Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 15
1.1. Строение, биосинтез и функции белков в организме человека 15
1.2. Обмен белков в организме здорового человека 20
1.2.1. Поступление извне 20
1.2.2. Распад белков в организме 21
1.2.3. Выведение продуктов белкового обмена 22
1.2.4. Синтез белка де ново и переаминирование 23
1.3. Процессы, которые участвуют в создании белковой композиции крови 26
1.3.1. Секреция белков в кровь после их синтеза в тканях 26
1.3.2. Апоптоз, другие виды разрушения клеток 27
1.3.3. Реабсорбция белков почками 28
1.3.4. Исследование белковой композиции биологических жидкостей человека до развития протеомики на основе масспектрометрии 29
1.4. Начало эры протеомики (изобретение МАЛДИ). Методы и возможности (чувствительность, производительность) протеомики на основе масспектрометрии 33
1.5. Организация HUPO и современное состояние по выявлению белков крови и мочи человека 35
1.6. Ценность мочи как биоматериала для клинических и физиологических исследований 36
1.7. Анализ мочи протеомными методами 37
1.8. Изучение протеома мочи, его применением в клинике 39
1.9. Феноменология изменений в организме человека при действии реальных и моделируемых на Земле факторов космического полета 49
1.9.1. Длительные космические полеты 49
1.9.2. Адаптивные механизмы в условиях «cухой» иммерсии 57
1.9.3. Антиортостатическая гипокинезия (АНОГ) 61
1.9.4. Длительная изоляция в гермообъеме 63
1.10. Характеристика возрастных изменений физиологических систем организма 65
1.10.1. Морфо-функциональные признаки старения почечной ткани 69
1.10.2. Характеристика процессов старения отдельных тканей 72
2. Материалы и методы исследования 77
2.1. Материалы исследования 77
2.2. Объекты исследования 78
2.3. Модельные эксперименты 79
2.3.1. Исследование протеома мочи здоровых добровольцев 79
2.3.2. 520-суточная изоляция в гермообъеме 79
2.3.3. 105-суточная изоляция в гермообъеме 80
2.3.4. 21-суточная антиортостатическая гипокинезия 80
2.3.5. 5-суточная «сухая» иммерсия 81
2.3.6. Длительные космические полеты 81
2.4. Циклограмма сбора проб мочи 81
2.5. Методы исследования 83
2.5.1. Подготовка образцов мочи к хромато-масс-спектрометрическому анализу 83
2.5.2. Прямое профилирование образцов 84
2.5.3. Хромато-масс-спектрометрический анализ 85
2.5.4. Биоинформационные методы 85
3. Результаты исследований и их обсуждение 87
3.1. Исследование протеома мочи здоровых добровольцев. Возрастные изменения 87
3.2. Постоянно присутствующие белки в мочездоровых людей 93
3.3. Влияние особенностей диеты (уровня солепотребления) на белковыйсостав мочи 107
3.3.1. Определение списка белков, непосредственно связанных с различным солепотреблением внутри эксперимента 110
3.3.2. Анализ влияния различного уровня солепотребления на белковый состав мочи в 105-суточной изоляции с помошью программы oposSOM 115
3.3.2.1. Метод кластеризации - самоорганизующиеся карты 115
3.3.2.2. Анализ результатов 118
3.3.2.2.1. Анализ результатов начального периода исследования 119
3.3.2.2.2. Анализ результатов промежуточного периода исследования 130
3.3.2.2.3. Анализ результатов заключительного периода исследования 135
3.4. Анализ протеома мочи в АНОГ 140
3.4.1. Постоянно присутствующие белки 141
3.4.2. Транзиторно присутствующие белки 142
3.4.3. Тканевая представленность белков 149
3.4.4. Процессы, связанные с регуляцией жидкостных объемов тела 154
3.4.5. Белки и процессы, связанные с функциями почек 159
3.4.6. Белки и процессы, связанные с функциями ССС 161
3.4.7. Белки и процессы, связанные с функциями костно-мышечной системой 163
3.5. Изучение взаимосвязи между состоянием сердечно-сосудистой системы, водно-солевого обмена и протеомом крови и мочи в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией 170
3.5.1. Исследования водно-электролитного обмена в 5-суточной СИ 172
3.5.2. Исследование сердечно-сосудистой системы в 5-суточной СИ 177
3.5.3. Прямое профилирование сыворотки крови в 5-суточной СИ 186
3.5.4. Белки, выполняющие функции в сердечно-сосудистой системе 190
3.5.5. Белки тканей почек и мочевыводящей системы 196
3.6. Выявление значимо представленных биологических процессов по составу протеома мочи космонавтов на первые сутки после длительных космических полетов 199
4. Заключение 211
5. Выводы 215
6. Список литературы 217
- Синтез белка де ново и переаминирование
- Исследование протеома мочи здоровых добровольцев
- Влияние особенностей диеты (уровня солепотребления) на белковыйсостав мочи
- Изучение взаимосвязи между состоянием сердечно-сосудистой системы, водно-солевого обмена и протеомом крови и мочи в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией
Синтез белка де ново и переаминирование
Аминокислоты, поступающие в ток крови в результате гидролиза белков в пищеварительном тракте, а также аминокислоты, образованные в процессе расщепления клеточных белков, образуют так называемый аминокислотный пул, который может использоваться всеми клеточными структурами для белкового синтеза [Veronesi M. et al., 2013]. Наибольшее количество свободных аминокислот поступает из мышц, мозга и кишечника, причем до 50% - это аланин и глутамин [Stobart J.L., Anderson C.M., 2013]. Почки - основной источник серина и частично аланина, которые попадают в нее из плазмы печенью [Longenecker K.L. et al., 2006]. В головном мозге окисляется большое количество аминокислот с разветвленной боковой цепью [Butt S.A. et al., 2012]. В постабсорбтивном периоде (перед следующим приемом пищи) основными источниками свободных аминокислот служат мышцы. Из них в кровоток поступают в основном аланин и глутамин. Аланин поглощается печенью [Jorgensen J.T. et al., 2012], глутамин - кишечником и почками. В кишечнике азот глутамина переносится в аланин или серин и в их составе транспортируется в печень, где активируется процесс глюконеогенеза [Larsen M., Kristensen N.B., 2013]. Аминокислоты с разветвленной боковой цепью (валин, лейцин, изолейцин) освобождающиеся из мышц, направляются в мозг, являясь источником энергии. Катаболизм всех аминокислот сводится к образованию шести веществ, вступающих в общий путь катаболизма: пируват, ацетил-КоА, L-кетоглутарат, сукцинил-КоА, фумарат, оксалоацетат.
В живой природе, в организме человека в частности, не существует изолированного обмена белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот. Все превращения объединены в целостный процесс метаболизма, подчиняющийся определенным закономерностям, взаимозависимости и взаимообусловленности, допускающий также взаимопревращения между отдельными классами органических веществ. Подобные взаимопревращения диктуются физиологическими потребностями организма, а также целесообразностью замены одних классов органических веществ другими. Так, гликогенные аминокислоты используются в процессе глюконеогенеза [Pasiakos S.M. et al., 2011], а кетогенные - в синтезе кетоновых тел [Deng-Bryant Y., Prins M.L., Hovda D.A., Harris N.G., 2011], часть аминокислот (гликокетогенных) используется в обоих классах превращений. В организме человека возможен синтез восьми заменимых аминокислот: Ала, Асп, Асн, Сер, Гли, Глу, Глн, Про; углеводный скелет данных аминокислот образуется из глюкозы, а универсальным донором L-аминогруппы служит глутамат. Серин и глицин необходимы не только для синтеза белков и глюкозы (при ее недостатке в клетках), но и нуклеотидов, коферментов, сложных липидов, креатинина и других соединений. Метионин и цистеин, содержащие серу, используются в синтезе белков, участвуют в инициации процесса трансляции, фолдинге, в образовании мембран клеток и липопротеинов, в составе которых осуществляется транспорт липидов, а также в синтезе таурина. Тирозин используется не только в синтезе белков, но выступает предшественником таких гормонально-активных соединений как катехоламины, тироксин, меланины. Большую роль в организме человека играют непептидные азотосодержащие соединения - производные аминокислот: гормоны надпочечников, щитовидной железы, а также медиаторы ЦНС, медиатор воспаления (гистамин) и другие [Северин Е.С., 2013].
«Центральной догмой биологии» называют поток информации от дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) через рибонуклеиновую кислоту (РНК) на белок, который характерен для всех живых организмов, за исключением некоторых вирусов [Crick F., 1970]. Результаты работ по исследованию генетического кода являются одним из самых значительных достижений XX века в понимании процессов жизни [Novozhilov A.S., Koonin E.V., 2009]. Биосинтез белков, называемый трансляцией, включает в себя преобразование информации, заложенной в полинуклеотидной последовательности мРНК в аминокислотную последовательность белка согласно генетическому коду [Ingolia N.T. et al., 2012]. Каждая молекула ДНК представляет собой две правозакрученные, антипараллельные полинуклеотидные цепи, упакованные в хромосому, расположены в ядре, в диплоидных клетках человека их сорок шесть – т.е. 23 пары [Maffeo C., Luan B., Aksimentiev A., 2012]. У эукариот с ДНК связаны гистоновые и негистоновые белки. В ядре существует 5 видов гистонов, общая масса которых примерно равна содержанию ДНК [Bartke T. et al., 2010]. К негистоновым белкам относят семейство сайт-специфических белков типа «цинковые пальцы», годимеры, негистоновые белки с высокой электрофоретической подвижностью, ферменты репликации, транскрипции и репарации [Petruk S. et al., 2013]. Генетическая информация, считывающаяся с ДНК, «переносится» на молекулу РНК (long RNA), которая строится как одна полинуклеотидная цепь, отдельные участки которой образуют спирализованные петли-«шпильки» за счет водородных связей [Seetin M.G., Mathews D.H., 2012]. В цитоплазме клеток присутствуют несколько типов РНК - транспортные, матричные, рибосомальные и маленькие молекулы РНК (small RNA) отличающиеся по массе, структуре, конформации, функции [Okada H., Hayashizaki Y., 2013]. Первичные транскрипты мРНК подвергаются ряду ковалентных модификаций, которые необходимы для функционирования мРНК в качестве матрицы. Модификация РНК (сплайсинг) происходит в ядре, в цитоплазму поступает уже «зрелая» мРНК [Meyer K.D. et al., 2012]. Варианты сплайсинга могут приводить к образованию различных изоформ одного и того же белка. Кодирование структуры белков осуществляется, по современным представлениям, в линейной последовательности нуклеотидов мРНК, однако в ходе трансляции не наблюдается соответствия между числом мономеров в матрице мРНК и синтезируемом белке; отсутствует также и структурное сходство между мономерами РНК и белка. Причины несоответствия транскриптома и протеома клетки обсуждаются сообществом биологов постгеномного периода с неослабевающим интересом. Кроме самоочевидной причины - различного времени полужизни тРНК и белка, синтезируемого с данной молекулы РНК, приводятся последние данные, указывающие на участии, длинных РНК в регуляции активности транскрипции [Takayama K.,et al., 2013]. Таким образом, не все длинные РНК непосредственно участвуют в последующих этапах, ведущих к синтезу белка. Код позволяет шифровать аминокислоты, входящие в состав белков, с помощью соответствия им определенной последовательности нуклеотидов в ДНК. Генетический код представляет собой не случайный конгломерат соответствий между кодонами мРНК и аминокислотами белков, а высокоорганизованную систему, проявляющую общие свойства и закономерности [Ратнер В.А., 2000]. Для него характерны триплетность, специфичность, вырожденность (включение в белок одной и той же аминокислоты определяют несколько кодонов), линейность записи информации, универсальность (кроме митохондриальной мРНК, содержащей 4 триплета), колинеарность (аминокислотная последовательность белка колинеарна последовательности экзонов в гене или зрелой мРНК после посттранскрипционного удаления интронов) [Amikura K., Sakai Y., Asami S., Kiga D., 2014]. Таким образом, основными компонентами белоксинтезирующей системы являются: аминокислоты в достаточном количестве, мРНК (содержат информацию о структуре синтезируемого белка и используются в качестве матрицы), тРНК (обеспечивают включение аминокислот в белок), рибосомы, на которых идет сборка аминокислот в белки, белковые факторы, а также аденозинтрифосфат (АТФ) и гуанозинтрифосфат (ГТФ) как источники энергии. Каждая эукариотическая мРНК кодирует строение только одной полипептидной цепи, т.е. она моноцистронна. Рибосома способна катализировать образование около 100 пептидных связей в минуту [Beznoskov P. et al. 2013]. Полипептидные цепи могут подвергаться структурным модификациям, посттрансляционным изменениям, затем происходит фолдинг полипептидных цепей и формирование уникальной третичной или четвертичной структуры белков [Кузнецова И.М., Форже В., Туроверов К.К., 2005; Shen X., Chen S., Li G., 2013].
Исследование протеома мочи здоровых добровольцев
Скелетные мышцы испытывают снижение регенеративного потенциала с возрастом, что проявляется снижением числа миогенных волокон и их замены фиброзной тканью [Cerletti M. et al., 2008]. При этом происходит ослабление регенерации после травм, и, как правило, неполное восстановление [Di Iorio A. et al., 2006]. Возрастные изменения приводят к потере мышечной массы – саркопении, при этом скорость метаболизма в ткани замедляется. Для объяснения причин саркопении был предложен ряд теорий. Одна из них связывает саркопению с увеличением количества свободных радикалов, окислительным стрессом и возрастзависимой аккумуляцией митохондриальных аномалий: то есть с накоплением мутаций в мДНК, приводящих к дефектам белков электрон-транспортной цепи. Исследователи под руководством Айкена предположили, что мышцы, которые наиболее ослабляются в результате саркопении, будут нести больше дефектов электрон-транспортной цепи, чем мышцы, меньше старадющие от саркопении. Оказалось, что миоциты, в которых отсутствует цитохромоксидаза и наблюдается повышенная активность сукцинат-дегидрогеназы, несут мутации мтДНК. Накопление делеций мДНК приводит к потере активности цитохромоксидазой и вызывает повышенную активность сукцинат-дегидрогеназы [McKiernan et al., 2009].
Нейрогенезу человека продолжается в течение всей взрослой жизни, при этом новые нейроны происходят от нервных стволовых клеток (НСК), локализующихся в субвентрикулярной зоне и в субгранулярной зоне гиппокампа зубчатой извилины [Gage F.H., 2000]. Однако при старении организма активность нейрогенеза снижается, что может способствовать нейродегенеративным заболеваниям. При сравнении популяций НСК в субвентрикулярной зонах молодых (2-4 месячных) и старых (24-26 месячных) мышей отмечается примерно двукратное сокращение нервных стволовых клеток старых мышей [Molofsky A.V. et al., 2006]. В дополнении к этому, общее снижение числа вновь сформированных нейронов имеет и функциональные последствия, так, в стареющем мозге мыши, снижение нейрогенеза связано с нарушениями обоняния [Enwere E. et al., 2004].
Известно, что селезенка человека выполняет иммунную, фильтрационную и депонирующую функции, участвует в процессах гемолиза, синтеза белков и в кроветворении [Кузнецова Е.П., Линькова Н.С, Дудков А.В., Войцеховская М.А., 2013]. С возрастом наблюдается снижение функциональной активности этого органа, увеличивается число стареющих эритроцитов в кровеносном русле, что является одной из причин неэффективности газообменных процессов в тканях при старении. Возрастные изменения в селезенке характеризуются как морфологической, так и функциональной картиной инволюции. Количество лимфатических узелков и размеры их центров с возрастом уменьшается. Ретикулярные волокна белой и красной пульпы грубеют и становятся более извилистыми, формируются узловатые утолщения волокон. При возрастной атрофии селезенки количество макрофагов и лимфоцитов в пульпе уменьшается, тогда как число зернистых лейкоцитов и тучных клеток возрастает. Как в старческом, так и в детском возрасте в селезенке обнаруживаются гигантские многоядерные клетки - мегакариоциты. Важную роль в процессах старения селезенки играют кейлоны – высокомолекулярные белки, угнетающие пролиферацию иммунных клеток селезенки. Из кейлонов были выделены низкомолекулярные пептиды – супрессоры активности иммунных клеток – тафцин и спленин. Предшественник тафцина синтезируется в лимфоцитах селезенки в виде лейконина, который путем ограниченного протеолиза преобразуется в активную форму. Спленин по функциям и структуре напоминает гормон тимуса тимопоэтин, что свидетельствует о сходстве иммунологических процессов, а возможно, и механизмов старения указанных органов. Так, активные центры спленина и тимопоэтина различаются лишь одним аминокислым остатком [Кузнецова Е.П., Линькова Н.С, Дудков А.В., Войцеховская М.А., 2013].
Печень человека претерпевает ряд структурных изменений, часть которых носит компенсаторно-приспособительный характер и обеспечивает удовлетворительное функционирование органа в процессе старения. После 50 лет отмечено уменьшение массы печени (до 600 г), что коррелирует с изменением относительной доли массы органа к массе тела. В связи с развитием возрастных изменений после 70 лет орган уменьшается на 150—200 грамм [Лазебник Л. Б., Ильченко Л. Ю., 2007]. Выраженная атрофия печени отмечается лишь к 8-му десятилетию; данный показатель значительно варьирует, но не достигает резкой степени выраженности даже у долгожителей. Начиная с 45 - летнего возраста происходит уменьшение общего числа гепатоцитов [Лазебник Л.Б., Ильченко Л.Ю., 2007]. В старческом возрасте выявлено увеличение количества и размера лизосом, а также колебания активности лизосомных ферментов [Serst T., Bourgeois N., 2006], обнаружено повышенное включение липофусцина в гепатоцитах центральных долек с тенденцией к атрофии этих клеток. Изменяются размеры митохондрий, растет число вторичных лизосом [Лазебник Л.Б., Ильченко Л.Ю., 2007].
Поджелудочная железа является органом пищеварительной и эндокринной системы, ее роль в жизнедеятельности организма трудно переоценить [Дедов И.И., Петеркова В.А., 2006]. Главная составляющая эндокринной функции поджелудочной железы - синтез в островках Лангерганса инсулина и глюкагона, которые служат ключевыми гормональными факторами, регулирующими энергетический метаболизм [Дедов И.И., Петеркова В.А., 2006; Волков В.П., 2014]. С возрастом значительно сокращается популяция эндокриноцитов островкового аппарата поджелудочной железы за счёт -клеточного компонента [Снигур Г. Л., Смирнов А. В., 2010; Волков В.П. 2014], что приводит к уменьшению толерантности к глюкозе и зачастую к развитию диабета [Meier J.J., Ueberberg S., Korbas S., Schneider S., 2011]. Анализ возрастных изменений цитометрических параметров -клеток показал, что размер последних плавно уменьшается и после 40 лет статистически достоверно отличается от данного показателя у молодых [Волков В.П., 2014]. С возрастом происходит уменьшение размеров железы и ее частичная атрофия [Sato T. et al., 2012]. Группа японских ученых под руководством Tohno изучила содержание основных химических элементов в протоке поджелудочной железы и в общем желчном протоке у людей различного возраста при помощи плазменно-атомной эмиссионной спектрометрии. Отмечено, что с возрастом в протоке поджелудочной железы наблюдается значительное увеличение содержания магния. Кроме того, при оценке соотношений между элементами удалось установить прямую корреляцию с возрастом соотношения сера/магний, а также фосфор / натрий [Tohno Y. et al., 2004].
В настоящее время большое количество исследований посвящено изучению протеома мочи применительно к клиническим и/или геронтологическим задачам. В них отмечается необходимость исследования "нормального старения", выявления физиологических процессов, которые наиболее выражено страдают от старости [Bakun M. et al., 2014].
Таким образом, изучение протеома мочи здорового человека в нормальных условиях жизнедеятельности, и при действии реальных и моделируемых факторов космического полета имеет большую теоретическую и практическую значимость, так как может позволить на молекулярном уровне выявить возрастные изменения, а так же механизмы приспособления человека к новым условиям существования, определить адаптивные возможности организма, не связанные с развитием заболевания. Результаты исследования помогут лучше понять направленность и диапазон происходящих в условиях космического полета физиологических изменений в организме и разработать эффективные меры профилактики и коррекции неблагоприятного воздействия условий космического полета на организм человека.
Влияние особенностей диеты (уровня солепотребления) на белковыйсостав мочи
У лиц с гиперинсулинемией и инсулинорезистентностью отмечена высокая чувствительность АД к поваренной соли, поэтому большинство исследователей считают гиперинсулинемию, инсулинорезистентность и солечувствительность АД ассоциированными состояниями [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009; Giner V., Coca A., de la Sierra A., 2001]. У солечувствительных пациентов высокосоленая диета индуцирует гиперинсулинемию и ухудшает чувствительность тканей к инсулину [Fujiwara N. et al., 2000]. Действие гиперинсулинемии на развитие гипертонии может быть связано с развитием центральной гиперсимпатикотонии, которая приводит к повышению активности ренина в почках и активации РААС. Внутрипочечный тканевый ангиотензин-II сокращает как приносящие, так и отводящие артериолы, приводя к снижению почечного кровотока, уменьшению фильтрационной нагрузки по натрию [Fujiwara N. et al., 2000]. Ренин регулирует начальный, ограничивающий скорость, этап РААС путём отщепления N-концевого сегмента ангиотензиногена для формирования биологически инертного декапептидаангиотензина 1 или Ang-(1-10). Первичный источник ангиотензиногена - печень. Ангиотензин - II усиливает реабсорбцию натрия за счет одновременного воздействия на ренальные сосуды и почечные канальцы, снижая медуллярный кровоток, повышает пассивную реабсорбцию натрия в петле Генли. Ангиотензин-II повышает натрий - водородный обмен в проксимальных канальцах и активность Na+-K+-АТФ-азы. Конечный итог этих воздействий реализуется в снижении экскреции натрия с мочой и формировании солезависимой гипертонии [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009]. Показано, что повышение концентрации глюкозы в крови увеличивает экспрессию гена ангиотензиногена в почечной ткани и активизирует почечную РААС. Вследствие инсулинорезистентности тканей и гипергликемии отсутствует или снижено подавление экспрессии гена ангиотензиногена, и продукция ангиотензина - II в почечной ткани усилена. Ангиотензин - II через воздействие на АТ-1-рецепторы усиливает выделение норадреналина в синапсах почек и приводит к почечной гиперсимпатикотонии. Стимуляция эфферентных нервов почек увеличивает канальцевую реабсорбцию натрия, приводя к задержке жидкости и повышению АД [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009; Botero-Velez M., Curtis J.J., Warnock D.G., 1994]. Таким образом, гиперинсулинемия и инсулинорезистентность, ассоциируясь с солечувствительностью АД, усугубляют течение друг друга [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009].
Почкам отводится центральная роль в регуляции АД, что обусловлено их участием в Na+ гемостазе, а также в реабсорбции K+ и Cl. Сохранение натрия для поддержания адекватного объёма крови и внеклеточной жидкости является одним из назначений почки млекопитающих [Наточин Ю.В., 2008]. Еще 40 лет назад было продемонстрировано, что трансплантация почек от генетически нормотензивных крыс к линии крыс с гипертензией, предотвращала или контролировала гипертонию [Dahl L.K., Heine M., 1975]. Почка может выступать как орган-мишень для действия большинства известных факторов, связанных с сердечно-сосудистыми эффектами, отвечать за формирование системных метаболических и сосудистых патологических процессов, являясь активным генератором факторов риска [Смирнов А.В., Добронравов В.А., Каюков И.Г., 2010]. При различных механизмах усиления диуреза (водная нагрузка, осмотический диурез, салурез после инъекции фуросемида или аналогов вазотоцина) выявлено увеличение выделения белков с мочой. В основе этих типов физиологической протеинурии, по-видимому, лежит изменение гидродинамики гломерулярного аппарата [Наточин Ю.В., 2008]. Известно, что высокий уровень поступления хлорида натрия с пищей ассоциирован с развитием и прогрессированием артериальной гипертензии, которая, в свою очередь, служит важным детерминантом повреждения почек и сердца. Поражение почек, как органа мишени, встречается часто при гипертонической болезни сердца и у пациентов с другими сердечно-сосудистыми заболеваниями, особенно в сочетании с хронической сердечной недостаточностью [Драгунов Д.О., 2014]. У лиц с избыточной массой тела высокий уровень поступления натрия с пищей определяет развитие гиперфильтрации в клубочках [Lely A.T. et al., 2007]. Гомеостатический ответ почек на высокосолевую диету включает регулирование вдоль всего нефрона; высокое потребление соли уменьшает реабсорбцию Na+ путём уменьшения количества Na+ транспортёров и связанных с ними регуляторов в активных доменах плазматической мембраны главным образом путем перераспределения, а не изменения в размере их общего пула (уменьшается только количество NCC-натрий-хлор транспортеров). Перераспределение из одного места в другое, а не деградация и синтез, может обеспечить механизм для быстрой и постоянной адаптации к ситуациям с высоким или низким потреблением натрия без необходимости синтезировать или разрушать сложные белковые механизмы (транспортёры). Уменьшение количества транспортеров натрия в активных апикальных доменах будет также, теоретически, компенсировать гломерулотубулярный баланс, и обеспечивать экскрецию натриевой нагрузки во время диеты с высоким потреблением соли [McDonough A.A., 2010].
Известно, что толстая кишка наряду с другими органами непрерывно участвует в обеспечении стабильности физико-химических условий всех жидкостных компартментов организма, поддерживая гомеостаз. Она является не только одним из органов выделения, но и возвращает в портальный кровоток ионы, такие как натрий, хлор, а также воду до экскреции с фекальными массами. Обеспечивает участие колоноцитов толстой кишки в поддержании постоянства осмоляльности крови и выполнении осморегулирующей функции [Ерофеев Н.П., Радченко В.Г., Селиверстов П.В., 2012]. Колоноциты и плотные контакты между ними управляют интенсивностью абсорбции воды и электролитов, выступают в роли органа локального и системного водно-солевого гомеостаза. Толстая кишка имеет собственный локальный механизм транспорта ионов натрия из просвета кишки в интерстициальную жидкость. Посредством этого механизма колоноциты абсорбируют около 95% натрия, находящегося в просвете толстой кишки. Короткоцепочечные жирные кислоты, особенно бутират (масляная кислота), модулируют распознавание и уничтожение собственных мутантных, в том числе, опухолевых клеток, а также вторгшихся микроорганизмов. Производителем короткоцепочечных жирных кислот являются симбиотические анаэробные бактерии толстой кишки [Ерофеев Н.П., Радченко В.Г., Селиверстов П.В., 2012; Bhmig G.A. et al., 2007].
Таким образом, с помощью биоинформационных подходов, методами современной масс-спектрометрии удалось наблюдать физиологические эффекты адаптации организма здорового человека к высокому солепотреблению (12г/день), нашедшие отражение в динамике изменений протеома мочи. В этот период эксперимента (фон и первые шесть недель эксперимента) отмечались: повышение активности белкового синтеза, активация адаптивной иммунной системы, провоспалительных белков. Известно, что макрофаги, помимо защиты организма от инфекций, принимают участие в регуляции солевого баланса и артериального давления. В регионах тела с высокой концентрацией соли они вызывают образование новых кровеносных и лимфатических сосудов, особенно в коже, тем самым, регулируя микроциркуляцию организма. В поддержку этого механизма мы находим, что такие процессы, как ангиогенез, клеточная адгезия, активируются в период высокого солепотребления наряду с экспрессией провоспалительных агентов. Увеличение экспрессии белка в начале эксперимента может быть связано с потребностью организма активировать процессы в почках, которые участвуют в экскреции и регуляции водного баланса в ответ на повышенное солепотребление.
Промежуточный период исследования, который был определен с помощью биоинформационных методов, включал в себя 7 - 11 неделю эксперимента. Солепотребление в этот период времени было различным и составляло 9 (7-9 недели), 12 (10 неделя) и 6 г/день (11 неделя), соответственно. Экспрессия белка, по сравнению с начальным периодом исследования, снижалась, процент активации белков составил 20%. В это период активируются процессы, связанные с делением клеток, с липидным обменом, ремоделированием хроматина, ответом на окислительный стресс и гипоксию, с регуляцией апоптоза, и ремоделированием мышц. PSF анализ выявил активацию белков, связанных с деятельностью пищеварительной системы, процессов метаболизма, регенеративных процессов (Wnt-сигнальный путь и биосинтез N-гликанов).
Изучение взаимосвязи между состоянием сердечно-сосудистой системы, водно-солевого обмена и протеомом крови и мочи в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией
Кадгенин-2 и индуцируемый пролактином белок выявляются на 5 сутки эксперимента и исчезают на 16, вновь эксперссируются на 21 сутки эксперимента. Таким образом, эти белки выявляются в острый период, при адаптации к АНОГу, и в день окончания воздействия. Еще три белка выявляются на пятые сутки эксперимента и имеют различную динамику- хондроитин-4-сульфат протеогликан, цистатин С и дипептидаза 1. Хондроитин-4-сульфат протеогликан, появляясь на 5 сутки эксперимента, остается до конца исследования. Данный белок экспрессируется в хондроцитах, эндотелиальных гладкомышечных клетках [Campoli M. et al., 2004]. Он стимулирует эндотелиальные клетки к росту сосудов [Chekenya M., Pilkington G.J., 2002], формирует совместно с многочисленными полисахаридными цепями гликозаминогликанов внеклеточный матрикс [Климанцев И.В. с соавт., 2009]. Цистатин С аннотирован ранее, в данной главе. Он так же вовлечен в деградацию костной ткани [Brand H.S. et al., 2004]. Данный белок появляется в эксперименте и на первые сутки периода восстановления.
Дипептидаза 1- мембранный гликопротеин расщепляет дипептиды до аминокислот, действует на пептидные связи, по соседству с которыми находятся одновременно как свободная аминная, так и свободная карбоксильная группы. Гидролизует широкий спектр дипептидов, участвует в системе глутатиона, может играть важную роль в регуляции активности лейкотриена [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 2009]. Выявляется во время эксперимента, на 3 и 6 сутки восстановительного периода.
На 16 сутки эксперимента обнаруживается бета-2 микроглобулин - это низкомолекулярный белок является частью легкой цепи мембраносвязанных HLA-антигенов. В конечной моче присутствует лишь 0,1% от общей концентрации в организме, экскреция бета-2 микроглобулина с мочой не зависит от диуреза. У здоровых людей экскреция его с мочой составляет не более 250 мкг/л, определение повышенных количеств будет свидетельствовать о вовлечении канальцев в патологический процесс [Алексеев А.В. с соавт., 2014; Leney A.C., 2014]. На 6 сутки периода восстановления в белковой композиции он не обнаруживается.
На первые и шестые сутки после эксперимента в моче обнаруживается белок S100-A8, а только на первые - коллаген I типа альфа I.
Белок S100-A8 известный также как кальгранулин А, появляется только на первые и шестые сутки после эксперимента. Является внутриклеточным кальций связывающим белком, который продуцируется нейтрофилами и моноцитами [Знаменская Л.Ф., 2011]. Активированные нейтрофилы и моноциты вырабатывают большое количество кальций связывающих белков S100 A8, S100 A9 (или MRP14) и S100 A12, образуют комплекс, который может служить в качестве эндогенного антагониста TLR и активировать сигнальные пути TLR [Баранов А.А. с соавт., 2013]. Белки S100 принимают участие в регуляции процессов обмена Са2+, фосфорилирования, организации цитоскелета, транскрипции ДНК, роста и дифференцировки клеток, регенерации, секреции, а также опухолевого роста и метастазирования [Муравьев Ю.В., Лебедева В.В., 2012]. На клеточных культурах эпителиальных тканей продемонстрировано ингибирующее влияние некоторых представителей белков S100 (S100 A8/A9) на казеинкиназу II, фосфорилирующую многие ключевые клеточные белки, в том числе и белки-регуляторы клеточного цикла [Полетаев А.Б., 2007].
Коллаген I типа альфа I, входит в состав костей, сухожилий, связок, кожи и других соединительных тканей [Wenstrup R.J. et al., 2004]. В работе Мякоткина с соавт., выявлены ассоциации остеопороза взрослых с полиморфизмами генов альфа 1 цепи коллагена 1 типа (COL1A1), рецепторов кальцитонина (CTR), витамина D (VDR) и эстрогенов (ER), паратиреоидного гормона (PTH), интерлейкина 6 (IL 6), трансформирующего фактора роста (TGFB1) [Мякоткин В.А. с соавт., 2008; Крылов М.Ю., Беневоленская Л.И., Мякоткин В.А. 2010]. Поскольку коллаген I типа является основным белком, составляющим костную ткань, полиморфизм COL1A1 и COL1A2 генов рассматривается одним из определяющих плотность костной ткани [Stewart T.L. et al., 2006].
Таким образом, в начальном периоде эксперимента, наблюдаются процессы адаптации к АНОГу, выражающиеся в активации процессов, играющих роль в мужской фертильности, свертывании крови, протеолизе, фибринолизе, регуляции адгезии, гомеостазе. В процессе эксперимента, активируются процессы, связанные с протеолизом, обменом олигосахаридов. На первые сутки восстановительного периода (ВП) активизируются процессы, связанные с метаболизмом коллагена, обеспечиваюшие прочность костной ткани, внеклеточного матрикса, имеющий значение для формирования эластичных тканей. На 3 сутки ВП активизируется система комплемента. На 6 сутки ВП активизируются процессы, которые обеспечивают взаимодействие клеток сосудистой стенки друг с другом для поддержания ее целостности, происходят процессы восстановления в местах адгезивных межклеточных контактов, актиновым цитоскелетом, регуляция процесса сперматогенеза. Среди 9 сверхпредставленных тканей (плазма, печень, желчь, моча, слюна, поджелудочная железа, лимфоциты, мочевой пузырь) встречающихся в эксперименте, специфическими являются на 5 сутках эксперимента семенные пузырьки, на 21, +1 и +6 сутках восстановительного периода - почки.
Определены 18 белков, участвующие в процессе «regulation of body fluid level», выделены 7 постоянных: альфа-1-антитрипсин, кининоген-1, эпидермальный фактор роста, альбумин, ингибитор протеаз плазмы C1, лизосом-ассоциированный мембранный гликопротеин- 2, CD44 антиген не изменяется в течение эксперимента, а так же динамика и функции вариабельных протеинов: витамин К-зависимый белок, мультимерин-1, витамин К-зависимый белок Z, кластерин, тромбоцитарный гликопротеин VI, эндотелиальный рецептор протеина С, просапозин, альфа цепь фибриногена, антитромбин 3, серотрансферин, фибронектин. К 6 суткам восстановительного периода белковая композиция процесса «regulation of body fluid level» возвращается к фоновым значениям.
Выявлено 9 белков, принимающих участие в работе почек. При сравнении белковой композиции мочи 21 суточной АНОГ с таковой после длительных космических полетов было показано, что, в моче добровольцев не обнаруживаются аквапорин-2 и афамин, что, возможно, связано с более длительными и значимыми воздействиями на организм космических полетов. От количества аквапорина-2 зависит повторное всасывание воды почками и, как следствие, количество выделяемой мочи, а так же, вероятно, выделяемого с мочой кальция, а афамин играет важную роль в защите от окислительного стресса, являясь антиоксидантом и антиапоптотическим белком.
Была определена динамика 13 белков, принимающих участие в работе сердечно-сосудистой системы. Тиоредоксин, как белок сердечно-сосудистой системы, так и стресс-индуцируемый белок, защищает клетки от различных видов повреждений, появляется в моче добровольцев на 16 сутки эксперимента и исчезает к 3 суткам восстановительного периода. В моче космонавтов этот белок появляется только на +1сутки восстановительного периода. Возможно, он появляется в моче космонавтов ранее, однако, нет возможности исследовать белковую композицию мочи во время космического полета.
Была определена динамика 22 белков, принимающих участие в работе костно-мышечной системы. Постоянными из них являются простат - специфический антиген, витронектин, кадгерин, тетранектин, миелоидный клеточно-специфический богатый лейцином гликопротеин, CD44 антиген, остеопонтин, макрофагальный колониестимулирующий фактор 1, несекреторная рибонуклеаза, муцин-1, эпидермальный фактор роста, фруктозо-1,6-бисфосфатаза. Белок S100-A8 известный также как кальгранулин А, появляется только на первые и шестые сутки после эксперимента, является специфическим белком первых суток восстановительного периода.