доказательной медицины» (Винница, 2013); The 11th Sino-Russia Biomedical Forum (Китай, Харбин, 2014); расширенном заседании кафедр фармакологии, химии, гистологии с биологией, физиологии и патофизиологии, проблемной комиссии ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия Минздрава России (Благовещенск, 2015); The 13th Sino-Russia Biomedical Forum (Китай, Харбин, 2016)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 39 научных работ, в том числе 16 статей в журналах, рекомендованных перечнем ВАК, 3 монографии, 4 патента России на изобретение № 2533446, 20.11.2014, Бюл. № 32.; № 2014112643, 10.05.2015, Бюл. № 13.; № 2014100827, 20.08.2015, Бюл. № 23.; № 2013159310, 10.06.2015, Бюл. № 16.
Объем и структура диссертации
Физиологические механизмы реакции теплокровного организма на холодовое воздействие
Интерес к активным формам кислорода и реакциям с их участием, к антиоксидантам, блокирующим эти реакции, в последнее время быстро растет, поскольку с АФК связывают развитие у человека широкого спектра хронических заболеваний [163, 274, 320]. Но в рамках традиционных представлений биохимии не находит убедительного объяснения необходимость регулярного потребления АФК с воздухом (супероксидный радикал), водой (перекись водорода), пищей (продукты реакции Мейяра) для повышения адаптивных возможностей организма, устойчивости к стрессу, сохранения высокой жизненной активности. Остаются неясными причины высокой терапевтической эффективности таких сильных оксидантов, как озон и перекись водорода при почти полном отсутствии побочных эффектов. При этом почти не обращается внимания на уникальную особенность реакций с участием АФК – их чрезвычайно высокий энергетический выход [221, 398]. Можно предположить, что абсолютная необходимость АФК для жизнедеятельности и их благотворное терапевтическое действие могут объясняться образованием при их реакциях электронно-возбужденных состояний – триггеров всех последующих биоэнергетических процессов. [217, 218, 321, 399]. Колебательный режим таких реакций может обусловливать ритмичное протекание биохимических процессов более высокого уровня. Патогенетические эффекты АФК могут тогда объясняться нарушением регуляции как процессов их генерации, так и устранения.
Динамика роста научной литературы, посвященной активным формам кислорода, свободным радикалам, окислительным процессам их участием, говорит о стремительно растущем к ним интересе биологов и медиков. В большинстве публикаций по проблемам, связанным с активными формами кислорода, подчеркивается их деструктивное действие на мембраны, нуклеиновые кислоты и белки [361, 364, 400]. Поскольку в исследованиях роли, которую могут играть АФК в биохимии и физиологии, преобладает токсикологический и патофизиологический уклон, число публикаций, посвященных антиоксидантам, растет даже быстрее, чем общее число статей по АФК. Если за 25 лет до 1990 года число отреферированных в Medline статей по антиоксидантам было менее 4500, то лишь за 1999 и 2000 оно превысило 6000. Активные формы кислорода, столь опасные с позиции свободно радикальной теории старения, организм вырабатывает целенаправленно[41, 322]. Они обладают биологическим эффектом, который в зависимости от концентрации АФК может быть регуляторным или токсическим [40,41, 355]. В организме человека они образуются в процессе митохондриального дыхания и клеточного метаболизма. Все клетки обладают специализированными системами для генерации АФК. Например, фермент NADPH-оксидазу активно продуцирующий супероксид, вслед за которым возникает вся гамма АФК, до недавнего времени считали сугубо специфическим «инструментом» фагоцитирующих клеток иммунной системы, объясняя необходимость продукции АФК критическими обстоятельствами защиты от патогенных микроорганизмов и вирусов [18, 324]. Но сегодня ясно, что это фермент вездесущ. Он и подобные ему ферменты найдены в клетках аорты, в фибробластах, в нейронах коры мозга и др. Существует тонкая грань между токсическим действием радикалов и их физиологической ролью [402]. В малых количествах, считающихся физиологичными, свободные радикалы принимают активное участие в адаптации (вторичные мессенджеры сигналов, индукция стрессорных белков, индукция ферментов, антимикробный, противовирусный, противоопухолевой эффекты, синтез и распад цитокинов, рост, деление и дифференцировка клеток, клеточное старение и смерть, разрушение мртвых клеток и поврежденных молекул, межклеточного вещества, регуляция репаративных процессов, продукция коллагена и др.) [28, 33, 35, 325, 326].
При том, что значительная часть потребляемого организмом кислорода идет на производство АФК, текущие уровни свободных радикалов в клетках и межклеточной среде очень низки. Многочисленные как ферментативные, так и неферментативные механизмы, в совокупности именуемые «антиоксидантная защита», быстро устраняют появляющиеся АФК, а антиоксиданты обеспечивают высокую скорость рекомбинаций радикалов и их превращений в устойчивые молекулы [1, 41, 63].
Однако, АФК могут представлять серьезную опасность в случае нарушений, как в их производстве, так и утилизации. Рост содержания АФК в этом случае, ведет к развитию цепных реакций и повреждению биомолекул, к возникновению тех патологий, которые хорошо описаны в литературе как последствия «окислительных стрессов» [68, 72, 78, 239].
Однако, существует три категории АФК: первичные, вторичные и третичные. Первичные АФК (оксид азота NO, супероксид анион-радикал) обладают регуляторным или умеренным антимикробным действием [89, 94, 362]. В дальнейшем эти радикалы могут превращаться в перекись водорода, гипохлорит, гидроксильный радикал, липоксильный радикал, пероксинитрит, которые в совокупности представляют категорию вторичных радикалов [360]. При соединении вторичных радикалов с молекулами антиоксидантов и других, легко окисляющихся соединений образуются, третичные радикалы [111, 112].
Защитные свойства ремаксола и цитофлавина при воздействии на экспериментальных животных низких температур
Характеристика экспериментального материала: экспериментальная часть выполнена на беспородных белых крысах (Rattus norvegicus) отряда Rodencia, которые являются наиболее распространнными лабораторными животными и удобной моделью для изучения влияния стрессирующих факторов (холод, перегревание и УФО) на организм. Возраст животных самцов, включнных в исследование, составил 3-4 месяца, масса 150-200 граммов. Отбор по весо-возрастным данным был обусловлен лучшей выживаемостью этих животных в условиях экспериментальных моделей опыта. Пол животных был выбран во избежание влияния эстрального цикла на результаты эксперимента и, в частности, для исключения влияния эстрогенов на показатели перекисного окисления липидов и антиокислительной системы. Животных содержали в стандартных условиях в виварии Амурской государственной медицинской академии, при естественном световом режиме без ограничения доступа к воде и пище. Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18.03.1986г.), приказе Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».
При завершении научных исследований выведение животных из опыта проводили с соблюдением требований гуманности согласно приложению № 4 к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977) о «Порядке проведения эвтаназии (умерщвления животного)» путем декапитации. Исследование одобрено Этическим комитетом Амурской государственной медицинской академии выписка из протокола от 12 ноября 2014г.
Характеристика исследуемого вещества В работе использовали «Ремаксол» (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН», Санкт-Петербург) сбалансированный раствор для инфузий, обладающий гепатопротекторным действием, в состав которого входят активные компоненты: янтарной кислоты - 5,280 г; N-метилглюкамина (меглумина) -8,725 г; рибоксина (инозина) - 2,0 г; метионина - 0,75 г; никотинамида - 0,25 г. Вспомогательные вещества: натрия хлорида - 6,0 г; калия хлорида - 0,30 г; магния хлорида (в пересчете на безводный) – 0,12 г; натрия гидроксида – 1,788 г; воды для инъекций до 1,0л.
При в/в капельном введении входящие в состав естественные компоненты быстро распределяются в тканях организма, утилизируясь практически мгновенно. Продукты метаболизма выводятся с мочой и не накапливаются в организме.
Метаболическое средство - «Цитофлавин» (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН», Санкт-Петербург). Состав: 1 л раствора содержит активные компоненты: янтарную кислоту 100 г, никотинамид 10 г, рибоксин (инозин) 20 г, рибофлавина мононуклеотид (рибофлавин) 2 г; вспомогательные вещества: N-метилглюкамин (меглумин) 165 г, натрия гидроксид 34 г, вода для инъекций.
При внутривенной инфузии со скоростью около 2 мл/мин (в пересчте на неразбавленный цитофлавин) янтарная кислота и инозин утилизируются практически мгновенно и в плазме крови не определяются. Янтарная кислота - пик концентрации определяется в течение первой минуты после введения, с дальнейшим быстрым снижением без кумуляции и возвращением е уровня к фоновым значениям вследствие метаболизации до воды и углекислого газа. Инозин метаболизируется в печени с образованием инозинмонофосфата с последующим его окислением до мочевой кислоты. В незначительном количестве выводится почками.
Никотинамид быстро распределяется во всех тканях, проникает через плаценту и в грудное молоко, метаболизируется в печени с образованием N-метилникотинамида, выводится почками. Период полувыведения из плазмы составляет около 1,3 часов, равновесный объм распределения – около 60 литров, общий клиренс – около 0,6 л/мин. Рибофлавин распределяется неравномерно: наибольшее количество в миокарде, печени, почках. Период полувыведения из плазмы составляет около 2 часов, равновесный объм распределения – около 40 литров, общий клиренс – около 0,3 л/мин. Проникает через плаценту и в грудное молоко. Связь с белками плазмы – 60%. Выводится почками, частично в форме метаболита; в высоких дозах – преимущественно в неизменнном виде.
В соответствии с распоряжением правительства РФ № 2343 от 29.12.2005 препарат Цитофлавин раствор для внутривенного введения включен в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств.
Арабиногалактан один из новых антиоксидантов растительного происхождения. Он был выбран с целью сравнения защитного действия от холода, перегревания и ультрафиолетового облучения сукцинатсодержащих препаратов (ремаксол и цитофлавин) и природного антиоксиданта (арабиногалактана). Арабиногалактан «Лавитол» (природный полисахарид из древесины лиственницы даурской) производства ЗАО «Аметис» Амурской области г. Благовещенска. Древесину лиственницы измельчали, доводили до порошкообразного состояния. Партия № 530 соответствует ТУ 9325-001 70692152-07 и СанПин 2.3.2.1078-01 на основании протокола микробиологических исследований № 5053, физики – химических измерений № 599 и протокола радиологических исследований № 551р – 07/684. Первоначально проводился анализ данных литературы по арабиногалактану, что позволило спрогнозировать возможность использования данного вещества для облегчения адаптации теплокровного организма к воздействию низких и высоких температур, а также УФО. Арабиногалактан относится к группе гидрокарбонатных соединений. Состоит из цепочных соединений галактозы и арабинозы. Содержится в ряде фруктов, моркови, редисе, пшеницы, зернах кофе, эхинацее. Однако уникальным источником арабиногалактана является лиственница. Именно она дает возможность получить арабиногалактан с наиболее полезными свойствами.
Сравнительная оценка антиоксидантного действия сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на основные компоненты АОС в крови крыс при длительном холодовом стрессе
Животным, которым вводили ремаксол в дозе 100 мг/кг и 50 мг/кг, содержание церулоплазмина повышается, и даже несколько выше, чем у животных интактной группы на 21 день эксперимента при введении ремаксола в дозе 100 мг/кг. При введении ремаксола в дозе 100 мг/кг и 50 мг/кг к концу первой недели эксперимента отмечается увеличение содержания церулоплазмина, но данные не достоверны по отношению к контрольной группе, на 14 день эксперимента ремаксол в дозе 50 и 100 мг/кг значительно восстанавливает содержание церулоплазмина на 50-45% соответственно, и это сопоставимо с уровнем церулоплазмина в крови экспериментальных животных интактной группы. Введение ремаксола в дозе 50 мг/кг также восстанавливает содержание церулоплазмина в крови экспериментальных животных (на 30%) к 21 дню эксперимента, и, не достигая эффекта полученного при применении ремаксола в дозе 100 мг/кг, но сопоставимым с уровнем интактной группы.
Таким образом, мы можем говорить о полном восстановлении исходного содержания церулоплазмина. Однако окончательно остается невыясненной зависимость увеличения церулоплазмина в плазме крови от вводимой дозы ремаксола. Витамин Е По сравнению с интактными животными, в результате стрессового воздействия на крыс низких температур наблюдается снижение содержания витамина Е в контрольных группах: (на 24%) на 7 день эксперимента, (на 29%) на 14 день эксперимента, (на 18%) к 21 дню эксперимента.
Ремаксол в дозе 100 мг/кг предотвращает уменьшение содержания витамина Е в крови во все сроки эксперимента. Но на фоне введения ремаксола в дозе 100 мг/кг отмечается значительное достоверное увеличение витамина Е во все дни эксперимента на 20-31% по отношению к контрольной группе, а в конце третьей недели содержание токоферола сопоставимо с исходным уровнем на 17%. По выраженности эффекта ремаксол в дозе 50 мг/кг слабее влиял на уровень данного показателя (на 7-9%) на 7 и 21 день эксперимента соответственно, причем данные различия показателя по отношению к контрольным группам были не достоверны, и, только на 14 день эксперимента мы отмечаем достоверное увеличение содержания витамина Е на 20 %, не достигая при этом уровня витамина Е в интактной группе (таб.16.).
Таким образом, имеется четкая, прямая зависимость содержания витамина Е в экспериментальных группах от дозы полученного препарата, а в группах получавших ремаксол в дозе 100 мг/кг достигнут эффект, позволяющий предполагать стимулирующее действие данной дозы препарата на усиленную продукцию эндогенного витамина Е, что может служить важным фактором при профилактике холодового стресса. В отличие от групп экспериментальных животных, получавших ремаксол в дозе 500 мг/кг (не наблюдается увеличение содержания витамина Е в крови до исходных величин).
Таблица 16 Содержание витамина Е (мкг/мл) в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения ремаксола ГруппаСроки эксперимента Группа 1 Интактная Группа 2Холод(контроль) Группа 3ремаксол вдозе 50 мг/кг+холод Группа 4ремаксол в дозе100 мг/кг+холод 7 день 48,7 ± 3,6 37,3 ± 1,5 40,2 ± 0,8 44,8 ± 1,7 14 день 47,5 ± 2,2 34,0 ± 1,6 40,9 ± 1,5 44,7 ± 1,5 21 день 45,8 ± 2,0 38,0 ± 1,8 41,5 ± 1,3 44,8 ± 1,4 Примечания: и - различия, достоверные по отношению к интактной и контрольной группами животных при р 0,05. В целом, исследование содержания в крови продуктов ПОЛ, содержания и активности компонентов АОС при действии холода и влияния на эти показатели ремаксола в дозе 50 и 100 мг/кг позволяет констатировать антиоксидантный эффект, который сильнее выражен у ремаксола в дозе 100 мг/кг. . Влияние цитофлавина на активность некоторых компонентов АОС организма экспериментальных животных при холодовом воздействии Глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа Холодовое воздействие вызывает (на 19-17%) снижение активности Гл 6-ФДГ в крови лабораторных животных по сравнению с интактной группой. На фоне введения цитофлавина в дозе 100 мг/кг частичное восстановление активности фермента наблюдается во все дни эксперимента (на 6-7%). Цитофлавин в дозе 50 мг/кг приводит к значительно менее выраженному эффекту, частично восстанавливая активность Гл-6-ФДГ к 7 дню эксперимента до 7%, более того к концу второй недели уровень активности Гл-6-ФДГ даже ниже уровня показателя контрольной группы на 4 %, а к 21 дню эксперимента активность Гл-6-ФДГ при введении цитофлавина в дозе 50 мг/кг держится на уровне контрольной группы (таб.17.).
Сравнительная оценка антиоксидантного действия сукцинатсодержащих препаратов и арабиногалактана в разных дозах на основные компоненты АОС в крови крыс при ультрафиолетовом облучении
Ультрафиолетовое облучение теплокровного организма приводит к активации процессов перекисного окисления липидов биомембран, что является одним из ключевых моментов в возникновении ряда предпатологических состояний и заболеваний [227, 230]. Мы исследовали возможность коррекции свободнорадикального окисления липидов мембран в условиях ультрафиолетового облучения введением сукцинатсодержащих препаратов - ремаксола, цитофлавина, и природного антиоксиданта арабиногалактана. Содержание продуктов ПОЛ (ДК, ГП и МДА) определяли в сыворотке крови, подвергнутых ультрафиолетовому облучению (контрольная группа животных), у интактных животных (крыс), а так же у крыс, которым перед стрессирующим воздействием (УФО) ежедневно вводили изучаемые препараты – ремаксол, цитофлавин и арабиногалактан, выбранный в качестве препарата сравнения. Содержание продуктов ПОЛ определяли на протяжении месяца после первой, второй и третьей недели эксперимента. крови крыс при ультрафиолетовом облучении Диеновые конъюгаты Действие УФО сопровождается достоверным увеличением содержания ДК в крови на 49-53% на всем протяжении эксперимента по отношению к интактным животным. При внутрибрюшинном введении ремаксола в дозе 100 мг/кг действие УФО не приводит к накоплению ДК в крови, причем наибольший антиоксидантный эффект, рассчитываемый как снижение содержания ДК в крови животных экспериментальной группы по отношению к таковому в контрольной группе, отмечается в конце второй и третьей недель (17-23%). В конце первой недели антиоксидантный эффект ремаксола в дозе 100 мг/кг составил 9%.
Введение ремаксола в дозе 50 мг/кг также оказывает антиоксидантный эффект, но выраженность эффекта меньше, чем у ремаксола 100мг/кг по окончанию третьей недели эксперимента - 19%, на 14 день эксперимента эффект снижения ДК в крови экспериментальных животных сопоставим с эффектом полученным при введении ремаксола в дозе 100 мг/кг, на 7 день эксперимента уровень исследуемого показателя составил - 15% (табл.46).
Таким образом, ремаксол в выбранных нами дозах предупреждает накопление в крови ДК на протяжении действия на организм животных УФО. Несколько сильнее антиоксидантный эффект выражен у ремаксола в дозе 100 мг/кг. Отмечается зависимость эффекта препарата от продолжительности эксперимента. Гидроперекиси липидов По отношению к интактным животным содержание ГП в крови достоверно увеличено на всем протяжении эксперимента на 48-46%. В экспериментальной группе лабораторных животных, получавших ремаксол в дозе 100 мг/кг, содержание ГП в крови достоверно ниже, чем в контрольной группе, начиная с 7 дня - на 16%, 14 день - на 24% и к 21 дню эксперимента на 22%. При введении ремаксола в дозе 50 мг/кг по отношению к контрольной группе достоверный антиоксидантный эффект значительно менее выражен к окончанию первой недели (на 12%), второй недели (на 14%) и к концу третьей недели (на 13%), что уступает по силе антиоксидантного эффекта, полученного при введении ремаксола в дозе 100 мг/кг. (табл.47).
ГруппаСроки эксперимента Группа 1 Интактная Группа 2УФО(контроль) Группа 3ремаксол в дозе50 мг/кг+ УФО Группа 4ремаксол в дозе100 мг/кг+ УФО 7 день 23,8 ± 2,0 35,3 ± 0,8 31,2 ± 1,1 29,8 ± 0,9 14 день 24,0 ± 2,1 35,2 ± 1,0 30,6 ± 0,9 27,0 ± 1,6 21 день 26,3 ± 2,4 33,2 ± 1,4 28,9 ± 0,9 26,1 ± 2,0 Примечания: и - различия, достоверные по отношению к интактной и контрольной группами животных при Р 0,05. Таким образом, сравнивая антиоксидантные эффекты ремаксола в дозе 50 мг/кг и ремаксола в дозе 100 мг/кг по их влиянию на содержание в крови ГП при УФО на организм экспериментальных животных, мы видим, что ремаксол в дозе 50 мг/кг уступает ремаксолу в дозе 100 мг/кг.
При УФО на лабораторных животных в течение всей продолжительности эксперимента наблюдается достоверное увеличение содержания в крови МДА на 62-48%.
При введении как ремаксола в дозе 50 мг/кг, так и ремаксола в дозе 100 мг/кг на фоне действия УФО содержание в крови МДА достоверно ниже, чем у контрольных животных. Антиоксидантный эффект выражен значительно в большей степени у ремаксола в дозе 100 мг/кг на 7 и 21 день эксперимента, на 31% и 33% соответственно по отношению к контрольным группам. В группе, получавшей ремаксола в дозе 50 мг/кг, к концу первой и третьей недели эксперимента отмечено менее выраженное снижение МДА в крови животных на 24% и 17% соответственно. На 14 день эксперимента уровень содержания ДК в крови экспериментальных животных получавших ремаксол в дозе 50 мг/кг практически сопоставим с уровнем данного показателя в крови животных, которым вводили ремаксол в дозе 100 мг/кг (табл.48).
ГруппаСроки эксперимента Группа 1 Интактная Группа 2УФО(контроль) Группа 3ремаксол в дозе50 мг/кг+ УФО Группа 4ремаксол в дозе100 мг/кг+ УФО 7 день 4,0 ± 0,3 6,5 ± 0,3 5,0 ± 0,3 4,5 ± 0,1 14 день 3,9 ± 0,3 5,8 ± 0,3 4,4 ± 0,3 4,3 ± 0,2 21 день 4,2 ± 0,3 5,9 ± 0,6 4,9 ± 0,3 4,0 ± 0,3 Примечания: и - различия, достоверные по отношению к интактной и контрольной группами животных при Р 0,05. Таким образом, сравнивая антиоксидантный эффект ремаксола в разных дозах по его влиянию на содержание в крови МДА при УФО воздействии на организм экспериментальных животных, мы видим, что ремаксол в дозе 50 мг/кг уступает ремаксолу в дозе 100мг/кг. 2.2.22. Исследование влияния цитофлавина на содержание продуктов ПОЛ в крови крыс при ультрафиолетовом облучении Диеновые конъюгаты
Действие УФО сопровождается достоверным увеличением содержания ДК в крови на 49%-53% на всем протяжении эксперимента по отношению к интактным животным. При внутрибрюшинном введении цитофлавина в дозе 50 и 100 мг/кг действие УФО не приводит к накоплению ДК в крови экспериментальных животных, причем цитофлавин в указанных дозах в равной степени приводит к снижению исследуемого показателя на 7 и 14 день эксперимента на 16% и 20% соответственно, наибольший антиоксидантный эффект, рассчитываемый как снижение содержания ДК в крови животных экспериментальной группы по отношению к таковому в контрольной группе, отмечается в конце третьей недели эксперимента при введении цитофлавина в дозе 100 мг/кг, что значительно превосходит антиоксидантный эффект (снижения ДК), произведенный введением цитофлавина в дозе 50 мг/кг (таб. 49.).