Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Понятие стволовой клетки и клетки-предшественника
1.1.1. Биология мультипотентных мезенхимальных стромальных
клеток (ММСК) 12
1.2. Фенотипические и функциональные свойства ММСК
1.2.1. Морфологические особенности и характеристика роста ММСК
в культуре 17
Особенности иммунофенотипа и аутокринные факторы, вырабатываемые ММСК 20
Дифференцировочный потенциал ММСК 27
1.3. Возможные механизмы реализации влияния
гравитационного фактора на уровне клетки 41
1.3.1. Остеобластический клеточный фенотип в условиях микрогравитации 44
1.3.1.1. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на
культивируемые клетки остеобластического фенотипа и остеогенные
клетки-предшественники 49
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 56
2.1. Культуры клеток
Химические реактивы, культуральные среды, посуда 56
Культивирование мезенхимальных стромальных клеток,
выделенных из костного мозга человека 57
2.1.3. Криоконсервация ММСК костного мозга человека 57
2.2. Исследование свойств культур ММСК человека и дифференцированных
производных ММСК в условиях моделирования эффектов
микрогравитации с помощью различных систем
2.2.1. Схема эксперимента и экспериментальные группы 58
2.2.2. Индукция и детекция остеогенной дифференцировки ММСК
костного мозга человека 59
Рост клеток 60
Определение активности щелочной фосфатазы 60
Иммуноцитохимическое выявление коллагена I типа 61
Гистохимическая идентификация кальциевых депозитов 61
Исследование иммунофенотипа МСК и остеогенных производных
с помощью проточной цитофлюориметрии. Определение экспрессии
мембранной формы щелочной фосфатазы 62
Исследование количественного содержания цитокинов в среде культивирования 64
Индукция и детекция адипогенной дифференцировки ММСК костного мозга человека 65
2.2.9.1. Выявление липидных капель 66
2.3. Статистическая обработка данных 66
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 67
3.1. Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальные
клеток костного мозга человека (пролиферативная активность,
иммунофенотип, продукция интерлейкинов,
дифференцировочный потенциал) 67
3.2. Влияние клиностатирования на морфофункциональное состояние
ММСК и остеогенных производных ММСК костного мозга человека 75
3.2.1. Влияние клиностатирования на рост
клеток 75
Влияние клиностатирования на иммунофенотип клеток 81
Влияние клиностатирования на продукцию интерлейкинов 84
3.3. Влияние клиностатирования на остеогенный дифференцировочный
потенциал ММСК и остеогенных клеток-предшественников 87
Влияние клиностатирования на индуцированную активность щелочной фосфатазы 87
Органические и неорганические компоненты костного матрикса в культурах остеогенных производных ММСК при клиностатировании 90
3.4. Влияние клиностатирования на адипогенный
дифференцировочный потенциал ММСК 94
3.5. Морфофункциональное состояние ММСК и остеогенных производных
ММСК в условиях моделирования эффектов микрогравитации
с помощью RPM 98
Рост клеток при моделировании эффектов микрогравитации с помощью RPM 98
Иммунофенотип клеток при моделировании эффектов микрогравитации с помощью RPM 103
Продукция интерлейкина-8 при моделировании эффектов микрогравитации с помощью RPM 106
3.6. Остеогенный дифференцировочный потенциал ММСК и
остеогенных клеток-предшественников в условиях моделирования
эффектов микрогравитации с помощью RPM 109
3.6.1. Активность щелочной фосфатазы при моделировании эффектов
микрогравитации с помощью RPM 109
3.6.2. Органические и неорганические компоненты костного матрикса в
культурах остеогенных производных ММСК при моделировании
эффектов микрогравитации с помощью RPM 115
3.7. Адипогенный дифференцировочный потенциал ММСК и адипогенных
производных ММСК в условиях моделирования эффектов
микрогравитации с помощью RPM 123
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 127
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 155
ВЫВОДЫ 160
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 161
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 162
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ГСК Гемопоэтические Стволовые Клетки
ИЛ Интерлейкин
ММСК Мультипотентные Мезенхимальные Стромальные Клетки
КП космический полет
ЩФ Щелочная Фосфатаза
ФБД Фосфатно-Солевой Буфер Дальбекко
ЭСК Эмбриональные Стволовые Клетки
BMP Костный Морфогенетический Белок
CD Кластер Дифференцировки
FAK Киназа Фокальной Адгезии
FGF Фактор Роста Фибробластов
FITC Флюоресцин-изотиоционат
EGF Эпидермальный Фактор Роста
IGF Инсулиноподобный Фактор Роста
МАРК Митоген-Активируемые Протеинкиназы
МРР Матриксные Металлопротеиназы
N0 Оксид Азота
РЕ Фикоэритрин
PGE2 Простагландин Е2
PPAR)>2 Peroxisome Prohferator-Activated Receptor yl
Runx2 Runt-Related Transcription Factor 2
TGF Трансформирующий Фактор Роста
RPM Random Positioning Machine
RT комнатная температура
Введение к работе
В результате многолетних исследований было установлено, что космические полеты оказывают существенное влияние на функциональное состояние физиологических систем организма человека [Григорьев, Воложин, Ступаков, 1994; Газенко, Григорьев, Егоров, 1997; Оганов, 2003]. Уникальные условия и эффекты воздействия микрогравитации в космическом полете поставили ряд фундаментальных проблем, связанных с изучением роли гравитации и механических факторов в эволюции, биологии, росте и развитии скелетных тканей.
В ходе эволюции костная система наземных позвоночных формировалась в среде, где одним из главных и неизменно действующих факторов является гравитация, определившая морфогенез и строение населяющих сушу существ. Определенные отделы скелета участвуют в поддержании позы и совершении активных локомоций, постоянно испытывая статические и динамические нагрузки «под знаком преодоления влияния силы тяжести». С начала освоения человеком космического пространства вопрос о влиянии микрогравитации на костную систему приобрел особую значимость, поскольку при недостатке механической нагрузки (микрогравитация, гипокинезия, гиподинамия, иммобилизация) в результате сопутствующей адаптационной перестройки костной ткани ее масса может уменьшаться из-за уменьшения потока механических импульсов и опосредованных гравитацией деформаций как следствие нарушения сопряжения процессов костного ремоделирования [Ступаков, Воложин, 1989; Оганов, 2003; Yeh, Liu, Aloia, 1993; Marie, Jones, Vico et al., 2000; Loonier, 2001; Vico, Hinsenkamp, Jones et al., 2001].
Исследования, проведенные в условиях космического полета и в модельных экспериментах, неоспоримо свидетельствуют, что костная система не может неизменно функционировать в условиях гипогравитации и невесомости. Совокупность зарегистрированных физиологических изменений включает отрицательный баланс кальция и фосфора, общую потерю массы костной ткани, деминерализацию в костях, несущих осевую опорную нагрузку на Земле, увеличение содержания в крови и моче маркеров костной резорбции, и наконец, феномен гиперминерализации в сегментах верхней половины скелета, что рассматривается как вторичная реакция на перераспределение жидкостных сред в краниальном направлении [Ступаков, Воложин,
1989; Григорьев, Воложин, Ступаков, 1994; Газенко, Григорьев, Егоров, 1997; Оганов, 2003; Collet, Uebelhart, Vico et al., 1997; Caillot-Augusseau, Lafage-Proust, Vico et al., 1998; Vico, Hinsenkamp, Jones et al, 2001]. Остается открытым вопрос о том, как далеко может зайти процесс деминерализации при увеличении длительности полета и может ли быть он скомпенсирован на определенных этапах пребывания человека в условиях микрогравитации. Очевидно, что этот факт может существенно лимитировать продолжительность пребьшания человека в космическом пространстве из-за потенциального риска развития остеопороза и сопровождаться негативными последствиями при возвращении в условия земной гравитации. Тем не менее, клеточные механизмы наблюдаемых изменений до настоящего времени остаются не до конца ясными.
Работы, выполненные в течение ряда последних лет, убедительно продемонстрировали, в том числе, и чувствительность культивируемых клеток остеобластического фенотипа к гравитационному фактору [Guignandon, Vico, Alexandre, Lafage-Proust, 1995; Hughes-Fulford, Lewis, 1996; Carmeliet, Nys, Bouillon, 1997; Kumei, Shimokawa, Katano et al., 1998; Akiyama, Kanai, Hirano et al., 1999; Kacena, Todd, Landis, 2003; Hughes-Fulford, Rodenacker, Jutting, 2006; Kumei, Morita, Katano et al., 2006; Kumei, Shimokawa, Ohya et al., 2007]. Однако с увеличением количества экспериментальных данных перед исследователями встает новый вопрос: как может влиять микрогравитация или ее эффекты на различные аспекты функционирования менее зрелых форм, а именно на остеогенные клетки-предшественники и стволовые клетки.
В постнатальном развитии основным источником стволовых клеток является костный мозг, который в своем формировании и функционировании тесно связан с костной тканью [Чертков 1976; Fridenshtein, Gorskaya, Kulagina, 1976; Фриденштейн, Грошева, Горская,1981]. Кроветворная паренхима костного мозга и костномозговая строма генерируют две линии мультипотентных стволовых клеток, дифференцировки которых никогда не пересекаются. Среди многочисленных компонентов стромы костного мозга выделяют минорную популяцию клеток, которые вероятнее всего локализуются в периваскулярной области костного мозга, но отличаются от эндотелиальных и гладкомышечных клеточных элементов экспрессией некоторых поверхностных антигенов и способностью при определенных условиях дифференцироваться в клетки тканей мезенхимного происхождения, то есть обладают всеми характеристиками мультипотентных мезенхимальных стволовых/стромальных клеток (ММСК) [Bianco, Riminucci, Gronthos et al., 2001; Shi, Gronthos, 2003; Crisan,
Yap, Casteilla et al., 2008]. Впервые полученные из костного мозга грызунов в 70-х годах XX века А.Я. Фриденштейном с коллегами, позднее ММСК были обнаружены и выделены из костного мозга человека. Целый ряд исследований продемонстрировал, что in vitro ММСК способны дифференцироваться в клеточные элементы костной, хрящевой и жировой тканей, а также поддерживать и регулировать гемопоэз [Prockop, 1997; Pittenger, Mackay, Beck et al., 1999; Conget, Minguell, 1999; Muraglia, Cancedda, Quarto, 2000; Majumdar, Keane-Moore, Buyaner et al., 2003; McNiece, Harrington, Turney et al., 2004; Maitra, Szekely, Gjini et al., 2004; Wagner, Roderburg, Wein et al., 2007]. Интерес к ММСК непрерывно растет, однако все большее число работ ставит новые вопросы в отношении вовлеченности ММСК в процессы самовозобновления и самоподдержания соединительных тканей и особенностей функционирования этих клеток in vitro и in vivo.
Определение роли гравитационного фактора в морфофункциональном состоянии клеток-предшественников представляется важной, но не простой задачей. Механизмы влияния микрогравитации на клетку могут быть определены только в дорогостоящих космических исследованиях, временные рамки и методологические ї возможности которых чаще всего ограничены. В наземных условиях эффекты воздействия микрогравитации на клетку моделируют с помощью различных экспериментальных систем [Albrecht-Buehler, 1992; Moore, Cogoli, 1996; van Loon, 2007]. Тем не менее, исследования, посвященные изучению гравитационной чувствительности ММСК in vitro, крайне немногочисленны, затрагивают какие-либо отдельные характеристики клеток-предшественников, их результаты зачастую противоречивы, а временные экспозиции клеток в данных системах не превышают нескольких суток культивирования [Zayzafoon, Gainings, Mcdonald, 2004; Meyers, Zayzafoon, Gonda et al., 2004; Meyers, Zayzafoon, Douglas, McDonald, 2005; Buravkova, Merzlikina, Romanov, Buravkov, 2005; Yuge, Kajiume, Tahara et al., 2006; Dai, Wang, Ling et al., 2007]. Таким образом, дальнейшее комплексное исследование морфофункционального состояния и дифференцировочного потенциала ММСК в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации позволит приблизиться к более глубокому пониманию процессов, происходящих в ходе физиологического и патологического ремоделирования костной ткани, а также пролить свет на проблему механочувствительности стволовых клеток взрослого организма.
Цель работы; Изучение морфофункционального статуса и
дифференцировочного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека in vitro в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации с помощью различных экспериментальных установок.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие
задачи исследования:
Подобрать оптимальные условия культивирования и индукции дифференцировки ММСК в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации, создаваемых с помощью горизонтального клиностата и Random Positioning Machine (Устройство для рандомизации положения, RPM);
Исследовать влияние моделирования эффектов микрогравитации на начальные стадии роста ММСК в норме и при их коммитировании к остеогенезу;
Провести иммунофенотипическую характеристику ММСК и остеогенных ММСК-производных после длительной экспозиции в условиях моделирования эффектов микрогравитации;
Изучить продукцию некоторых интерлейкинов в культурах ММСК и остеогенных ММСК-производных при моделировании эффектов микрогравитации;
Проанализировать эффективность начальных и конечных этапов индуцированной остеогенной дифференцировки ММСК и их остеогенных производных в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации;
Оценить эффективность индуцированной адипогенной дифференцировки ММСК и их адипогенных производных при длительном моделировании эффектов микрогравитации.
Научная новизна.
Впервые проанализировано влияние длительного (от 10 до 30-40 суток) моделирования эффектов микрогравитации с помощью двух различных наземных экспериментальных установок (горизонтальный клиностат и Random Positioning Machine - RPM) на основные характеристики ММСК костного мозга человека и производные от них коммитированные остеогенные клетки-предшественники, которые отражают морфофункциональное состояние культивируемых клеток. Получены новые
данные, свидетельствующие о гравитационной чувствительности стволовых клеток взрослого организма и низкодифференцированных остеогенных клеток-предшественников .
Впервые показано, что длительная экспозиция ММСК и остеогенных клеток-предшественников различного уровня коммитированности на горизонтальном клиностате или RPM подавляет клеточный прирост на начальных этапах воздействия, не влияя при этом на жизнеспособность клеток. Обнаружено, что длительное моделирование эффектов микрогравитации не оказывает влияния на экспрессию основных иммунофенотипических маркеров ММСК и производных от них остеогенных клеток (CD90, CD29, CD44), однако стимулирует выработку провоспалительного цитокина (ИЛ-8). Проведенные сравнительные исследования позволили установить, что в отличие от клиностатирования, которое оказывает незначительное влияние на завершающие этапы дифференцировки ММСК в остеогенном направлении, моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM подавляет как начальные (активация экспрессии мембранной формы щелочной фосфатазы, биосинтез коллагена I типа), так и терминальные этапы (формирование минерализованного матрикса) индуцированного остеогенеза остеогенных клеток-предшественников.
Впервые показано, что в данных экспериментальных условиях направленная адипогенная дифференцировка культивируемых ММСК и полученных из них коммутированных адипогенных клеток-предшественников не изменяется.
Полученные данные расширяют сложившиеся теоретические представления о восприимчивости стволовых клеток и коммутированных остеогенных клеток-предшественников к изменению параметров гравитационной среды в условиях in vitro.
Научно-практическая значимость работы.
Результаты, полученные в работе, могут служить основой для использования низкодифференцированных стромальных клеток костного мозга человека, а также производных от них коммутированных клеток-предшественников в качестве удобной экспериментальной модели для изучения процессов дифференцировки стволовых клеток в условиях изменения параметров гравитационной среды, а также механизмов клеточной механочувствительности.
Подтверждена потенциальная возможность включения стволовых клеток и низкодифференцированных остеогенных клеток-предшественников в развитие локальных клеточных процессов адаптивной перестройки костной ткани, наблюдаемых в условиях гипокинезии и микрогравитации.
Проведенные сравнительные исследования позволяют рекомендовать использование коммерческой экспериментальной установки RPM как более адекватной модели для предупреждения процессов индуцированной дифференцировки стволовых клеток по сравнению с клиностатом.
Результаты исследования могут быть использованы в материалах лекций по биологии стволовых клеток, авиационной, космической и морской медицине, а также учитываться при проведении биологических исследований.
Положения, выносимые на защиту:
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, как и производные от них остеогенные клетки-предшественники, восприимчивы к моделированию эффектов микрогравитации, что подтверждается подавлением процессов клеточного роста и остеогенной, но не адипогенной дифференцировки клеток различного уровня коммитированности, а также активацией продукции интерлейкина-8.
Для изучения морфофункционального состояния и процессов коммитирования стволовых клеток в условиях измененной гравитации способ моделирования эффектов микрогравитации с помощью экспериментальной установки RPM имеет преимущество перед горизонтальным клиностатированием, поскольку оказывает влияние не только на морфофункциональные характеристики ММСК, но более существенно воздействует на остеогенную дифференцировку клеток-предшественников .
