Пространственное строение и внутримолекулярная подвижность некоторых биологически активных веществ (производные пиридоксина, статины) по данным методов ямр спектроскопии Рахматуллин Ильфат Зуфарович

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Методы исследования 12

1.1 Динамическая ЯМР спектроскопия 12

1.2 NOESY эксперимент 26

1.3 Определение межпротонных расстояний 32

1.4 DOSY эксперимент 38

ГЛАВА 2. Объекты исследования 39

2.1 Производные витамина В6 39

2.2 Статины 41

ГЛАВА 3. Изучение конформационной структуры производных пиридоксина 47

3.1 Обзор конформационной структуры циклических систем, изученных ранее методом ЯМР

3.2 Исследование производных пиридоксина методом динамической ЯМР спектроскопии 58

3.2.1 Ацетали: незамещенное соединение, метильный заместитель, изопропильный заместитель, третбутильный заместитель 59

3.2.2 Кетали: диметильный и метил-пентильный заместитель 80

ГЛАВА 4. Исследование пространственного строения комплексов правастатина и симвастатина с моделями биологической мембраны 93

4.1 Правастатин 94

4.2 Симвастатин 105

Выводы 114

Список публикаций автора 116

Список литературы

• NOESY эксперимент
• DOSY эксперимент
• Статины
• Ацетали: незамещенное соединение, метильный заместитель, изопропильный заместитель, третбутильный заместитель

Введение к работе

Актуальность темы. Важнейшим этапом исследований в области
физики конденсированного состояния, химической и биологической физике
является определение трехмерной структуры органических и биоорганических
соединений. Изучение пространственного строения органических соединений в
растворах основано как на использовании данных одномерной спектроскопии
ЯМР (¹Н, ¹³С), включая динамический ЯМР, так и на использовании двумерной
спектроскопии ЯМР NOESY (¹Н-¹Н) (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY). С
помощью динамического ЯМР, включающего в себя анализ температурных
изменений спектральных параметров и формы линии сигналов ЯМР, можно
получать информацию о константах равновесия и константах скорости
переходов между различными устойчивыми состояниями структурно
нежестких молекул. Спектроскопия ЯМР NOESY (¹Н-¹Н) позволяет
регистрировать эффекты Оверхаузера между ядрами и определять расстояния
между ними в молекуле. В целом, современные ЯМР методы исследования
позволяют получить уникальную информацию о конформационных свойствах,
конформационной динамике молекул и пространственном строении

молекулярных комплексов исследуемых объектов, а также они позволяют вплотную подойти к выявлению закономерностей типа «структура – биологическая активность».

Производные пиридоксина и статины являются важными

биоорганическими соединениями, необходимые для кроветворных процессов у человека. Пиридоксин принимает участие в производстве кровяных клеток (эритроцитов) и содержащегося в них красящего пигмента – гемоглобина, а также способствует равномерному снабжению клеток глюкозой [1]. Статины, основной функцией которых является снижение концентрации холестерина в крови [2], в последнее время привлекают внимание своими плейотропными (липиднезависимыми) действиями [3]. Еще одно важное обстоятельство, объединяющее исследуемые вещества, связано с мишенью действия статинов – холестерином, поскольку его структура похожа на структуру витаминов.

В настоящее время в Казанском федеральном университете активно
ведутся исследования, посвященные созданию новых лекарственных
соединений, в частности, на основе производных пиридоксина и изучению
биологических свойств уже известных препаратов (статинов). Неотъемлемой
частью этих работ является изучение механизмов взаимодействия

лекарственных препаратов с их биологическими мишенями, что невозможно без информации о пространственной структуре исследуемых соединений и их конформационном составе. Данная работа является составной частью этих исследований по созданию новых лекарственных препаратов.

Целью диссертационной работы являлось изучение пространственного строения и внутримолекулярной подвижности производных пиридоксина и молекулярных комплексов: статины - модели клеточной мембраны. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Определение основных конформаций производных пиридоксина в растворах органических растворителей в широком диапазоне температур (173 К – 293 К) методами одно- и двумерной спектроскопии ЯМР.

2. Определение термодинамических параметров, характеризующих как конформационное равновесие (разность свободных энергий G₀), так и переходы между конформерами (свободная энергия G активации) в производных пиридоксина методом динамического ЯМР.

3. Исследование комплексообразования статинов с мицеллами и бицеллами на основе поверхностно-активных веществ и установление пространственного строения молекулярных комплексов: статины -модели клеточной мембраны в растворе методами одно- и двумерной спектроскопии ЯМР.

В качестве объектов исследования были выбраны ранее не изученные
производные пиридоксина: 9-(2,4-динитрофенилокси)-8-метил-1,5-дигидро-
[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин (I), 9-(2,4-динитрофенилокси)-3,8-диметил-1,5-
дигидро-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин (II), 9-(2,4-динитрофенилокси)-3-
(изопропил)-8-метил-1,5-дигидро-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин (III), 9-(2,4-
динитрофенилокси)-3-(третбутил)-8-метил-1,5-дигидро-[1,3]диоксепино[5,6-
с]пиридин (IV), 9-(2,4-динитрофенилокси)-3,3,8-триметил-1,5-дигидро-
[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин (V), 9-(2,4-динитрофенилокси)-3,8-диметил-3-
пентил-1,5-дигидро-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин (VI), а также лекарственные
препараты: правастатин (VII) и симвастатин (VIII) (рис. 1). В качестве моделей
заряженной поверхности биологической мембраны в работе были
использованы мицеллы на основе додецилсульфата натрия (ДСН) и бицеллы на
основе смеси димиристоил фосфатидилхолина (ДМФХ) и дигексаноил
фосфатидилглицерола (ДГФГ).

Методы исследования. При решении поставленных задач были
использованы методы спектроскопии ЯМР высокого разрешения: одномерная
ЯМР спектроскопия на ядрах ¹Н и ¹³С, динамическая ЯМР спектроскопия на
ядрах ¹Н, двумерные гомоядерные и гетероядерные корреляционные ЯМР
эксперименты (COSY, HSQC, HMBC), двумерная ЯМР NOESY спектроскопия.
Эксперименты проводились с использованием ЯМР спектрометра «AVANCE
II-500» фирмы «Bruker» (рабочие частоты: 500 МГц на ядрах ¹Н и 125 МГц на
ядрах ¹³С). Квантово-химические расчеты относительных энергий

предполагаемых (наиболее вероятных) конформаций в производных

пиридоксина выполнялись в компьютерной программе HyperChem (ab initio, базис STO-3G), анализ полной формы линии – WinDNMR-Pro 7.1.14, математическая обработка экспериментальных данных – Origin Pro 7.5, моделирование пространственной структуры статинов методами молекулярной механики – ChemBio3D Ultra 12.0.

Рис. 1. Структурные формулы объектов исследования: производные пиридоксина (I-VI), правастатин (VII), симвастатин (VIII).

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах. Научная новизна:

4. Впервые для ряда ранее не изученных производных пиридоксина определена структура компонентов конформационного обмена в растворе и проведен анализ спектров ЯМР (химические сдвиги, константы спин-спинового взаимодействия).

5. Определены термодинамические параметры заторможенного вращения динитрофенильного фрагмента вокруг связи «пиридин-кислород» и конформационного обмена кресло-твист и твист-твист семичленного цикла в производных пиридоксина.

6. Впервые наблюдалось комплексообразование статинов с мицеллами и бицеллами на основе поверхностно-активных веществ и установлено пространственное строение молекулярных комплексов статины -модели клеточной мембраны в растворе методом двумерной ЯМР NOESY (¹Н-¹Н) спектроскопии.

Обоснованность и достоверность результатов подтверждается: согласием с результатами структурных исследований данного класса соединений, полученными с помощью других физических методов (рентгеноструктурный анализ), отсутствием противоречия с механизмами взаимодействия, присущими родственным биологическим системам, согласием с результатами квантово-механических расчетов энергетических барьеров, а

также использованием современного ЯМР оборудования и программного обеспечения ЯМР экспериментов.

Научная и практическая ценность:

7. Спектральные ЯМР характеристики, конформации компонентов обмена и активационные параметры, характеризующие конформационный обмен в производных пиридоксина могут быть использованы при исследовании более сложных соединений, содержащих схожие структурные фрагменты.

8. Информация о конформациях производных пиридоксина может быть использована при исследованиях связи «структура – биологическая активность» данного типа соединений.

9. Знание механизмов взаимодействия правастатина и симвастатина с моделями клеточной мембраны может способствовать более глубокому пониманию биологического действия гиполипидемических препаратов, и последующего их усовершенствования.

Личный вклад автора.

10. Участие в постановке цели и задач исследования.

11. Проведение ЯМР экспериментов, обработка, анализ и интерпретация полученных экспериментальных результатов.

12. Написание статей.

Апробация работы. Основные результаты докладывались и обсуждались
на следующих научных школах и конференциях: международный симпозиум
«Биохимия – основа наук о жизни» (г. Казань, 2013); республиканский конкурс
научных работ среди обучающихся на соискание премии им. Н.И.Лобачевского
(г. Казань, 2014); XXI всероссийская конференция «Структура и динамика
молекулярных систем, Яльчик-2014» (г. Йошкар-Ола, 2014); XVII

международная молодежная научная школа «Актуальные проблемы

магнитного резонанса и его приложений» (г. Казань, 2014); 11-ая зимняя молодежная школа-конференция Spinus «Магнитный резонанс и его приложения» (г. Санкт-Петербург, 2014); итоговая конференция института физики Казанского (Приволжского) федерального университета (г. Казань, 2015), VI всероссийская конференция «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (г. Казань, 2015).

Диссертационная работа выполнена в научной лаборатории ЯМР спектроскопии Института физики Казанского (Приволжского) федерального университета. Работа на отдельных этапах поддерживалась грантами Министерства образования и науки РФ (16.552.11.7083; К(П)ФУ, 2.2792.2011), а также средствами субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

Изучаемые в работе соединения производных пиридоксина

синтезированы в лаборатории отдела медицинской химии НОЦ фармацевтики К(П)ФУ под руководством к.х.н., доцента Штырлина Ю.Г. Соединения

правастатина и симвастатина, также как и ДСН, ДМФХ, ДГФГ были приобретены в компании «Sigma-Aldrich».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 статьи в рецензируемых изданиях, 8 – тезисы докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка публикаций автора, списка литературы из 112 наименований. Работа изложена на 130 страницах, содержит 57 рисунков и 16 таблиц.

NOESY эксперимент

Основы метода динамического ЯМР достаточно полно изложены в многочисленных работах, ключевыми из которых в контексте данной работы являются [5,6]. Анализу результатов исследований многочисленных разновидностей процессов внутри - и межмолекулярного обмена посвящен ряд обзоров. Полную информацию об этой области исследования можно найти в [7,8].

В жидкостях и растворах веществ, которые и являются основными обьектами исследования методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения, имеют место быстрые поступательные и вращательные движения молекул. В таких “изотропных” системах любое направление осей молекулярной системы координат, связанной с главными осями тензора инерции молекулы, равновероятно в пространстве, и переориентация системы координат происходит значительно быстрее характеристического времени ЯМР (времени релаксации Т2). Это приводит к тому, что средние значения энергий внутримолекулярного диполь-дипольного и квадрупольного взаимодействий равны нулю. Межмолекулярные взаимодействия также усредняются до нуля из-за быстрого поступательного движения молекул. В результате такой подвижности спектры ЯМР жидкостей определяются, в основном, тремя гамильтонианами: где у - гиромагнитное отношение, о- константа экранирования, В0 - индукция постоянного внешнего магнитного поля, I - операторы ядерного спина, J - константа спин-спинового взаимодействия.

Органические молекулы в растворах могут обладать большой степенью внутримолекулярной подвижности. Например, молекулярные фрагменты могут вращаться вокруг одинарных или частично двойных химических связей, а в циклических молекулах это происходит с деформацией валентных углов. Это -т.н. конформационные превращения - переходы между различными состояниями (конформациями) с преодолением потенциального барьера. Вероятность нахождения молекулы в каждом из конформационных состояний определяется энергией молекулы в этом состоянии. В каждой из конформаций тензор химического сдвига имеет свое значение, а его эффективное значение, которое определяет наблюдаемый в спектре ЯМР химический сдвиг, есть среднее по всем конформациям с учетом их вероятности.

В простейших моделях обычно выделяют несколько устойчивых конформаций, а остальные - промежуточные - не учитывают.

Форма и ширина спектра ЯМР чувствительна к процессам, константа скорости протекания которых имеет тот же порядок величины, что и ширина спектра, измеренная в единицах частоты. Если эта скорость меньше указанной величины для соответствующего процесса, то спектр будет состоять из отдельных частей, отвечающих разным ядрам или различному окружению. При больших скоростях процесса вид спектра определяется усредненным во времени окружением исследуемого ядра. Поэтому ЯМР-спектроскопия является весьма эффективным методом исследования различных молекулярных превращений, которые называют процессами химического обмена.

Известно, что взаимодействия ядер, зависящие от времени вследствие хаотического движения молекул в жидкостях, например диполь-дипольные или квадрупольные, влияют на форму и ширину спектральной линии. Другие типы движения, при которых происходит межмолекулярный обмен с изменением порядка связей в молекуле (валентная таутомерия), образование и распад молекулярных ассоциаций и т. д. также вызывают изменения в спектрах ЯМР. Характерной особенностью этих форм движения является то, что ядро вследствие такого движения может изменять свое электронное окружение, а, следовательно, изменяется и константа электронного экранирования (ег) для этого ядра (позиционный обмен). В некоторых случаях могут изменяться и константы косвенного спин-спинового взаимодействия (J) движущегося ядра с другими ядрами молекулы. Например, в молекуле этилового спирта СН3-СН2-ОН протон гидроксильной группы -ОН принимает участие в обменном процессе с гидроксильными протонами других молекул спирта, а также с протонами молекул воды.

В простейших случаях химического обмена обычно рассматривают систему, в которой происходит обмен между двумя магнитно неэквивалентными состояниями А и В ядра, в которых ядро имеет разные резонансные частоты СОА и сов, обусловленные разным электронным окружением, а следовательно, и разными константами экранирования (аА и ав). Полагается также, что косвенное спин-спиновое взаимодействие между ядрами отсутствует (JAB=0). В случае отсутствия переходов из одного состояния в другое можно считать, что вещество содержит две независимые системы ядерных спинов А и В, каждая из которых описывается уравнениями Блоха. Если переменное поле В\ не очень велико, то намагниченность (М) незначительно отличается от своего равновесного значения М0, при этом уравнения для перпендикулярных компонент намагниченности во вращающейся системе координат и и и принимают вид где Т2 - время поперечной релаксации, - разность резонансных частот, -гиромагнитное отношение, В\ - переменное радиочастотное поле, Мо -равновесная намагниченность.

DOSY эксперимент

Многие молекулы органических соединений не являются структурно- или стереохимически жесткими молекулами. Поэтому, обсуждение их свойств не может считаться строгим, если в них не установлены основные закономерности молекулярных превращений, называемых обычно процессами химического обмена. В качестве примера можно привести органические производные элементов V и VI групп, в которых могут протекать в различных сочетаниях основные процессы химического обмена [5].

Уникальность метода ЯМР заключается в возможности изучения реакций, не проявляющихся в макроскопическом процессе, процессов химического обмена, в ходе которых молекула переходит как бы “сама в себя”. Эти взаимопревращения являются вырожденными, а следовательно, ненаблюдаемыми для тех методов, в которых отдельные атомные центры молекулы не могут быть различены, и доступны для изучения только методами магнитного резонанса.

Стереохимические или структурно нежесткие молекулы – это класс таких молекул, в которых имеют место обратимые переходы между состояниями с минимумами энергии с преодолением потенциального барьера (по классическому механизму благодаря тепловому движению и путем квантово-механического туннелирования). Во временную шкалу ЯМР попадают только процессы, инициируемые тепловым движением.

Большую часть известных процессов взаимопревращения изомеров можно разделить на 2 типа: 1) стереохимические превращения, в ходе которых происходит изменение внутримолекулярного окружения без разрыва химических связей; 2) внутримолекулярные таутомерные превращения, сопровождающееся разрывом одних и образованием других химических связей между атомами одной молекулы [74,75]. К первому типу процессов относятся следующие процессы: а) Конфигурационная инверсия, в которой происходит пространственная перегруппировка лигандов, окружающих центральный атом, без разрыва химической связи. б) Заторможенное (затрудненное) вращение – конформационное превращение ациклических молекул, осуществляемое путем поворота вокруг одинарных, двойных связей. в) Конформационное превращение циклических молекул (конверсия кольца), осуществляемое путем вращения отдельных связей (без их разрыва) и деформацией валентных углов. Предназначение метода анализа формы линии (АФЛ) ЯМР в кинетическом эксперименте – установление схемы химического обмена, что предполагает оценку активационных и кинетических параметров.

В разделе 1.1 было показано, что форма линии ЯМР в общем случае (уравнение 1.14) содержит три параметра, характеризующие динамическую систему (систему с химическим обменом), два из которых входят явно: это относительные населенности позиций Pr и константы переходов между ними krs. Третий параметр, присутствующий в неявном виде, это варианты или схемы обмена, поскольку для каждой схемы варьируются переменные krs и Pr. Рассмотрим те случаи химического обмена, когда может быть получено строгое решение динамической задачи:

Система имеет два устойчивых положения равновесия, относительные заселенности либо равны (взаимный обмен), либо не равны (но прогнозируемы); число переходов между ядерными спиновыми уровнями, испытывающими влияние обмена, равно двум (двухпозиционный обмен). Варьируется один динамический параметр – константа скорости. 2. Система характеризуется тремя и более устойчивыми положениями равновесия, относительные заселенности которых одинаковы, и обмен описывается только одной константой к (многопозиционный вырожденный обмен).

Многопозиционный обмен - характеризуется набором взаимонезависимых констант скорости. Наиболее типичный пример многоскоростного обмена, описываемого независимыми константами скорости kj, к2, к3 - заторможенное вращение в молекулах с тремя и более минимумами на поверхностной потенциальной энергии и конформационные превращения в циклических молекулах. Здесь формально процесс один, но при АФЛ необходимо учитывать различные константы скорости переходов между положениями равновесия.

Первые два вида обмена можно объединить в один тип - простой позиционный обмен, приняв за основу количество варьируемых констант скорости при АФЛ.

В тех случаях, когда процессы разделены широким температурным диапазоном, можно провести раздельное описание процессов.

В том случае, когда обменные процессы разделены малым температурным диапазоном (20-30 К), нахождение кинетических параметров в значительной мере усложняется вследствие неоднозначности в определении констант скорости этих процессов. Различные наборы krs при расчете многопозиционного обмена неизбежно приведут к одинаковой форме линии ЯМР в области быстрого обмена (Т Тс) и иногда могут привести к таковым и в области медленного обмена. Если спектры компонентов обмена достаточно далеко разнесены по шкале химических сдвигов, то в отдельных случаях, когда область медленного обмена захватывает достаточно широкий температурный интервал, можно надеяться на корректное определение кинетических параметров сложного обмена на основе АФЛ ЯМР.

Статины

Сигналы от группы CH2-4 наблюдаются как хорошо разрешенный AB-квадруплет в спектре при комнатной температуре, а сигналы от группы CH2-7 уширены (рисунок 3.14б). Уширение сигналов СН2-7, СН-19, СН-20 и СН-2 в 1H ЯМР спектре при комнатной температуре происходит за счет замедления процесса конформационного обмена. Для того чтобы ускорить этот процесс были зарегистрированы спектры при температурах выше комнатной.

С увеличением температуры, сигналы СН2-7 сужаются и при Т=323 K они резонируют в виде хорошо разрешенного AB-квадруплета (рисунок 3.14в). Кроме того, сужение формы линии остальных сигналов CH-19, CH-20 и CH-2 приводит к их расщеплению.

Таким образом, из экспериментов следует, что исследуемое соединение принимает участие в нескольких конформационных обменных процессах. Показано, что форма линии ЯМР сигналов сильно меняется с вариацией температуры (рисунок 3.14a). Сигналы СН2-4 и СН2-7 сперва уширяются, затем наблюдается их коалесценция и при Т = 203 K они начинают резонировать в форме четырех AB-квадруплетов. Другие сигналы имеют сходную эволюцию формы линии, за исключением последней стадии, когда наблюдается их удвоение за счет второго конформера с более слабой интенсивностью.

Анализ интегральных интенсивностей сигналов различных конформаций, показывает, что они соотносятся в растворе в пропорции 1.00 : 1.66. Неэквивалентность протонов CH2-4 AB-системы незначительна и константы спин-спинового взаимодействия (J) принимают близкие значения для сигналов обеих конформаций. Это характерно для конформаций, имеющих плоскость симметрии (Сs). Поэтому, основываясь на результатах предыдущих работ [80,81], можно сделать вывод, что семичленный цикл соединения IV представлен в растворе в конформации кресло. Результаты рассчитанных параметров энергии активации конформационного обмена приведены в таблице 3.5.

Исследуемые соединения состоят из семичленного ацетального кольца с 2,4-динитрофенильным орто-заместителем. Следовательно, существует два конформационных процесса, которые могут быть определены методом динамической ЯМР спектроскопии (рисунок 3.15). Первый процесс – вращение вокруг связи «пиридин-кислород». Второй процесс – динамическое равновесие между кресло и твист конформациями семичленного ацетального кольца.

Конформационные переходы 9-(2,4-динитрофенилокси)-3,8-диметил-1,5-дигидро-[1,3]диоксепино[5,6-с] пиридина (II). Конформации:а) RRaM-твист; б) RSaM-твист; в) RRa-кресло; г) RSa-кресло; д) RRaP-твист; е) RSaP-твист. В результате имеется восемь возможных конформаций для соединения I (Ra/Sa ориентации эфирного остатка, P/M твист конформации и P/M кресло конформации), которые приводят к четырем парам энантиомеров – Ra,P-твист/SaM-твист; Sa,P–твист/Ra,M-твист; Ra,P-кресло/Sa,M-кресло и Sa,P– кресло/Ra,M-кресло. Появление хирального атома в соединениях II-IV приводит к следующим шести парам энантиомеров (в этом случае разрешена только одна кресло конформация, которая зависит от конфигурации хирального атома): R,Ra,P-твист/S,Sa,M-твист; R,Sa,P–твист/S,Ra,M-твист; S,Ra,P-твист/R,Sa,M-твист; S,Sa,P–твист/R,Ra,M-твист; R,Ra-кресло/S,Sa-кресло; R,Sa-кресло/S,Ra-кресло.

Из литературы известно, что конформационное равновесие кресло-твист зависит от пространственного объема заместителя при ацетальном атоме углерода [82], и соединения с «громоздким» заместителем, такие как трет-бутильное, имеют кресло форму цикла. Однако, в случае «малых» заместителей, таких как метильный или изопропильный, доля твист конформации в цикле увеличивается [83].

Как видно из таблицы 3.5, энергетические барьеры конформационного обмена для исследуемых соединений близки между собой и к справочному значению вращательного барьера динитрофенильного фрагмента вокруг C-O связи [8]. Таблица 3.5. Активационные параметры вращения динитрофенильного фрагмента вокруг C-O связи для соединений I-IV. G0 – разности свободных энергий двух конформеров вращения. Все значения приведены для растворителя ацетон-d6. Этот факт и отношение результирующих конформеров, означают, что видимый в спектре процесс – вращение вокруг связи «пиридин-кислород», в то время как конформации кресло и твист участвуют в быстром обмене, и не могут быть отслежены просто по анализу формы линии.

Эффект второго процесса можно заметить на ЯМР спектре при температурах от 257 K до 203 K. Здесь, эволюция формы линии сигналов несущественна. Однако, в данном случае, происходит изменение таких спектральных параметров, как химический сдвиг () и неэквивалентность () сигналов геминальных протонов CH2-4, соответствующих AB-системе (рисунок 3.16). Рисунок 3.16. Фрагменты 1H ЯМР спектра соединения II, растворенного в ацетоне-ёб при температурах 203 K (a), 233 K (б), 248 K (в) и соответствующие неэквивалентности () сигналов CНг-4. Пунктирные линии приведены для удобства отслеживания малых изменений неэквивалентностей. По-видимому, это явление объясняется существованием в растворе соединений II и III некоторой доли конформации твист, как это было описано в [82,83].

ЯМР спектр быстро-обменивающихся конформеров одного соединения содержит информацию о спектральных характеристиках каждого из конформеров и их населенности в растворе. При определенной температуре, есть возможность измерить статистический усредненный параметр у (где у может представлять химический сдвиг , неэквивалентность или константу спин-спинового взаимодействия J). Соотношение между усредненным параметром у и спектральными характеристиками каждого индивидуального конформера описывается согласно уравнению [84]: і где Pi – доля каждой из конформаций в растворе. Операция суммирования выполняется по всем возможным равновесным состояниям.

В случае двустороннего обмена: P1+P2 = 1. Семичленная циклическая часть рассматриваемых соединений может быть представлена в растворе в двух равновесных состояниях: кресло и твист с соответствующими долями Pк и Pт. В качестве параметра y рассматривается неэквивалентность сигналов геминальных протонов CH2-4. Зависимость от температуры для соединений II, III и IV показана на рисунке 3.17.

Как видно из рисунка 3.17, температурные изменения не оказывают влияния на значение неэквивалентности от протонов сигнала CH2-4 соединения IV. Следовательно, это подтверждает «жесткую» кресло конформацию его семичленного цикла. Напротив, от того же самого сигнала соединений II и III сильно зависят от температуры, означая изменение в конформационном равновесии между формами кресло и твист.

Для того, чтобы подтвердить эти предположения с использованием программного обеспечения HyperChem 8 были выполнены рассчеты ab initio ST03G относительных энергий основных конформаций для рассматриваемых соединений I-IV (таблица 3.6). Расчеты проводились в модели изолированной системы из-за небольшого влияния растворителя на равновесие кресла и твист форм. Различия в соотношении кресла конформации 2-К-1,3-диоксациклогепт-5-енов (R = Н, СН3, СН(СН3)2, С(СН3)3), растворенных в диоксане и в ацетоне были 1% или менее. Доля каждого из конформеров вычислялась согласно уравнению:

Ацетали: незамещенное соединение, метильный заместитель, изопропильный заместитель, третбутильный заместитель

Как видно из таблицы, имеются некоторые различия в расстояниях для похожих групп правастатина, которые зависят, видимо, от вида модельной мембраны: CH-4...CH-6 (2.79 в бицеллах и 2.35 в мицеллах), CH-1...CH-3 (3.25 в бицеллах и 2.68 в мицеллах). Эти изменения могут быть объяснены переориентацией соответствующих протонов относительно цикла и относительно друг друга.

Алифатические хвосты C-1 - C-4 и C-11 - C-17 сближаются друг к другу вследствие дополнительного взаимодействия с поверхностью мембранных миметиков. Это подтверждается наблюдением межмолекулярного ЯЭО: CH-1/CH2-12ДСН и CH-2 /CH2-12ДСН в растворе D2O+ДСН и CH-13/CH2-,ДМФХ,CH2- ДГФГ в растворе D2O+ДМФХ/ДГФГ. Более того, между протонами алифатических цепей правастатина в присутствии мицеллы в 2D NOESY спектре наблюдается больше кросс-пиков, чем в том же спектре без мицелл. Таким образом, мы заключили, что взаимодействие правастатина с поверхностью модельной мембраны происходит посредством его гибких частей: частично отрицательно заряженные кислородные атомы взаимодействуют с ионом Na+ и с полярными “головочными” группами ДСН и ДМФХ/ДГФГ.

Второе важное соединение из этой серии – симвастатин, исследование которого проводилось по аналогии с вышеописанным исследованием правастатина. Известно, что симвастатин имеет низкую растворимость в воде. Поэтому начальные исследования симвастатина проводились в растворе DMSO.

Химическая структура симвастатина (рисунок 4.1б) была подтверждена 1D 1Н и 13С и 2D экспериментами ЯМР. Сигналы в спектре ЯМР 1Н (рисунок 4.11) были отнесены при помощи таких 2D спектров, как 1H-1H COSY (рисунок 4.12), 1H-13C HSQC и 1H-13C HMBC. Все химические сдвиги приведены в таблице 4.3а. соответственно (рисунок 4.11). Протоны групп СН-11, 10, 17 резонируют в области слабых полей при 5.94, 5.78, 5.48 м.д., соответственно. Сигналы протонов, близких к электроотрицательным атомам кислорода, СН-26, 14, 5 и 3 также хорошо разрешены в спектре в области слабых полей. Остальные сигналы, принадлежащие группам СН и СН2, с незначительным перекрыванием расположены в области химических сдвигов 1.10-2.70 м.д. Для того, чтобы определить конформационную структуру молекулы симвастатина в растворе ДМСО были выполнены 2D NOESY спектры ЯМР при различных временах смешивания (рисунок 4.13). двух алифатических частей молекулы симвастатина. Схематическая пространственная структура молекулы симвастатина представлена на рисунке 4.14. Рисунок 4.14. Схематическое представление пространственной структуры симвастатина и наблюдаемых эффектов ЯЭО (пунктирные линии). В ходе исследования правастатина с модельными мембранами (ДСН и ДМФХ/ДГФГ) не было выявлено сильных различий механизма комплексообразования от типа мембранного миметика. Поэтому, при исследовании взаимодействия симвастатина с модельными мембранами мы ограничились одним типом – мицеллами ДСН.

Добавление ДСН к D2O, благодаря явлению солюбилизации, приводит к возможности проводить эксперименты по изучению спектров ЯМР симвастатина в водном растворе. Явлению солюбилизации позволяет растворять вещества в водных мицеллярных растворах, которые не растворяются в обычной воде [109]. Это явление является прямым доказательством того, что симвастатин принимает участие в некотором дополнительном межмолекулярном взаимодействии с мицеллами ДСН в растворе D2O.

ЯМР 1Н спектр симвастатина, растворенного в D2O с мицеллами ДСН, показан на рисунке 4.15. Сигналы в ЯМР 1Н спектре были отнесены с использованием 2D ЯМР спектров. Химические сдвиги приведены в таблице 4.3.

Форма линии сигнала CH2-4 сильно изменяется: от одного мультиплета в растворе ДМСО (рисунок 4.11) к двум мультиплетам в растворе ДСН+D2O (рисунок 4.15). Это означает, что протоны группы CH2-4 становятся неэквивалентны за счет дополнительного межмолекулярного взаимодействия с мембранным миметиком.

В этих спектрах наблюдаются кросс-пики между CH-3, CH2-4 группами симвастатина и “хвостовыми” протонами ДСН (рисунок 4.7в). Также в NOESY спектре имеются кросс-пики между алифатическими цепочками молекулы симвастатина, как в растворе ДМСО. Рассчитанные межпротонные расстояния в системах симвастатин+ДМСО и симвастатин+ДСН+D2O представлены в таблице 4.4.

Исходя из данных ЯМР NOESY, мы заключили, что симвастатин располагается внутри мицеллы (рисунок 4.17б). Этот вывод не противоречит работе [66], где также отмечается, что молекула симвастатина может встраиваться к внутреннему углеводородному ядру липидного бислоя мембраны, примыкая к основной цепи глицерола. Таким образом, мицеллы ДСН могут быть использованы как модель мембраны для исследования механизмов взаимодействия между симвастатином и клеточной мембраной.