Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Ямр-методы исследования динамики белков и примеры их применения 15
1.1. Природные зонды, дающие информацию о молекулярной динамике посредством ядерного магнитного резонанса 15
1.2. Форма линии спектра ЯМР твердого тела, обусловленная анизотропией химического сдвига 17
1.3. Вращение образца под магическим углом 22
1.4. Двумерные обменные ЯМР-эксперименты 26
1.5. Одномерные обменные ЯМР-эксперименты 34
1.6. ЯМР-релаксация 40
1.7. Корреляционная функция молекулярного движения и безмодельный подход 43
1.8. ЯМР и химический обмен в белковых растворах 47
1.9. Особенности проведения ЯМР-экспериментов на различных магнитных ядрах 51
1.10. Конформационная динамика белков 54
1.10.1. Белки в растворе 54
1.10.2. Белки в твердом состоянии 57
1.10.3. Обобщающие замечания 75
ГЛАВА 2. Броуновская динамика и межмолекулярные электростатические взаимодействия белков в растворе 79
2.1. Качественная модель межмолекулярных электростатических взаимодействий 79
2.2. ЯМР-релаксационные эксперименты на протонах белков в растворах тяжелой воды 85
2.2.1. Методы измерения и анализа времен релаксации 85
2.2.2. Результаты экспериментов и их обсуждение 93
2.3. Анализ дисперсий времен релаксации воды в растворах белков 101
2.4. Диэлектрические эксперименты в растворах миоглобина 108
2.5. Теоретические оценки энергии межмолекулярного электростатического взаимодействия белков и компьютерное моделирование броуновской динамики электрических диполей 112
2.6. Заключение ко второй главе 118
ГЛАВА 3. Исследование внутренних конформационных движений белков и полипептидов в твердом состоянии 120
3.1. Расширение частотного диапазона твердотельного ЯМР- эксперимента по релаксации во вращающейся системе координат для случая гетероядерной дипольной релаксации 120
3.1.1. Использование отстройки от резонанса частоты поля спин-лока 122
3.1.2. Использование дипольной развязки от протонов во время действия спин-лока 129
3.2. Сравнение внутренней динамики белков в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях 134
3.2.1. Постановка задачи 134
3.2.2. Условия эксперимента 136
3.2.3. Результаты и обсуждение 137
3.3. Исследование динамики биополимеров с помощью ЯМР релаксации на ядрах *Н и ,3С естественного содержания 144
3.3.1. Полилизин -релаксация на ядрах 13С естественного содержания 144
3.3.1.1. Условия эксперимента и методы анализа 145
3.3.1.2. Динамика боковых цепей 150
3.3.1.3. Динамика основной цепи 155
3.3.1.4. Выводы 156
3.3.2. Сравнительный анализ динамики полилизина и лизоцима по данным релаксации на ядрах 13С естественного содержания 158
3.3.2.1. Результаты 158
3.3.2.2. Обсуждение 161
3.3.3. Полилизин - сравнительный анализ ЯМР- релаксации на ядрах !Н и 13С 166
3.3.3.1. Преимущества и особенности сравнительного анализа ЯМР-релаксации на ядрах Ни С в биополимерах 167
3.3.3.2. Условия эксперимента и методы анализа. 168
3.3.3.3. Результаты и обсуждение 173
3.4. Применение твердотельной обменной ЯМР-спектроскопии для исследования низкочастотной внутренней динамики белков 187
3.4.1. Исследование динамики основной цепи барстара и полиглицина с помощью последовательности tr- ODESSA 187
3.4.1.1. Условия эксперимента и результаты 187
3.4.1.2. Спиновая диффузия 191
3.4.1.3. Молекулярное движение основной цепи барстара 197
3.4.2. Совместный анализ обменных и релаксационных ЯМР-данных - метод SREDA 200
3.4.2.1. Условия эксперимента 201
3.4.2.2. Математическое описание метода SREDA. 203
3.4.2.3. Результаты и обсуждение 206
3.4.3. Эффект зависимости скорости спиновой диффузии между ядрами 15N от частоты ВМУ 215
Основные выводы и результаты 224
Благодарности 228
Ссылки 229
- Форма линии спектра ЯМР твердого тела, обусловленная анизотропией химического сдвига
- Диэлектрические эксперименты в растворах миоглобина
- Сравнение внутренней динамики белков в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях
- Применение твердотельной обменной ЯМР-спектроскопии для исследования низкочастотной внутренней динамики белков
Введение к работе
Схематическое изображение пространственной структуры основной цепи лизоцима Т4.
Наряду с ДНК белки являются основными биологическими макромолекулами, благодаря которым на Земле существует жизнь во всех ее формах. Они выполняют множество важных для живых организмов функций - транспортных, ферментативных, регуляторных, механохимических и других. Белок представляет собой длинную одномерную полимерную цепь, состоящую из звеньев -аминокислот. Всего существует 20 различных типов природных аминокислот, которые различаются друг от друга химическим строением боковой цепи. Длина полипептидной цепи для различных белков варьируется от 30-40 до многих сотен и даже тысяч аминокислот. Принципиально важным отличием белков от синтетических полимеров является то, что каждый белок имеет свою уникальную нативную конформацию, то есть пространственную укладку полипептидной цепи, благодаря которой белок способен выполнять свою биологическую функцию. Эта конформация закодирована в первичной структуре белка, т.е. в последовательности аминокислот. В качестве примера на рисунке слева изображена структура основной цепи одного из глобулярных белков, лизоцима фага Т4. За последние десятилетия белки стали едва ли не самым популярным биологическим объектом, который интенсивно изучается физическими методами. Основная цель исследования белков - это изучение молекулярных механизмов их биологического функционирования. Иными словами, люди пытаются понять, как белок работает. Кроме того, что это интересно само по себе, эти исследования также имеют и сугубо практическое значение: если знать механизм действия белка, его можно модифицировать или придать ему новые функции. А это очень важно для биотехнологии и медицины,
Хотя и очень условно, работы по изучению механизмов функционирования белков можно разделить на два направления. Одно из них - это структурные
исследования, другое - изучение молекулярной динамики белков. К настоящему времени не подвергается сомнению, что оба эти фактора крайне важны для понимания молекулярных основ биологической работы белков. Однако исторически сложилось так, что структурные исследования белков начались гораздо раньше, и в этой области науки сделано намного больше, чем в исследованиях по молекулярной динамике. Сильный толчок развитию науки о белках дала первая расшифровка пространственной структуры глобулярного белка (гемоглобина) методом рентгеноструктурного анализа [1], за что в 1962 году Макс Перутц получил Нобелевскую премию. За прошедшее с тех пор время этим методом расшифровано уже много тысяч структур различных белков. Знание пространственной структуры действительно во многом объясняет многие свойства и функциональные возможности белка. Часто это достигается сравнительным анализом структур одного и того же белка в различных биологических состояниях, например, белка дикого типа и мутанта, свободного и связанного с лигандом и т.д. Достижения в структурном анализе обусловили развитие исследований корреляции между первичной и пространственной структурами, что очень важно для понимания механизмов фолдинга (самосборки) белка.
Второй всплеск интереса к структурным исследованиям белков пришелся на конец восьмидесятых - девяностые годы прошлого столетия. Он связан с развитием другого мощного метода определения структуры белков - многомерного и мультиядерного ЯМР высокого разрешения в растворах. За эти работы тоже была присуждена Нобелевская премия, которую в 2002 году получил швейцарец Курт Вютрих [2]. И рентгеноструктурный анализ, и ЯМР обладают своими методическими достоинствами и недостатками, но у ЯМР есть одно важное и бесспорное преимущество: в то время как рентгеноструктурный анализ может работать только в монокристаллах белков, ЯМР определяет пространственную структуру белков непосредственно в водных растворах, то есть в их естественной среде.
Следует отметить, что в природе существует очень широкий класс белков, которые не кристаллизуются и, в то же время, нерастворимы, как, например, большинство мембранных белков. Для определения их структуры наиболее приемлемым методом является ЯМР твердого тела. Но у твердотельного ЯМР есть
несколько существенных методических проблем, которые пока не позволяют использовать его в структурных исследованиях белков так же широко, как рентгеноструктурный анализ и жидкостный ЯМР. Тем не менее, в последние годы идет интенсивное развитие методик твердотельного ЯМР, позволяющих соотносить линии в спектрах и определять расстояния, планарные и торсионные углы между магнитными ядрами [3-5]. Не так давно группой Хартмута Ошкината в Германии была расшифрована первая структура белка в твердом состоянии методом ЯМР твердого тела [6]. И не исключено, что через некоторое время мы будем свидетелями очередного бума структурных исследований.
Несмотря на то, что знание пространственного строения полипептидной цепи открывает путь к пониманию очень многих свойств белка, почти сразу же стало ясно, что одной только этой информации недостаточно для полного детального объяснения механизма функционирования белка на молекулярном уровне. Это можно продемонстрировать на примере того же самого гемоглобина. Его биологическая функция состоит в транспортировке кислорода в крови. Молекула кислорода связывается в активном центре белка, геме, и таким образом переносится в нужное место. Детальный анализ пространственной структуры показывает, что щель, соединяющая гем с поверхностью белка, очень узка для молекулы кислорода, и для того, чтобы она сквозь нее "протиснулась", необходимо предположить, что структура белка подвижна. В те моменты, когда щель приоткрывается, гем становится стерически доступным, и тогда возможно связывание белка с молекулой кислорода. Детально роль молекулярной динамики в биологическом функционировании гемоглобина была рассмотрена в серии работ Мартина Карплюса (см. обзор [7] и ссылки в этой работе).
Это один из самых простейших и очевидных, но далеко не самый исчерпывающий пример важности динамики для биологической функции. Механизмы вовлечения молекулярной подвижности в работу белка могут быть весьма замысловатыми и не столь легко объяснимыми. Пока не существует, да, наверное, и не может существовать в принципе, единого рецепта или алгоритма связи тех или иных молекулярно-динамических параметров с той или иной биологической функцией. Это очень специфическая проблема, которая должна анализироваться в каждом конкретном случае по-своему. Молекулярным
механизмам вовлечения динамики в биологическую функцию посвящен ряд последних обзоров по динамике белков [8-13].
Кроме внутримолекулярной конформационной динамики белков, о которой шла речь выше, для глобулярных белков в растворе существует еще один, практически независимый от внутренней динамики, тип движения. Это броуновская трансляционная и вращательная диффузия белка как целого. Биологическая роль броуновской динамики более проста и прозрачна - обеспечить пространственное сближение и необходимую ориентацию друг относительно друга белка и его субстрата.
Частотный диапазон колебаний атомов белка очень широк. Характерное время самых быстрых движений - фемтосекунды, самых медленных - секунды и даже минуты. Фемтосекундная область соответствует колебаниям валентных связей и валентных углов. Пикосекундная область и все, что медленнее, обуславливается конформационными степенями свободы структуры белка - двугранными (торсионными) углами ф и ф, обеспечивающими гибкость основной цепи белка, а также двугранными углами %, определяющими конформацию боковых цепей аминокислотных остатков. Колебания этих углов могут быть очень быстрыми, если речь идет о движении отдельных химических групп. Например, характерное время вращения трех метальных протонов вокруг оси симметрии метальной группы при комнатной температуре составляет единицы пикосекунд. Низкоамплитудные некоррелированные колебания отдельных боковых цепей или небольших участков основной цепи в пределах стерических ограничений могут составлять доли и единицы наносекунд. Крупномасштабные конформационные переходы всегда являются высококоррелированными изменениями многих степеней свободы белка, поскольку обычно белки - довольно плотноупакованные структуры, практически без свободного объема внутри глобулы. Сколько-нибудь заметные смещения одного участка структуры белка могут происходить только при согласованном смещении соседних участков. Характерное время внутренней динамики этого типа находится в микро- и миллисекундном диапазонах. Следует отметить, что временной масштаб этой медленной динамики совпадает с временным масштабом многих молекулярно-биологических процессов, например, таких как связывание с субстратом, катализ, фолдинг и т.п. Поэтому вполне естественно предположить, что именно медленная
конформационная динамика наиболее значима для биологической функции белка и именно ее изучение представляет наибольший интерес с точки зрения биологии.
Комплекс методов, применявшихся до сих пор для изучения молекулярной динамики белков, включает в себя ЯМР, ЭПР, диэлектрическую, флуоресцентную, инфракрасную и мессбауэровскую спектроскопии, нейтронное рассеяние, компьютерное моделирование и даже рентгеноструктурный анализ, который дает информацию о т.н. В-факторах, т.е. степени "размазывания" координат атомов в пространстве из-за молекулярной подвижности. Не в обиду будь то сказано специалистам из других областей, однако к настоящему времени стало совершенно очевидно, что для белков самым мощным, самым информативным методом, имеющим самый широкий спектр возможностей, является ЯМР. Для этого есть целый ряд причин, самая главная из которых - это селективность структурной и динамической информации, получаемой с помощью ЯМР. Это обусловлено тем фактом, что магнитные ядра, на которых можно проводить эксперименты, прежде всего, протоны, азоты и углероды, распределены по всей структуре белка. А современные методики ЯМР позволяют, хотя, конечно, и не во всех случаях, различать эти ядра и соотносить их с химической структурой белка. Практически все остальные экспериментальные методы дают информацию о природных зондах, которые либо локализованы только в одном месте белковой глобулы (мессбауэровская спектроскопия, флуоресценция, ЭПР), либо являются интегральной характеристикой всей глобулы, не дающей информации о различных ее частях (диэлектрическая спектроскопия, нейтронное рассеяние). Более детальную и обширную по сравнению с ЯМР информацию о молекулярной динамике может дать только компьютерное моделирование. Но этот метод только условно может считаться истинно экспериментальным, поскольку все силовые поля, используемые при моделировании таких сложных молекул как белки, являются только приближением.
К настоящему времени накоплен обширный экспериментальный материал, характеризующий динамику многих биополимеров в различных состояниях и при различных экспериментальных условиях. Тем не менее, не до конца решенными остаются несколько важных проблем, которые имеют фундаментальное значение для дальнейшего развития этой области научных исследований. В частности, нет
ясного общего представления о том, как межбелковые контакты и взаимодействия влияют на динамическое поведение белков. В живой клетке белки находятся в непосредственном окружении других белков и различных (макро)молекул. Очевидно, что вопрос о влиянии межмолекулярных взаимодействий на различные параметры динамики является очень существенным для выяснения молекулярных механизмов биологического функционирования белков.
В растворах очень важным является эффект взаимного электростатического ориентирования биомолекул. Он является ключевым в процессе "докинга" (docking), то есть "причаливания" двух белков (или белка и субстрата) друг к другу. Комплементарные электростатические свойства двух молекул могут на много порядков ускорять процесс нахождения, распознавания и связывания их друг с другом по сравнению с простым механизмом тепловой броуновской диффузии. В то же время, даже если белки в растворе не обладают комплементарной электростатической структурой, их межмолекулярные взаимодействия на относительно длинных расстояниях могут сказываться на характере их броуновской диффузии. До сих пор при анализе различных экспериментальных данных этим эффектом в подавляющем большинстве случаев пренебрегали. Но следует отметить, что без точной информации о вращении белка как целого корректно определить параметры его внутренних движений невозможно.
Остается также открытым вопрос о влиянии межмолекулярных контактов на динамические свойства белков в твердых препаратах. Если вопрос об идентичности структур белков в кристаллах и растворах был в целом благополучно разрешен путем сравнения структур, определенных методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР высокого разрешения [14], то в отношении динамики ясной картины на этот счет нет. Это, кстати говоря, является одной из причин неоднозначного отношения некоторых исследователей к биологической значимости изучения глобулярных белков в твердом состоянии.
Другая проблема - это механизмы влияния гидратной воды на внутреннюю динамику белков. Изучение взаимодействия белков с водой является одним из самых популярных направлений исследований в физике белков, поскольку вода обуславливает их многие биологические свойства. То, что гидратация оказывает значительное влияние на динамические свойства биополимеров, известно очень
давно. Но в силу ряда методических причин, которые будут подробно обсуждаться ниже, большинство работ по изучению влияния гидратации на динамику носит качественно-сравнительный характер. Из таких результатов однозначно определить физические факторы и механизмы влияния гидратации на внутреннюю динамику достаточно сложно. Почему на разные биополимеры и на разные параметры динамики гидратная вода влияет по-разному - здесь еще много неясного.
Наконец, еще одна очень важная проблема - это определение физической модели молекулярного движения из экспериментальных данных. Практически любой ЯМР-эксперимент, ориентированный на изучение молекулярной динамики, позволяет определить только степень усреднения того или иного типа взаимодействия магнитных ядер либо с внешним полем, либо друг с другом (эта степень часто называется параметром порядка, который был введен Липари и Сзабо в рамках так называемого безмодельного подхода [15,16]) и временной масштаб этого усреднения. В подавляющем большинстве случаев эту степень усреднения невозможно однозначно переформулировать в понятные для описания молекулярной динамики параметры - амплитуды движения, выраженные в ангстремах или градусах, стереометрические модели, степень корреляции между движениями различных элементов структуры. Это принципиальное отличие динамических ЯМР-экспериментов от структурных. В последних конечным результатом являются как раз вполне «осязаемые» для определения структуры параметры - межатомные расстояния и различного рода углы. А конечным результатом динамических экспериментов являются некие промежуточные параметры, чувствительные к молекулярной динамике, но связанные с ней неоднозначно.
Кроме того, следует иметь в виду, что сам процесс получения этих промежуточных параметров из эксперимента зачастую неоднозначен. Например, из измерения одного или двух времен релаксации невозможно однозначно определить параметр порядка молекулярного движения и/или времени корреляции. Из формы линии твердотельного спектра, записанного при одной температуре, невозможно однозначно определить параметры реориентации тензора АХС. Для определения этих параметров необходимо или проведение большого числа различных экспериментов, и/или априорное использование той или иной модели.
Говоря о медленных конформационных движениях, которые, как мы отметили выше, наиболее интересны с точки зрения биологии, следует упомянуть о еще одной важной методической проблеме, которая существенно усложняет изучение молекулярной динамики этого типа в белковых растворах. Дело в том, что изотропное броуновское вращение белка как целого накладывается на внутреннюю динамику, и все медленные внутренние движения, которые имеют время корреляции длиннее, чем время корреляции броуновского вращения (для большинства белков
порядка 10" с), становятся практическими невидимыми для физических методов, регистрирующих механическую реориентацию того или иного природного зонда. В число этих методов попадают ЯМР-релаксация, диэлектрическая и флуоресцентная спектроскопии, ЭПР. Впрочем, ситуация не безнадежна, есть эксперименты, позволяющие регистрировать медленные движения и в растворах. Например, метод водородного обмена, который определяет скорость химического обмена лабильных протонов белка на дейтероны растворителя. Хотя и косвенно, он дает информацию о крупномасштабных конформационных переходах, обеспечивающих контакт молекул растворителя с тем или иным доменом структуры белка. Кроме того, ЯМР позволяет регистрировать медленные движения, если они приводят к изменению изотропного химического сдвига магнитного ядра (эти эксперименты будут более подробно рассмотрены в первой главе). Однако эти методы позволяют только зарегистрировать сам факт наличия медленного движения и оценить его время корреляции. Информация об амплитуде и геометрии движений с помощью этих методов недоступна. Решением проблемы здесь может стать только изучение динамики белков в твердом состоянии, то есть в виде порошков или кристаллов, где броуновское вращение отсутствует. На настоящий момент, область изучения динамики биополимеров с помощью твердотельного ЯМР очень привлекательна тем, что она в гораздо большей степени представляет собой terra incognita по сравнению с жидкостным ЯМР и открывает широкий простор для применения новых нестандартных подходов и решений, особенно в методологии ЯМР-экспериментов. Этим исследованиям посвящается большая часть диссертации.
Основными задачами данной работы являются, во-первых, изучение влияния межмолекулярных взаимодействий на динамическое поведение белков, как в растворе, так и в твердом состоянии и, во-вторых, разработка способов получения
информации о физических моделях динамики биополимеров непосредственно из экспериментальных данных. Диссертация состоит из трех глав. В первой главе дано систематическое изложение основных типов ЯМР-экспериментов и их математического формализма, позволяющих получать информацию о молекулярной динамике. Особое внимание уделено описанию твердотельных одномерных обменных ЯМР-экспериментов с вращением образца под магическим углом. Методика этих экспериментов была разработана совсем недавно и, в отличие от релаксации или анализа формы линии спектра, их пока нельзя причислить к числу рутинных методов исследования молекулярных движений. Поскольку в диссертации этот метод используется в детальном количественном исследовании динамики белков, описание математических основ обменных экспериментов является важной частью первой главы. Кроме того, в первой главе представлен краткий литературный обзор основных направлений исследований динамики белков, как в растворе, так и в твердом состоянии. В этом обзоре описаны основные методические подходы, обобщение ключевых результатов, полученных к настоящему времени, и основные нерешенные проблемы в этой области науки.
Вторая глава посвящена изучению влияния межмолекулярных взаимодействий между белками в растворе на характер их броуновской диффузии и построению модели, адекватно объясняющей наблюдаемые в эксперименте особенности движения белков при различных экспериментальных условиях. Для изучения динамики белков в растворе был применен целый комплекс различных физических методов - ЯМР-релаксация, временная диэлектрическая спектроскопия и компьютерное моделирование динамики броуновских частиц.
Третья глава посвящена изучению внутренней динамики белков и полипептидов в твердом состоянии. Причина проведения экспериментов именно в твердом состоянии была изложена выше. В этой главе было изучено влияние межмолекулярных контактов на внутреннюю динамику нескольких белков, проведено количественное исследование влияния гидратации на динамику полилизина и лизоцима, а также разработано два метода, позволяющих переходить от безмодельного подхода в анализе экспериментальных данных к получению реальных физических моделей молекулярной подвижности. Ключевым моментом в наших методах является совместный количественный анализ данных различных
ЯМР-экспериментов, проведенных на одном и том же образце. Хотя разработка новых методических подходов не является основной целью диссертации, методические результаты имеют существенное значение, поскольку именно они позволили в результате получить ту информацию о молекулярной динамике, которая была недоступна с помощью стандартных экспериментов.
Работа была выполнена в лаборатории молекулярной биофизики Казанского Института биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Все твердотельные ЯМР-эксперименты, представленные в диссертации, были проведены в группе ЯМР-спектроскопии Университета Мартина-Лютера г. Халле, Германия, в рамках многолетнего сотрудничества между нашими лабораториями. Работа была поддержана рядом инициативных грантов РФФИ и совместных грантов РФФИ и Немецкого Научно-исследовательского Общества (Deutsche Forschungsgemeinschaft). Результаты диссертации докладывались на многих российских и международных конференциях и были опубликованы в различных рецензируемых журналах.
Форма линии спектра ЯМР твердого тела, обусловленная анизотропией химического сдвига
В самом простейшем случае, когда мы имеем в образце только один химический тип магнитных ядер, имеющих одинаковую ориентацию, спад свободной индукции (поперечной намагниченности) выражается так: где Mo - равновесное значение намагниченности, Т2 - время поперечной релаксации, а о - круговая резонансная частота, определяемая внешним магнитным полем В0. ЯМР-спектр представляет собой Фурье-преобразование спада поперечной намагниченности во временной области, что в данном простейшем случае приведет к простой лоренцевой форме линии: (1.2) Как упоминалось выше, химический сдвиг магнитного ядра может зависеть от ориентации молекулы по отношению к внешнему магнитному полю. Эта ориентационная зависимость определяется тензором АХС, она имеет следующий вид: где у - гиромагнитное отношение магнитного ядра, Во - внешнее постоянное магнитное поле, a aZz - zz-элемент матрицы тензора АХС в предположении, что внешнее магнитное поле В0 направлено вдоль оси z. В координатной системе главных осей тензора АХС, то есть в системе, где недиагональные элементы равны нулю, этот тензор имеет вид где элементы Сі і, сг22 и озз определяют химический сдвиг магнитного ядра, если направление 2?0 совпадает соответственно с осями х, у и z этой системы координат (индекс "PAS" является сокращением от principal axes system).
Для перехода из системы главных осей тензора АХС в лабораторную систему используется стандартное преобразование: сг = (0, ) -1 (O.P.Y), (1.5) где J?(cc,p,y) - матрица перехода из одной системы координат в другую (LF -laboratory frame), а, р и у - углы Эйлера, описывающие последовательные повороты системы координат при переходе в новую систему: а соответствует первому повороту вокруг оси z, р описывает поворот вокруг новой оси х, и, наконец, у - это поворот вокруг новой оси z. В явном виде эта матрица преобразования выглядит так: Д(а,р,у) = ґ cosacospcosy-sinasiny sinacospcosy+cosasiny -sinpcosy -cosacosPsiny-sinacosy -sinacospsiny+cosacosy sinpsiny (1.6) ышеприведенные формулы позволяют определить резонансную частоту магнитного ядра при любой ориентации тензора АХС по отношению к внешнему магнитному полю. Если образец изотропен, то есть он представляет собой аморфное тело, поликристалл или порошок, то в нем существует равномерное распределение тензоров АХС по всем возможным ориентациям, а значит и распределение химических сдвигов. Для того, чтобы определить форму линии ЯМР-спектра для этого случая, необходимо проинтегрировать ур-е (1.2) по всем ориентациям тензора АХС. В результате этой, описанной во многих учебниках по ЯМР, стандартной процедуры получается хорошо известная форма линии спектра статического порошкообразного образца. Примеры таких спектров при различных соотношениях сгц, т22 и 033 показаны на Рис. 1.1 (рисунок из монографии [17], в этих расчетах принимается, что 1/72«(сгзз-сгп)уі?о). Форма спектров, представленная на Рис. 1.1, характерна для ядер, имеющих спин /г. Для ядер же, которые имеют спин 1 (из них для исследования биомакромолекул наиболее важны дейтероны), форма спектра всегда зеркально симметрична относительно изотропного химсдвига (см. пример ниже). Это связано с тем, что из-за квадрупольного расщепления поперечная намагниченность этих ядер состоит из двух компонент, каждая из которых имеет свою частоту прецессии. И тогда в выражении (1.1) еш следует заменить на (еш +е ш )/2. Все остальные детали расчетов остаются без изменений. Спектры, показанные на Рис. 1.1, могут дать информацию о параметрах тензора АХС. Но еще большую информативность эти спектры приобретают при наличии в образце молекулярного движения, которое стохастически модулирует ориентацию тензора АХС. В этом случае форма линии претерпевает изменения, и по этим изменениям можно судить о параметрах молекулярной динамики. В предельном случае быстрого (так, что частота молекулярного движения много больше, чем coz-сох) изотропного движения весь спектр "схлопывается" в одну линию на резонансной частоте, соответствующей изотропному химсдвигу:
Именно такие линии мы всегда наблюдаем в растворах. Наиболее сложный, хотя и наиболее интересный, случай имеет место в твердых телах, когда частота молекулярного движения совпадает по порядку величины с АХС, то есть с разницей coz-cox. Для того, чтобы рассчитать форму линии для этого случая используется стандартный подход, описанный, например, в монографии [17]. Он состоит в следующем. Допустим, что молекулярное движение состоит из перескоков тензора АХС между N возможными ориентациями. (В случае непрерывного распределения ориентации N будет стремиться к бесконечности, однако на практике всегда молекулярное движение можно аппроксимировать перескоками между конечным числом дискретных состояний.) Тогда хорошо известные уравнения Блоха несколько модифицируются: движение каждого изохромата намагниченности, соответствующего одной из N ориентации, определяется двумя процессами. Во-первых, прецессией вокруг внешнего магнитного поля где у - номер одной из N ориентации, Кд - при/ А: вероятность перескока в единицу времени из ориентации к в ориентацию j, и Куу определяет вероятность перехода из состояния/ во все остальные ориентации, которая имеет отрицательный знак, coj есть резонансная частота ориентации j, которая определяется соответствующими эйлеровыми углами. Объединяя ур-я (1.8) и (1.9), можно записать общее уравнение Блоха в векторно-матричном виде:
Диэлектрические эксперименты в растворах миоглобина
Другую возможность получить подробную информацию о форме корреляционной функции вращения белка в растворе предоставляет временная диэлектрическая спектроскопия (ВДС). Подробно возможности этого экспериментального метода описаны в серии работ [176,191,192]. ВДС регистрирует функцию дипольной корреляции (ФДК), которую можно выразить так: где M(f) - макроскопический дипольный момент образца. Если представить M(t) в виде суммы дипольных моментов отдельных молекул Л/(/) = //,(/), то тогда ФДК можно записать следующим образом: Первое и второе слагаемые в ур-и (2.26) являются авто- и кросс-корреляционными ФДК, соответственно. В разбавленных растворах, когда межмолекулярное взаимодействие пренебрежимо, кросс-корреляционной ФДК обычно пренебрегают. В нашей лаборатории в 90-е годы И.В. Ермолиной была проведена серия экспериментов по временной диэлектрической спектроскопии в растворах нескольких белков с целью сравнения ЯМР и диэлектрических данных и изучения ФДК белка при различных концентрациях [160,193-195]. Наиболее подробно и детально были изучены растворы миоглобина лошади. Анализ формы ФДК 0.1 (примеры ФДК представлены на Рис. 2.10) показал, что при концентрации раствора меньше, чем 4-5% (по весу), ФДК может быть описана суммой двух экспоненциальных компонент.
Время корреляции наиболее медленной из этих компонент было отнесено к броуновскому вращению белка как целого. Размеры глобулы миоглобина - 45x35x25 А [196], то есть форма белка не очень сильно отличается от шарообразной. Поэтому описание компоненты ФДК, относящейся к вращению белка как целого, одной экспонентой вполне резонно. Короткая компонента относится к более быстрым по сравнению с rR локальным флуктуациям дипольного момента глобулы белка, вызываемым внутренними движениями. При концентрациях более 5% для удовлетворительного описания ФДК необходимо ввести еще одну, самую медленную компоненту, которую, исходя из приведенного выше анализа ЯМР-релаксационных данных, мы относим к медленному движению, появляющемуся благодаря межбелковым электростатическим взаимодействиям. Таким образом, ФДК может быть представлена как сумма трех экспоненциальных компонент, аналогично корреляционной функции, используемой для анализа ЯМР-релаксационных данных, см. ур-е (2.8). Единственная разница между анализом ЯМР-релаксационных и диэлектрических данных заключается в том, что в последнем случае мы не использовали распределение времен корреляции локального движения, а аппроксимировали короткую компоненту ФДК одной экспонентой. Скорее всего, распределение времен корреляции существует и для ФДК (хотя совсем не обязательно такое же, как и для случая ЯМР-релаксации), но ошибка эксперимента не позволяла достоверно определять форму спада короткой компоненты, и потому мы пользовались одноэкспоненциальным приближением. На Рис. 2.11 и 2.12 представлены результаты анализа ФДК в растворах миоглобина - концентрационные зависимости времен корреляции % rR и г& а также параметров порядка S\ и Sf. Эти данные полностью подтверждают выводы, сделанные из анализа ЯМР-релаксации. Если допустить, что увеличение концентрации белка в растворе приводит только к увеличению rR, но форма корреляционной функции броуновского вращения белка при этом не изменяется, то в результате мы получим рост параметра порядка Sf, то есть амплитуды внутренних движений, от концентрации раствора, что объяснить с физической точки зрения практически невозможно.
Что же касается величины Sf 0.9±0.05 (Рис. 2.12), то она близка к другим независимым оценкам доли электрического дипольного момента глобулы белка, которая усредняется за счет быстрых внутренних движений [177,197]. Необходимо напомнить, что время корреляции диффузионного вращательного движения, определяемое методом диэлектрической спектроскопии ровно в 3 раза длиннее, чем время корреляции того же движения, определенное методом ЯМР [27]. С учетом этого, время корреляции TR для миоглобина -30 не (Рис. 2.11) и для лизоцима 8 не (Таб. 2.1 и 2.2) соответствуют друг другу очень хорошо, если принять во внимание молекулярные массы этих белков - 17800 и 14200, соответственно. (Здесь мы не касаемся проблемы соответствия экспериментально определяемых времен корреляции вращательного движения белков стоксовским величинам.
Этому посвящен ряд работ [ 172-174,198-200]). Что касается других микродинамических параметров, определенных из ЯМР и ВДС экспериментов, то их прямое сравнение будет не совсем корректным. ЯМР и ВДС используют разные природные зонды, поэтому совершенно очевидно, что сопоставлять параметры внутренних движений белков Sf и г/ напрямую нельзя. А обсуждая параметры медленной компоненты корреляционной функции вращения как целого, необходимо иметь в виду, что ЯМР дает только авто-корреляционную функцию, в то время как ВДС - сумму авто- и кросс-корреляционных функций, см. ур-е (2.26). Если мы предполагаем межмолекулярное электростатическое взаимодействие белков, то пренебрегать кросс-корреляционным слагаемым в ур-и (2.26), безусловно, нельзя.
Сравнение внутренней динамики белков в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях
Один из ключевых вопросов, встающих при исследовании глобулярных белков в твердом состоянии, который был кратко затронут во Введении, состоит в следующем: насколько влияют межбелковые контакты, которые отсутствуют в естественном для глобулярных белков водном окружении, на структурные и динамические свойства белка? Иначе говоря, насколько правомочно применять информацию, полученную из твердотельных экспериментов, для объяснения молекулярно-биологических свойств белков, которые они проявляют в растворах? Что касается структуры, то уже достаточно давно было показано, что структуры одних и тех же белков, определенных рентгеноструктурным (твердое тело) и ЯМР (растворы) методами, за исключением отдельных специфических случаев одинаковы [14]. Можно ожидать, что и динамика белков в двух состояниях тоже одинакова, но систематических исследований на эту тему до сих пор никто не проводил. Как хорошо известно, одна из основных методических проблем в изучении белков методами твердотельного ЯМР - очень низкое спектральное разрешение. Для того, чтобы получить разрешение, сравнимое с растворами, необходимо применять не только ВМУ и протонный «декаплинг», но также и приготовление белковых образцов в виде микрокристаллов [6,221-224]. Неоднородное микроокружение белковых молекул в аморфном состоянии (коим является лиофилизованный порошок) вызывает неоднородное распределение изотропных химических сдвигов, уширяя линии и ухудшая спектральное разрешение. Хотя, если получение сайт-специфической информации не является целью исследования, эксперименты очень часто проводятся и на порошках (см. 1.10.2).
Как упоминалось выше, есть много примеров исследования порошков белков при различных степенях увлажнения, в которых было убедительно показано, что внутренняя динамика критически зависит от уровня гидратации, см. обзоры [106,225]. Часто многие исследователи неявным образом предполагают, что динамика в полностью гидратированном белке в порошкообразном состоянии и белке в кристалле (в кристалле, как известно, белки тоже находятся в гидратированном состоянии) одинакова, хотя сомнения на этот счет тоже существуют [221]. Нам известна только одна экспериментальная работа, в которой внутренняя динамика одного и того же белка сравнивалась в порошкообразном и микрокристаллическом состояниях [115]. В этой работе сравнивалась форма линии метильных дейтеронов трех метионинов ингибитора субтилизина в статическом состоянии (без ВМУ). Анализ показал, что динамика этих метильных дейтеронов в двух состояниях одинакова. Однако этот результат относится только к нескольким локализациям в структуре белка и к ограниченному частотному диапазону молекулярных движений. В работе, о которой пойдет речь ниже, мы предприняли систематическое сравнение внутренней динамики трех различных белков в форме регидратированного лиофильно высушенного порошка и микрокристаллов. Индикаторами молекулярной динамики были времена релаксации Т\ и 7jff ядер 13С естественного содержания. Напомним, что эти параметры чувствительны к молекулярной динамике в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции, соответственно. Широкий разброс химических сдвигов химически неэквивалентных углеродов позволяет проводить анализ динамики для основной и боковых цепей по отдельности. В качестве объектов исследования были выбраны следующие белки: барстар, лизоцим белка куриных яиц и лизоцим фага Т4. Основной целью данной работы было выяснить, насколько критично влияние микроокружения белковой молекулы на параметры внутренней динамики и насколько разные белки специфичны к влиянию этого микроокружения. 3.2.2. Условия эксперимента. Барстар и яичный лизоцим были естественного изотопного содержания, в то время как лизоцим Т4 был селективно обогащен изотопом 15N по тирозинам. Яичный лизоцим был закуплен в фирме Sigma и использован без дополнительной очистки. 15Nyr лизоцим Т4 и барстар были получены согласно методикам, описанным в [226] и [227], соответственно. Стоит подчеркнуть, что несмотря на одинаковое название, лизоцим белка куриных яиц и лизоцим фага Т4 - белки очень разные [228], поэтому априори ожидать, что они обладают схожими динамическими свойствами нельзя.
Как известно, гидратация является очень важным фактором, влияющим на внутреннюю динамику белка, поэтому корректное сравнение динамики может быть произведено, только если в аморфном состоянии (порошок) белок полностью гидратирован, так же, как и в кристаллическом состоянии. В наших экспериментах порошкообразные образцы белков были гидратированы в вакуумном эксикаторе до уровня 0.5 г Н20 на грамм сухого препарата. Уровень гидратации определялся по взвешиванию образца. Этот уровень гидратации обеспечивает как минимум одну мономолекулярную гидратную оболочку вокруг каждой глобулы белка. Дальнейшее увеличение гидратации может привести к возможности проворотов белка как целого, поскольку объем воды может заметно превышать объем пустот между белками, иначе говоря, из состояния увлажненного порошка образец может перейти в состояние очень концентрированного раствора. Для приготовления микрокристаллических образцов, для каждого белка была проведена серия отсеивающих экспериментов с целью определения наиболее оптимальных условий кристаллизации: рН, состав буфера, концентрация белка и температура. В качестве исходных условий мы исходили из протоколов по выращиванию монокристаллов барстара [229], лизоцима Т4 [230] и куриного лизоцима [231] для
Применение твердотельной обменной ЯМР-спектроскопии для исследования низкочастотной внутренней динамики белков
Белок барстар состоит из 89 аминокислотных остатков, он является внутриклеточным ингибитором внеклеточной эндорибонуклеазы барназы. Барстар связывается с барназой с константой диссоциации 2-Ю"14 М и тем самым предотвращает активность барназы внутри клетки. Взаимодействие барстара и барназы - одно из наиболее сильных и быстрых известных белок-белковых взаимодействий, и потому эти белки являются удобной и частой используемой модельной системой, на которой такие взаимодействия исследуются различными методами. Барстар был выбран нами для данного исследования по нескольким причинам. Во-первых, биохимические свойства, также как и его структура известны достаточно хорошо [254-257]. Во-вторых, барстар - очень небольшой белок, а это обеспечивает высокую концентрацию метки (магнитных ядер) в образце и, следовательно, высокое отношение сигнала к шуму. Как упоминалось в первой главе, для обменных экспериментов наиболее удобными являются магнитные ядра, имеющие наибольшую степень АХС. В белках таковыми являются ядра, расположенные на основной цепи, прежде всего ядра азота и карбонильные углероды. В данной работе обменные эксперименты проводились в полиглицине на карбонильных углеродоах-13 естественного содержания, а в барстаре - на ядрах 15N, для чего белок был тотально обогащен изотопом 15N. Обогащенный барстар был приготовлен Л.О. Ягодиной по методике, разработанной А. Шульгой (Институт Биоорганической Химии им. Шемякина и Овчинникова, Москва). Методика приготовления подробно описана в [124]. Полиглицин был закуплен в фирме Sigma (молекулярный вес 5000-10000) и использован без дополнительной очистки. Как и в случае релаксационных измерений, мы исследовали максимально высушенные и увлаженные до уровня 0.2 г НгО на г сухого белка (полипептида) образцы в порошкообразном состоянии. Увлажнение проводилось в вакуумном эксикаторе. ЯМР-эксперименты проводились на спектрометре Varian Inova с резонансной частотой для протонов 400 МГц. Использовалась измерительная головка с ВМУ с диаметром ротора 7 мм. Обменные эксперименты проводились с использованием импульсной последовательности tr-ODESSA [21 ], которая была описана в первой главе (Рис. 1.6).
Для каждого образца при каждой температуре параллельно с обменными экспериментами также измерялись и спады спин-решеточной релаксации с помощью стандартного метода [211]. На Рис. 3.31 и 3.32 представлены твердотельные спектры барстара и полиглицина. Для сухих и увлажненных образцов спектры были практически одинаковыми. В полиглицине наблюдается два пика, соответствующие СНг и СО-углеродам и ssb пики. В спектрах барстара главный пик при 120 м.д. соответствует основной доле ядер азота белка, которые расположены на основной цепи. Два пика при 75 и 30 м.д. соответствуют ядрам азота боковых цепей аминокислотных остатков His, Arg, Lys, Gin, Asn и Trp. При скорости ВМУ 5 кГц все изотропные и ssb пики хорошо разрешены. Однако чувствительность обменного эксперимента к молекулярной динамике зависит от периода эволюции (см. Главу 1), который в эксперименте tr-ODESSA определяется скоростью вращения под магическим углом, Рисунок 3.31. Твердотельный N-спектр тотально N-обогащенного барстара (резонансная частота для ядер l5N 40.5 МГц, протонный «декаплинг» 70 кГц, t=20 С) при скорости ВМУ 5 кГц (вверху) и 2 кГц (внизу). Обозначения: SC - линии спектра, соответствующие азотам боковых цепей; SSB - spinning side band пики. он равен половине периода вращения. Таким образом, необходимо вращать образец как можно медленнее, но так, чтобы спектральное разрешение и отношение сигнала к шуму не были слишком низкими. В качестве оптимума скорость вращения была выбрана 2 кГц для барстара (15N) и 3 кГц для полиглицина (,3С). Наложение ssb пиков и линий спектра, соответствующих азотам боковых цепей, в данном случае роли не Следует отметить, что мы также пробовали провести обменные эксперименты на карбонильных углеродах основной цепи барстара. Но сигнал от ядер 13С естественного содержания был намного меньше сигнала от ядер l5N, и потому требовал очень большого времени накопления для регистрации подробных зависимостей амплитуды линии от времени смешивания. Поэтому мы ограничились экспериментами только на ядрах 15N. На Рис. 3.33 представлены типичные обменные (зависимость от времени смешивания в обменном эксперименте) и спин-решеточные релаксационные спады на ядрах 15N и 13С соответственно в барстаре и глицине. Простое визуальное сравнение этих спадов показывает, что в обоих образцах существуют обменные процессы с характерным временем короче, чем Ти Для того, чтобы исключить влияние спин-решеточной релаксации на наблюдаемый обменный процесс, обменные спады для каждого образца при каждой температуре нормализовались на спады спин решеточной релаксации, то есть и 3.35 представлены нормализованные обменные спады для сухого и увлажненного барстара при различных температурах. На Рис. 3.36 представлены аналогичные обменные спады для полиглицина. Из этих рисунков видно, что за исключением увлажненного барстара при высоких температурах обменные спады не проявляют никакой температурной зависимости.
Это говорит о том, что наблюдаемый обменный процесс является не чем иным, как спиновой диффузией. эксперимента мы воспользуемся математическим формализмом, изложенным в первой главе. В общем случае зависимость интенсивности линии от времени смешивания для эксперимента tr-ODESSA определяется ур-ем (1.45). Для простейшего случая обмена (будь то спиновый обмен или реориентация тензора АХС) между двумя равновероятными положениями обменная матрица К, (см. ур-е 1.9), имеет вид: к = Рисунок 3.37. Схема спинового обмена между двумя магнитными ядрами, которые, в свою очередь, участвуют в молекулярном движении -скачках между двумя равновероятными положениями. ур-ю (1.41) (нижний индекс «О» соответствует центральному пику). Теперь рассмотрим более сложный случай, когда два магнитных ядра участвуют в молекулярном движении и в то же время между этими ядрами происходит спиновый обмен. Схема такого обмена представлена на Рис. 3.37. Два магнитных ядра участвуют в скачках между двумя равновероятными ориентациями - для одного ядра между ориентациями 1 и 2, а для другого ядра - между ориентациями 3 и 4. Для простоты полагается, что параметры молекулярного движения для двух ядер одинаковы. В то же время между двумя ядрами происходит процесс спинового обмена. Сеть обменных процессов между четырьмя положениями обозначена на Рис. 3.37 стрелками. Скорость молекулярной реориентации обозначена как кмк, а спинового обмена - ks . Обменная матрица для такой системы выглядит следующим образом: обменный спад состоит из двух компонент, характерное время одной из них определяется только скоростью спиновой диффузии, а другой - суммой скоростей спиновой диффузии и молекулярной реориентации. Из ур-я (3.26) видно, что молекулярное движение может быть зарегистрировано только если оно быстрее, чем скорость спиновой диффузии, то есть если kMR ksE- В противном случае молекулярное движение в принципе не может быть обнаружено с помощью обменного эксперимента. Хотя ур-е (3.26) описывает упрощенную схему (Рис. 3.37), оно наглядно объясняет, почему в увлажненном барстаре при высоких температурах форма обменного спада зависит от температуры, а при низких - нет (Рис. 3.34): при высоких температурах соблюдается неравенство кмя к5Е, в то время как при низких температурах скорость молекулярной реориентации ниже, чем скорость спиновой диффузии (напомним, что скорость спиновой диффузии от температуры не зависит). Отдельного рассмотрения заслуживает природа обменного спада, которая наблюдалась на карбонильных углеродах в полиглицине (Рис. 3.36). Поскольку форма этого спада не проявляет температурной зависимости, наблюдаемый в полиглицине обменный процесс был первоначально отнесен нами также к спиновой диффузии между ядрами С [124]. Однако сейчас мы можем утверждать что это не совсем так. Естественное содержание ядер 13С - немногим более одного процента и среднее расстояние между этими ядрами в полипептиде достаточно большое. Скорость спиновой диффузии имеет очень сильную зависимость от расстояния между ядрами и потому в этом случае она может проявляться только при временах смешивания порядка долей и единиц секунд. Что же касается более коротких времен, то там обменный спад объясняется наличием дипольного взаимодействия углеродов с ковалентно связанными ядрами 14N, находящимися в пептидной связи. Это взаимодействие может модулировать резонансную частоту так же, как и реориентация тензора АХС. А характерное время этой модуляции определяется скоростью перескока спина ядер 14N с одного зеемановского уровня на другой, то есть скоростью спин-решеточной релаксации. Поскольку ядра N - квадрупольные, их время релаксации Т\ достаточно короткое, оно имеет величину порядка единиц и десятков миллисекунд. Это так называемый RIDER-эффект (Relaxation-Induced Dipolar Exchange with Recoupling) [130,131], упоминавшийся в первой главе. Следовательно, динамика полипептидной цепи может исследоваться с помощью обменных экспериментов на карбонильных и альфа-углеродах только в 15N-обогащенных образцах (эти ядра имеют очень длинное Т\). В противном случае,
