Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Сведения литературы о патогенетических механизмах развития неврастенических состояний, АН-ксиолитических средствах и пионе уклоняющемся
1.1. Современные представления о патогенетических механизмах развития неврастенических состояний
1.2. Средства, применяемые в терапии неврозов
1.3. Сведения литературы о пионе уклоняющемся
Глава 2. Материалы и методы исследования
Глава 3. Исследование фармакологических свойств «пианэкса»
3.1. Определение острой токсичности «Пианэкса»
3.2. Изучение антистрессорной активности при иммобилизационном стрессе
3.3. Изучение антистрессорной активности при эмоциональном стрессе
3.4. Изучение антигипоксической активности
3.4.1. Влияние на устойчивость к гипобарической гипоксии
3.4.2. Влияние на устойчивость к гемической гипоксии
3.4.3. Влияние на устойчивость к гиперкапнической гипоксии
3.4.4. Влияние на устойчивость к тканевой гипоксии
3.5. Изучение противовоспалительнй активности «Пианэкса»
3.5.1. Влияние на фазу экссудации процесса воспаления
3.5.2. Влияние на процессы альтерации и регенерации
3.5.3. Влияние на пролиферативные процессы
3.5.4. Изучение анальгезирующей активности
ГЛАВА 4. Исследование влияния «пианэкса» на функциональное состояние центральной нервной системы
4.1. Исследование психотропной активности «Пианэкса»
4.1.1. Влияние на поведенческую активность в тесте «открытое поле»
4.1.3. Влияние на поведенческую активность в конфликтной ситуации
4.2. Влияние «Пианэкса» на выработку «условного рефлекса пассивного избегания»
4.3. Исследование седативной активности «Пианэкса»
4.3.1. Влияние на снотворное действие гексенала и продолжительность гексеналового сна (потенцирующее действие)
4.3.2. Влияние на продолжительность наркотического сна, индуцированного гексеналом (пролонгирующее действие)
4.3.3. Влияние многократного введения «Пианэкса» на снотворный эффект гексенала и продолжительность сна
4.3.4. Влияние на продолжительность наркотического сна, индуцированного хлоралгидратом и седуксеном
4.4. Исследование противосудорожной активности «Пианэкса»
4.4.1. Влияние на судорожное действие коразола и стрихнина
4.4.2. Влияние на судорожное действие тиосемикарбазида
ГЛАВА 5. Исследование фармакотерапевтической эффективности «пианэкса»
5.1. Фармакотерапевтическая эффективность «Пианэкса» в условиях конфликтной ситуации 5.2. Фармакотерапевтическая эффективность «Пианэкса» при эмоциональном стрессе
5.3. Фармакотерапевтическая эффективность «Пианэкса» при иммобили-зационном стрессе
5.4. Фармакотерапевтическая эффективность «Пианэкса» при гипобари-ческой гипоксии CLASS ГЛАВА 6. К механизмам фармакологического действия «пианэкса» CLASS
6.1. Мембраностабилизирующая активность
6.2. Влияние на скорость накопления ТБК-активных продуктов
6.3. Антирадикальная активность по отношению к супероксидным радикалам
6.4. Антирадикальная активность по отношению к NO радикалам
6.5. Влияние на инактивацию Н2О2
6.6. Определение хелатирующей активности
ГЛАВА 7. Обсуждение
Заключение
Выводы практические рекомендации
Список литературы
- Средства, применяемые в терапии неврозов
- Изучение антигипоксической активности
- Влияние на поведенческую активность в конфликтной ситуации
- Фармакотерапевтическая эффективность «Пианэкса» при иммобили-зационном стрессе
Введение к работе
В последние годы наблюдается ускоренная смена условий жизни человека; увеличиваются требования к личности от общества, возрастает социальный прессинг, особенно в России, что ведет к увеличению нервно-психических заболеваний и, в первую очередь, неврозов и неврозоподобных состояний (Украинский, 2008). Распространенность невротических расстройств среди популяции развитых стран достигает 20%, и за последние 70-80 лет выросла в 24-25 раз (Граница, 2014; Подлеснова, 2015). Число лиц в России с предболезненными и сформировавшимися психическими расстройствами составляет 10 миллионов человек (Карелина, Кром, Барыльник, 2010).
Увеличиваются случаи невроза и неврозоподобных состояний у детей, в основном, в возрасте 7-14 лет, связанных с острыми или хроническими психотравмами, дисгармоничными отношениями в семье, конфликтами в учебных заведениях, требованиями родителей и т.д. (Чутко, 2009; Мамайчук, Смирнова, 2010; Малкова, 2012; Мамайчук, Вейц, 2012; Goodman et all 2005). Указанные расстройства также часто наблюдаются у женщин в период беременности и после родов (Белов, Туманова 2011; Полуэктова, 2013), инвалидов (Львова, Костерева, 2012), мужчин фертильного возраста с половыми расстройствами (Сосновский, Терешин, Морозов, 2010), комбатантов, участвовавших в локальных конфликтах (Колов, 2009; Ичитовкина, Злоказова, Рубцова, Николаев, 2011).
Тревожность является одним из наиболее распространенных психопатологических синдромов в общемедицинской практике. В целом, в популяции те или иные проявления синдрома тревоги часто встречаются среди амбулаторных пациентов в общетерапевтической и неврологической практике (Акарачкова, Шварков, 2007; Micallef, Soubrouillard, 2001). Течение многих патологических процессов, вне зависимости от этиологии и патогенеза заболевания, как правило, усугубляется (обостряется) невротическими расстройствами, которые приводят к развитию или соматоформных расстройств или формированию психосоматических заболеваний, относящихся к категории т.н. «болезней цивилизации» (сердечнососудистые патологии, иммунодефи-цитные состояния, аллергии и др.) (Белова, 2006; Краснов, 2008; Николаев, соавт. 2011; Воронина, 2014). О наличии прямой связи неврозов с соматическими заболеваниями свидетельствуют данные Института кардиологии МЗ РФ: одна треть инфарктов миокарда развивается в связи с психическими травмами или длительным перенапряжением нервной системы, а почти половина – в результате нервного напряжения в сочетании с профессиональной нагрузкой. При патологии сердечно-сосудистой системы доля пациентов с тревожными расстройствами встречается в 51% случаев (Бурчинский, Кок-шенева, 2013; Lane, Carroll, Ring, 2001). Неврозы являются наиболее распространенной патологией в психиатрии (Kessler et all., 2005), а страдающие неврозами являются частыми пользователями службы скорой помощи (Wang et all., 2005), склонны к алкоголизму, суицидальным попыткам и злоупотреблению лекарственными средствами (Вельтищев, 2013; Weissman et all., 1989;
Brady, Lydiard 1993). Неврозы, депрессивные расстройства занимают лидирующее место в снижении качества жизни (Lecrubier, 2008).
В этой связи актуальной проблемой является разработка новых эффективных и безопасных средств с анксиолитической активностью. Перспективным направлением решения этой проблемы является разработка препаратов на основе сырья природного происхождения. В последние годы во всем мире наблюдается значительное повышение интереса к растительным препаратам, связанного с наличием у них ряда преимуществ по сравнению с синтетическими средствами. Они содержат большой набор биологически активных веществ, относящихся к различным классам химических соединений, что обеспечивает проявление широкого спектра фармакологической активности; характеризуются плавным нарастанием фармакологического эффекта, низкой токсичностью и отсутствием неблагоприятных побочных реакций при их длительном приеме (Кукес и соавт., 2000; Сур, Гриценко, 2002; Прончен-ко, 2002; Куркин, 2007). Другим важным преимуществом фитотерапии является отсутствие привыкания и пристрастия, обладание комплексом фармакологических свойств, оказывающих положительное влияние на организм: им-муномодулирующим, противовирусным, антиоксидантным, антигистамин-ным и т.д. (Вайс, Финтельман, 2004; Алексеева, 2011;). В настоящее время для коррекции невротических состояний широкое применение получили се-дативные средства, представляющие собой галеновые препараты валерианы, пассифлоры, пустырника, пиона и некоторых других растений. Следует отметить, что число седативных средств весьма ограничено. Одним из подходов к расширению их арсенала является разработка новых лекарственных форм (таблеток, гранул и т.д.), содержащих сухие экстракты из растительного сырья.
В связи с вышеизложенным нами получен сухой экстракт из корневищ Пиона уклоняющегося, представляющий собой легкорастворимую в воде субстанцию, условно названную «Пианэкс». Средство содержит широкий набор биологически активных веществ (углеводы, терпеноиды, стероиды, фенолкарбоновые кислоты, фенологлюкозиды, флавоноиды, дубильные вещества, витамины, ароматические соединения, иридоиды, микроэлементы). Стандартизация экстракта проводится по сумме фенологликозидов в пересчете на салицин (не менее 16%).
Целью настоящего исследования явилось определение основных фармакологических свойств, фармакотерапевтической эффективности «Пиан-экса» при экспериментальных неврозах и оценка его механизма действия. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить специфические фармакологические свойства «Пианэкса»;
оценить влияние «Пианэкса» на функциональное состояние центральной нервной системы у интактных животных;
изучить фармакотерапевтическую эффективность указанного средства при неврозах и неврозоподобных состояниях различного генеза;
- выявить основные механизмы его стресс-протективного и анксиолитиче-
ского действия.
Научная новизна. Работа представляет собой экспериментальное исследование фармакологических свойств и фармакотерапевтической эффективности новой лекарственной формы, полученной из корневищ пиона уклоняющегося. Установлено, что «Пианэкс» в экспериментально-терапевтических дозах (50 – 150 мг/кг) обладает широким спектром фармакологических свойств: стресс-протективным, антигипоксическим, анксиоли-тическим, противовоспалительным, анальгезирующим, мембраностабилизи-рующим и антиоксидантным. При исследовании влияния «Пианэкса» на функциональное состояние ЦНС установлено, что данное средство повышает ориентировочно-исследовательскую активность, снижает уровень тревожности и эмоциональности, в том числе в условиях конфликтной ситуации, стимулирует когнитивные функции у крыс, оказывает влияние на процессы обучения и консолидации памяти у животных. Установлено, что анксиолити-ческие свойства фитоэкстракта обусловлены активацией ГАМК-ергической системы. Курсовое введение животным «Пианэкса» сопровождается выраженной фармакотерапевтической эффективностью при неврозоподобных состояниях, развивающихся в результате действия психотравмирующих факторов: конфликтная ситуация, эмоциональный и иммобилизационный стресс, о чем свидетельствует уменьшение выраженности патологических изменений во внутренних органах белых крыс, характерных для стресс-реакции. Введение крысам «Пианэкса» на фоне кислороддефицитного состояния также оказывает протективное действие, поддерживая на более высоком уровне процессы энергетического обеспечения структур головного мозга животных. Анксиолитическая и стресс-протективная активность указанного средства связаны с его способностью повышать активность ГАМК-ергической системы, являющейся основной центральной стресс-лимитирующей системой и наличием у «Пианекса» выраженной антиоксидантной активности, обеспечивающей защиту мембранных структур нейронов и клеток других тканей от деструктивного действия свободных радикалов.
Практическая значимость. Материалы экспериментальных исследований были использованы в нормативных документах, представленных в ФК Минздрава РФ с целью разрешения новой лекарственной формы, полученной из сырья Пиона уклоняющегося, к медицинскому применению. Материалы диссертационной работы используются также в учебном процессе на кафедре фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии Медицинского института ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (акт внедрения от 22.09.2015 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
- «Пианэкс» в экспериментально-терапевтических дозах обладает широким
спектром фармакологических свойств: анксиолитическим, стресс-
протективным, антигипоксическим, противовоспалительным, анальгезирую-
щим, мембраностабилизируюшим и антиоксидантным, средство потенцирует
и пролонгирует действие снотворных средств и оказывает противосудорож-ное действие, его фармакологическая активность повышается при многократном введении;
«Пианэкс» снижает уровень эмоциональности и тревожности животных в незнакомых условиях, повышает их ориентировочно-исследовательские реакции, улучшает когнитивные функции;
курсовое введение «Пианэкса» оказывает фармакотерапевтическое влияние при неврозоподобных состояниях: конфликтной ситуации, эмоциональном и иммобилизационном стрессах;
- механизмы анксиолитического и стресс-протективного действия «Пиан-
экса» связаны с его свойством стимулировать активность ГАМК-ергической
системы ЦНС, на фоне торможения процессов свободнорадикального окис
ления биомакроиолекул, повышения активности эндогенной антиоксидант-
ной системы организма и стабилизации мембранных структур клеток;
- «Пианэкс» является практически безвредным веществом;
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссер
тации доложены и обсуждены на: III международной научно-практической
конференции «Экология, здоровье, спорт» (Чита, 2011 г.); научно-
практической конференции «Аспирантские и докторантские чтения: дерза
ния нового времени – поиск инноваций» (Москва, 2011 г.); V всероссийской
конференции с международным участием «Новые достижения в химии и хи
мической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2012 г.); VI междуна
родной научной конференции «Традиционная медицина: пути интеграции с
современным здравоохранением» (Улан-Удэ, 2013 г.); международной on-line
научно-практической конференции «Новости научной мысли» (Белгород,
2014).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из которых 4 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.
Работа выполнена в соответствии с проектом № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденным Президиумом СО РАН.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 127 листах компьютерного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 206 источников, из которых 56 - на иностранных языках. Работа иллюстрирована 39 таблицами.
Средства, применяемые в терапии неврозов
Сформировавшаяся под действием экзогении резидуальная церебральная патология из-за незначительной степени повреждения и компенсаторных возможностей длительное время может себя никак не проявлять. Однако при предъявлении повышенных требований к функциональной активности головного мозга наступает декомпенсация в виде появления неврозоподобной симптоматики. Состояние декомпенсации может наступить под влиянием различных внешних факторов: переутомления в условиях выполнения профессиональной деятельности, при значительном увеличении умственных и физических нагрузок, перепадах атмосферного давления, при изменении погоды, резком изменении климатических условий, длительном сдвиге стереотипных биоритмов, особенно сна и бодрствования, интеркуррентных заболеваниях, после длительного эмоционального напряжения, алкоголизации, при повторных черепно-мозговых травмах (Круглов Л. С., 1998; Александровский Ю. А., 2000; Гиленко М.В., Вандыш-Бубко В. В. и соавт., 2014).
По мнению многих авторов, существенную роль имеют гендерные и возрастные различия в предпочтительности невротического реагирования на воздействие психического стресса. Большинство исследователей отмечают различие форм реагирования у лиц мужского и женского пола, обусловленные сочетанием социальных (различие копинг-стратегий преодоления стресса) и биологических (физиологическое различие реагирования) предпосылок развития неврозоподобных состояний (Дмитриева Т.Б., Дроздов А. 3., 2010). Установлено, что в позднем возрасте более свойственна тревожная депрессия с эгоцентрической направленностью, эпатажно-шантажным деструктивно-агрессивным инфантильным поведением, соматоформными расстройствами у женщин и обсессивно-компульсивными расстройствами у мужчин (Будза В.Г. и соавт., 2009). Некоторые исследователи отмечают, что под влиянием острого или хронического стресса у мужчин чаще возникают соматические нарушения, а у женщин — психопатология. При этом психическая патология также имеет четкую половую зависимость. Для мужчин более свойственны антисоциальные личностные расстройства и агрессивные (аутоагрессивные) формы поведения (Moller- Leimkuhler А. М., 2003; Мел-лер-Леймкюллер А. М., 2004; Afifi М., 2007). У женщин чаще развиваются различные аффективные нарушения, невротические расстройства (Меллер -Леймкюллер А. М., 2004; Afifi М., 2007). Эти наблюдения в определенной мере объясняют большее количество мужчин с соматическими нарушениями а женщин с невротическими расстройствами. Известно, что для формирования невротических расстройств большую значимость имеют признак, характеризующих индивидуальность человека; темперамент, характер, личностные особенности. По мнению ряда авторов, наличие отчетливых индивидуальных различий в устойчивости людей к эмоциональному стрессу в зависимости от индивидуально-типологических особенностей базовых свойств личности. Высокой стрессоустойчивостью обладают экстраверты с пониженной тревожностью и нейротизмом. Напротив, интраверты с повышенной тревожностью и нейротизмом обладают сниженной стрессоустойчивостью. Существенная роль акцентуаций характера для возникновения невротических расстройств признается многими исследователями (Умрюхин Е.А. и соавт., 2002)
В основе развития невротических состояний, по мнению большинства исследователей, лежит синдром хронического стресса, обусловленный депрессией генетически детерминированных адаптационно-компенсаторных механизмов человека, живущего в постиндустриальном обществе (Лебедев, Палатов, 2013). По мнению Д.Ю. Вельтищева (2013) тревога как наиболее подвижный и зависимый от внешних факторов аффект определяет структуру тревожных расстройств адаптации, а расстройства адаптации в ответ на стрессовые ситуации, посттравматические стрессовые расстройства приводят к депрессиям, неврозам. Известно, что стресс, сопровождаемый расстройством адаптации, возникает в ответ на любое психическое расстройство, имеющим психогенную провокацию (Laugharne, Van Der Watt, Janca, 2009). Также отмечено, что в ответ на длительный психологический стресс возникают псхосоматические или неврологические расстройства в зависимости от психологических характеристик личности (Агалаков, 2013).
В последние годы всё большее распространение получает концепция полифакторной этиологии неврозов, основанная на признании единства биологических, психологических и социальных составляющих невротических расстройств (Айрапетянц М. Г., Вейн А. М., 1982; Карвасарский Б. Д., 1990; Александровский Ю.А., 2006). Психическая травма считается одной из важнейших причин невротических расстройств, но ее патогенетическая значимость определяется сложными связями с множеством других предрасполагающих условий (генетическая предрасположенность и приобретенные негативные факторы), которые являются результатом жизнедеятельности и формирования личности.
В настоящее время невротические состояния оцениваются как кон-фликтогенное нервно- психическое расстройство, которое возникает в результате нарушения особенно значимых личных и социальных отношений человека, проявляется в специфических клинических феноменах при отсутствии психотических явлений. Характерными чертами невротического расстройства являются: 1) обратимость патологических нарушений, независимо от их длительности; 2) психогенная природа заболевания, которая определяется существованием связи между клинической картиной болезни, особенностями личности и патогенной психотравмирующей ситуацией; 3) специфичность клинических проявлений, состоящая в доминировании эмоционально- аффективных и соматовегетативных расстройств (Карвасарский Б.Д., 1990, Свядощ А. М., 1997; Шульц Е.В., 2011).
В настоящее время стресс определяется как совокупность неспецифических изменений, происходящих в организме человека при действии на него различных факторов, или стрессоров: физических (холод, физическая нагрузка, жара и т.п.) и психических (опасность, аварийные и чрезвычайные ситуации, конфликтные ситуации в семье и на работе, неожиданное радостное известие и др.). На воздействие стрессора организм отвечает адаптивным процессом, осуществляемым при участии нейроэндокринной системы. Психический или эмоциональный стресс (по Ф. Б. Березину (1988) эти термины являются синонимами) — это разновидность общей системной реакции индивида на воздействие психических стрессоров, которая возникает не в ответ на прямое воздействие, а опосредуется через сложные психические процессы.
Изучение антигипоксической активности
Исследованию подвергался сухой экстракт, полученный из 40% спиртовой настойки корневищ, корней и травы пиона уклоняющегося (Tinctura Paeoniae).
В качестве препарата сравнения использовали 40 % спиртовую настойку пиона (Tinctura Paeoniae). Настойку пиона деалкоголизировали путем выпаривания на водяной бане до 1/10 от исходного объема. Полученный остаток доводили дистиллированной водой до заданного объема в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве (Правила…1992).
Экспериментальная работа выполнена на белых крысах линии Вистар обоего пола массой 160 – 200 г., белых мышах линии СВА обоего пола массой 18 – 20 г. Содержание животных соответствовало «Правила лабораторной практики» (GLP) и приказу МЗ РФ №708Н от 23.08.2010. Эксперименты проводили в соответствии с приказом МЗ РФ №267 «Об утверждении правил лабораторной практики» от 19.06.2003 и правилами, принятыми Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и иных научных целях: EST №123 от 18.03.1986 (Страсбург, 1986). Протоколы исследований согласованы с этическим комитетом ИОЭБ СО РАН.
Водный раствор «Пианекса» в дозе 150 мг/кг вводили внутрижелудоч-но, однократно или курсом в объеме 10 мл/кг за 1 час в зависимости от задачи эксперимента. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды. Животные группы сравнения получали деалкоголизированную настойку пиона в дозе 0,1 мл/100г (пересчет дозы в соответствии с «Руководство по экспериментальному …(2000)») в аналогичном объеме.
В качестве объектов исследования были использованы модельные системы: суспензия эритроцитов, суспензия мононуклеарных лейкоцитов, сус 41 пензия липосом, культуры условно-патогенных микроорганизмов, препараты отрезков тонкого кишечника белых крыс.
При исследовании специфической фармакологической активности использованы адекватные фармакологические, биохимические, физиологические, иммунологические методы исследования в соответствии с рекомендациями ФК МЗ «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000).
Исследование спектра специфической фармакологической активности сухого экстракта пиона уклоняющегося включало определение седативной, противовоспалительной, анальгезирующей, антигипоксической, антистрес-сорной, мембраностабилизирующей и антиоксидантной активности.
Острую токсичность определяли по методу Кербера (Руководство…, 2000) при однократном внутрибрюшинном введении вещества в диапазоне доз: от 500 до 6000 мг/кг и внутрижелудочном введении в диапазоне доз: от 1000 до 8000 мг/кг. Все испытанные дозы доводили дистиллированной водой до конечного объема, составляющего 2,0 мл/100 г массы животного. Наблюдение за общим состоянием белых крыс и их поведением осуществляли в течение 14 дней.
При исследовании потенцирующих и пролонгирующих свойств «Пианэкса» в качестве гипнотического средства использовали гексенал (гек-собарбитал) (Воронина, Неробкова, 2000). В серии предварительных экспериментов путем построения кривой зависимости доза-эффект была определена доза гексенала, вызывающая боковое положение у 5 % животных (ЭД5 ), которая составила 55,0 мг/кг. Также были использованы хлоралгидрат в дозе 100,0 мг/кг и седуксен в дозе 20,0 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении (Гацура, 1974; Фруентов и соавт., 1987).
В качестве конвульсантов использовали коразол и стрихнин, выбор которых был основан на их преимущественном влиянии на разные отделы ЦНС. Судороги у животных вызывали однократным подкожным введением водных растворов коразола в дозе 100 мг/кг (DL100), стрихнина нитрата в дозе 2 мг/кг (DL100) (Гацура, 1974), тиосемикарбазид в дозе DL100 , составляющей 30 мг/кг (Воронина, Неробкова, 2000).
Гипобарическую гипоксию воспроизводили общепринятым методом в специальной барокамере, в которой с помощью масляного насоса создавали разряжение воздуха, соответствующее «подъему» животных на высоту 10000 м. «Подъем» осуществляли со скоростью 20 м/мин до высоты 6000 м. На данной высоте «подъем» прекращался на 2 мин (площадка). Затем с такой же скоростью совершали «подъем» далее до высоты 10000 м. Модель гемиче-ской гипоксии воспроизводили путем однократного внутрибрюшинного введения животным водного раствора натрия нитрита в дозе 210 мг/кг (Костю-ченков, Фаращук, 1982). Модель гиперкапнической гипоксии создавали путем помещения животного в стеклянную емкость с герметичными крышками, которые опускали под воду для избежания подсоса воздуха. Устойчивость животных к действию гиперкапнической гипоксии определяли по времени жизни животных от момента закрытия емкости до прекращения дыхания (Руководство…, 2000). Модель тканевой гипоксии воспроизводили путем однократного внутрибрюшинного введения животным водного раствора нит-ропруссида натрия в дозе 42 мг/кг (Воронина, Неробкова, 2000).
Влияние на устойчивость к стрессовому воздействию оценивали на модели иммобилизационного стресса путем фиксации животных в положении на спине в течение 12 и 24 часа. Для оценки антистрессорной активности определяли выраженность триады Селье: гипертрофию надпочечников, инволюцию иммунокомпетентных органов (тимуса и селезенки) и наличие деструктивных изменений в слизистой оболочке желудка. Желудок разрезали по большой кривизне и, после промывания в физиологическом 0,9% растворе NaCl, подсчитывали количество деструкций, которые подразделяли на точечные кровоизлияния, эрозии и полосовидные язвы. Для каждого вида повреждений подсчитывали «индекс Паулса» (ИП) по формуле (Амосова Е.Н., 1998): А х В ИП = ; 100 где: А - среднее количество деструкций в группе; В - процент животных с повреждениями в группе. Модель эмоционального стресса воспроизводили в стеклянном бассейне с уровнем воды (25С) по мечевидный отросток животных, помещенных свободно в пластиковые пеналы (длина – 16,5 см, внутренний диаметр – 5,5 см) (Overmier J., 1986) в течение 4 часов.
Оценку влияния фитосредства на поведенческую и познавательную активность животных проводили с использованием методов «открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ), «условного рефлекса пассивного избегания» (УРПИ) (Методические рекомендации…, 2005). Анксио-литическое действие и влияние на ГАМК-ергическую системы исследовали с помощью метода конфликтной ситуации по Vogel (Воронина, Середенина, 2000). Для оценки влияния испытуемого средства на продолжительность наркотического сна использовали тиопентал натрия в дозе 42 мг/кг при его однократном внутрибрюшинном введении (Воронина, Неробкова, 2000). Регистрировали продолжительность сна по времени засыпания животных (принятия бокового положения) и времени пробуждения (выхода из бокового положения).
Для оценки противовоспалительной активности определяли влияние на экссудацию, альтерацию, эффективность при остром перитоните.
Изучение антиэкссудативной активности проводили на моделях острого асептического воспаления задней конечности животного и острого перитонита. Асептическое воспаление моделировали путем однократного суб-плантарного введения в заднюю конечность белых крыс 0,1 мл 3%-ного раствора формалина (Стрельников, 1960). Выраженность отека оценивали онко-метрическим методом по разнице между объемами здоровой и отечной лапки. Для определения влияния испытуемого средства на процессы альтерации воспалительный процесс моделировали по методу Menkin (Ойвин, Ше-тель, 1961) путем подкожного введения белым крысам в область спины 0,5 мл 9%-ного раствора уксусной кислоты, одновременно внутрибрюшинно вводили раствор декстрана в дозе 300 мг/кг. Площадь некротизированной ткани оценивали планиметрическим методом.
Острый перитонит вызывали внутрибрюшинным введением 1,0 мл 0,2 % раствора нитрата серебра (Александров и соавт., 1986). Определяли объем экссудата в брюшной полости и количество дегранулированных тучных клеток в брыжейке, для чего брыжейку фиксировали смесью Карнуа и окрашивали 0,05% раствором толуидинового синего. Подсчет количества деграну-лированных тучных клеток осуществляли в 100 окнах при увеличении (х 20). Оценку анальгезирующей активности проводили с использованием модели «уксусных корчей», вызываемых внутрибрюшинным введением 0,75 % водного раствора уксусной кислоты в объеме 0,2 мл/20 г (Методические рекомендации …, 1983).
С использованием методов in vitro определяли мембраностабилизи-рующую активность фитосредства по выраженности перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов. Перекисный гемолиз эритроцитов воспроизводили с помощью реактива Фентона, осмотический гемолиз моделировали добавлением к 1% суспензии эритроцитов равного объема дистиллированной воды (Ковалев и соавт., 1986).
Для определения антирадикальной активности (АРА) по отношению к супероксидным анион-радикалам определяли по методу A.S. Chen и соавт. (2003), по отношению к NO - по методу R. Govindarajan и соавт. (2003). Хе-латирующую активность определяли с использованием О-фенантролинового метода (Теселкин, 1997). Кроме того оценивали динамику накопления ТБК-активных продуктов в суспензии липосом яичного желтка (Клебанов и со-авт., 1988).
Влияние на поведенческую активность в конфликтной ситуации
Опыты проведены на белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180-200 г. Моделирование воспалительного процесса осуществляли по методу Менкина (Ойвин, Шетель, 1961) путем подкожного введения 0,5 мл 9 % раствора уксусной кислоты в область спины животного с предварительно выстриженной шерстью. Одновременно с этим внутрибрюшинно вводили раствор декстрана в дозе 300 мг/кг. Первое введение «Пианэкса» в дозе 150 мг/кг осуществляли за 1 час до введения уксусной кислоты, а затем ежедневно 1 раз в сутки в течение 25 дней. В качестве препарата сравнения использовали калефлон в дозе 100 мг/кг, вводимый по аналогичной схеме. На 2, 9 и 25 сутки эксперимента оценивали площадь некротизированной ткани планиметрическим методом. Полученные данные представлены в таблице 3.5.2.1.
Как следует из приведенной таблицы, введение «Пианэкса» в дозе 150 мг/кг на фоне повреждения тканей уксусной кислотой оказывает достаточно выраженный противовоспалительный эффект, уменьшая степень альтерации тканей и укоряя их регенерацию.
При этом противовоспалительный эффект испытуемого средства проявляется на 9 сутки эксперимента: в этом случае площадь повреждения тканей была на 27 % меньше, чем в контроле. Кроме этого, было выявлено наличие выраженной антиальтеративной активности, о чем свидетельствует то, что в опытной группе у 4 крыс из 8-ми на 2 сутки эксперимента не развилось язвенного поражения, а у 2 крыс с развившейся альтерацией, ее площадь была несколько меньше, чем у животных контрольной группы. На 25-е сутки эксперимента площадь язвенного повреждения у крыс, получавших «Пиан-экс», была в среднем на 24 % меньше по сравнению с показателями у животных контрольной группы. Установлено, что противовоспалительная активность «Пианэкса» на фоне альтерации тканей уксусной кислотой уступала таковой у препарата сравнения.
Эксперименты проведены на белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180-200 г. Воспалительную реакцию вызывали по методу Ф. Тринус и соавт (1975). Стерильные ватные шарики массой 15 мг имплантировали под кожу крыс в области спины в асептических условиях. Водный раствор «Пианэкса» вводили внутрижелудочно в дозе 150 мг/кг 1 раз в сутки в тече 59 ние 7 дней. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество воды очищенной по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения использовали калефлон в дозе 100 мг/кг. Через 17 суток извлекали гранулемы и проводили взвешивание на аналитических весах в сыром виде (сразу после извлечения) и после высушивания при температуре 70о С в течение 24 часов (до постоянной массы). Полученные данные приведены в таблице
Полученные данные свидетельствуют, что исследуемый фитоэкстракт в дозе 150 мг/кг не оказывает существенного влияния на процесс развития гранулемы, однако при этом обнаруживается тенденция к стимулированию образования грануляционно-фиброзной ткани. Так, в среднем, масса сухой гранулемы у крыс, получавших «Пианэкс», была на 18 % больше, чем в контроле (результаты недостоверны). Учитывая то, что масса влажных гранулем опытных и контрольных животных была практически одинаковой, можно полагать, что разница в массе сухих гранулем обусловлена наличием у «Пианэкса» антиэкссудативного эффекта.
Эксперименты проведены на крысах обоего пола линии Вистар массой 180-200 г. Оценку анальгезирующей активности проводили с использованием модели «уксусных корчей», вызываемых внутрибрюшинным введением 0,75% водного раствора уксусной кислоты в объеме 0,2 мл/20 г (Методические рекомендации …, 1983). Животным опытной группы внутрижелудочно вводили раствор «Пианэкса» в дозе 150 мг/кг многократно в течение 7 дней 1 раз в день, последнее введение осуществляли за 1 час до тестирования. Крысы контрольной группы получали эквиобъемное количество очищенной воды. В качестве препарата сравнения использовали деалкоголизированный раствор настойки пиона в объеме 10 мл/кг, вводимый по аналогичной схеме. Для оценки анальгезирующей активности определяли латентный период и подсчитывали количество «корчей» в течение 20 минут после введения уксусной кислоты. Полученные данные приведены в таблице 3.5.4.1. Таблица 3.5.4.1 - Влияние «Пианэкса» на латентный период и количество «корчей» у белых мышей, индуцированных уксусной кислотой (СН3СООН + настойка пиона) 9,1 + 0,35 7,2 + 0,33 Как следует из приведенных данных профилактическое многократное введение испытуемого средства в дозе 150 мг/кг оказывает выраженное анальгезирующее действие, уменьшая чувствительность ноцицептивной системы животных. В частности об этом свидетельствует удлинение латентного периода «уксусных корчей» и уменьшение их количества в среднем на 30% по сравнению с аналогичными данными у животных контрольной группы. При этом анальгезирующая активность «Пианэкса» была аналогичной таковой у препарата сравнения – настойки пиона.
Фармакотерапевтическая эффективность «Пианэкса» при иммобили-зационном стрессе
Данные, приведенные в таблице 5.3.3. свидетельствуют, что иммобилизация продолжительностью 12 часов вызывает у крыс контрольной группы повышение концентрации МДА в - 2 раза и сопровождается значительным снижением активности ферментов антиоксидантной защиты: СОД и каталазы соответственно на 78 и 30% по сравнению с аналогичными данными ин-тактных животных. Превентивное введение испытуемого средства в дозе 150 мг/кг оказывало антиоксидантное действие, о чем свидетельствует снижение концентрации МДА на 20% по сравнению с контролем, увеличение содержания восстановленного глутатиона в сыворотке крови, а также повышение активности каталазы и супероксиддисмутазы соответственно на 20 и 50% по сравнению с аналогичными показателями животных контрольной группы. При этом антиоксидантная активность испытуемого средства была аналогичной таковой у препарата сравнения.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что профилактическое введение «Пианэкса» в дозе 150 мг/кг на фоне 12-часового иммоби-лизационного стресса оказывает стресс-протективное действие уменьшая выраженность дегенеративных катаболических изменений во внутренних органах белых крыс. Кроме того, испытуемое средство уменьшает интенсивность процессов перекисного окисления липидов и предупреждает истощение эндогенных антиоксидантных систем организма.
Фармакотерапевтическая эффективность «Пианэкса» при гипобарической гипоксии Опыты проведены на белых крысах обоего пола линии Вистар массой 180-200 г. Острую гипобарическую гипоксию воспроизводили путем «подъема» животных в барокамерной установке на "высоту" 9000 м со средней скоростью 50 м/с и экспозиции их в этих условиях в течение 30 мин. Животным опытной группы профилактически интрагастрально вводили водный Раствор «Пианэкса» в дозе 150 мг/кг в объеме 1,0 мл/кг один раз в сутки в течение 5 дней; последнее введение осуществляли за 1 час до воспроизведения гипоксического состояния. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в соответствующем объеме по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения использовали деалкоголизированный раствор экстракта элеутерококка в аналогичном объеме. Через 3 и 6 часов после ги-поксического воздействия и восстановления нормального режима кислородного обеспечения у животных оценивали динамику изменения ряда биохимических показателей. В гомогенатах головного мозга и печени определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) (Владимиров, 1972); содержание восстановленного глутатиона (Beutler,1963), активность каталазы (Королюк и соавт., 1988). Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 5.4.1. – 5.4.4.
Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что дозированное гипоксическое воздействие субмаксимальной интенсивности сопровождается выраженной активацией процессов свободнорадикального окисления и инги-бированием системы антиокислительной защиты организма лабораторных животных. Таблица 5.4.1 - Влияние «Пианэкса» на содержание малонового диальдегида в тканях белых крыс при экспериментальной гипоксии
Курсовое профилактическое введение «Пианэкса» в дозе 150 мг/кг на фоне острой гипоксии, через 3 и 6 часов периода реоксигенации обусловливает уменьшение скорости накопления МДА в гомогенате головного мозга животных опытной группы в среднем на 45 % по сравнению с данными у крыс контрольной группы. При этом, достоверное уменьшение концентрации МДА в гомогенате печени отмечается только по прошествии 6 часов после гипоксического воздействия. Аналогичный эффект наблюдается и при использовании препарата сравнения – экстракта элеутерококка, его защитное действие в большей мере проявляется в отношении головного мозга животных после 6 часов реоксигенации. Таблица 5.4.2 - Влияние «Пианэкса» на концентрацию восстановленного глу татиона в тканях белых крыс при острой гипоксии
Установлено, что наряду с индукцией процессов перекисного окисления липидов, при острой экспериментальной гипоксии отмечается сущест 88 венное снижение мощности эндогенной антиокислительной системы организма лабораторных животных. В частности об этом свидетельствует уменьшение в постгипоксическом периоде концентрации восстановленного глутатиона и снижение активности каталазы в гомогенатах головного мозга и печени крыс контрольной группы относительно данных у интактных животных (таблица 5.4.2.). При введении испытуемого средства на фоне острой гипоксии наблюдается повышение уровня восстановленного глутатиона в гомогенатах внутренних органов как через 3 часа, так и через 6 часов. Так, концентрация глутатиона у животных этой группы через 3 часа в гомогенатах головного мозга и печени повышается соответственно на 88 и 120 %, по сравнению с контролем, а через 6 часов – практически достигает уровня физиологической нормы. При этом экстракт элеутерококка оказывал аналогичное действие на исследуемый показатель. Таблица
Данные, приведенные в таблице 5.4.3., свидетельствуют, что на фоне острой гипоксии у белых крыс наблюдается резкое снижение активности ка-талазы – фермента, ингибирующего перекисное окисление на инициальной стадии радикалообразования. При этом максимальное снижение активности этого фермента отмечается через 6 часов после восстановления нормального кислородного режима. Курсовое профилактическое введение испытуемого средства животным, подвергшихся гипоксическому воздействию, через 3 часа постгипоксического периода сопровождается увеличением активности ка-талазы в ткани головного мозга и печени соответственно на 30 и 53%; а по прошествии 6 часов после гипоксического воздействия этот показатель повышался соответственно на 72 и 37% по сравнению с данными в контроле. Полученные данные свидетельствуют, что в ранний период реоксигенации восстановление активности этого фермента в большей степени происходит в печени, тогда как в головном мозге отмечается обратная тенденция – более интенсивное повышение активности каталазы наблюдается в поздний период реоксигенации.
Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что курсовое профилактическое введение «Пианэкса» в дозе 150 мг/кг при острой гипобарической гипоксии оказывает антигипоксическое действие, поддерживая на более высоком уровне процессы энергетического обеспечения структур головного мозга и других тканей организма лабораторных животных. Можно полагать, что механизм коррекции кислороддефицитных состояний препарата связан с его антиоксидантным действием и стабилизацией биологических мембран, в том числе мембранных структур митохондрий. Известно, что в условиях недостатка кислорода уменьшается концентрация АТФ, сопровождаемое нарушением работы ионных насосов, вследствие чего отмечается повышение внутриклеточной осмотической концентрации, вызывающей набухание митохондрий (Владимиров, 1989). В этой связи, применение испытуемого средства, обладающего выраженным антиоксидантным и мембраностабилизирующим эффектом, очевидно, обеспечивает его протек-тивное действие и при острых гипоксических состояниях.