Введение к работе
Актуальность проблемы. Живой организм находится в постоянном взаимодействии с окружающей средой. От силы и времени воздействия факторов среды, а также от исходного состояния организма зависит степень изменения уровня функционирования его систем. Гормональная регуляция при действии экстремальных факторов не только позволяет физиологическим системам приспособиться к этим факторам, но и наряду с нервной и иммунной системами обеспечивает координацию работы различных органов, особенно важную в экстремальных условиях. Стоит отметить, что во многих случаях, особенно при действии экстремальных факторов, регуляторная функция одновременно становится защитной. Открытое и великолепно обоснованное Г.Селье участие симпато-адреналовой системы в механизмах адаптации высокоразвитых организмов, включая дистресс, на много лет привлекло внимание исследователей к участию гормональной системы в приспособительных реакциях и регуляции физиологических процессов при изменении факторов окружающей среды. Гораздо хуже исследованы внутриклеточные регуляторные процессы, опосредующие действие экстремальных факторов, а также гормонов, факторов роста, цитокинов и других биологически активных веществ на органы и ткани при развитии так называемой «неспецифической стресс-реакции».
В дополнение к взаимодействию с внешней средой жизнь многоклеточного организма в высокой степени зависит от того, насколько его клетки способны обмениваться информацией, чтобы координировать свою программу метаболизма и развития. Регуляция метаболических процессов и взаимодействие клеток в многоклеточной системе (ткань, орган, организм) основана на связывании специфических веществ (гормоны, биологически активные амины, факторы роста и другие), высвобождаемых одной группой клеток, со специфическими реиепторными белками на клетках-мишекях. Это взаимодействие вызывает одно или множество изменений в активности внутриклеточных или мембранных белков, т.е. ферментов или ионных каналов в клетках-мишенях, которые в дальнейшем модифицируют физиологическую активность клетки. Перечень биологически активных компонентов насчитывает сотни веществ, включая различные гормоны, рилизинг-факторы, аминокислоты, моноамины, нейротрансмиттеры, факторы роста, простагландины, лейкотриены, цитокины.
Биологически активные вещества могут связываться со своими специфическими рецепторами, а иногда и с несколькими видами рецепторов для одного лиганда, и активируют или ингибируют одну или несколько так называемых вторичных мессенджерных систем: аденилат-циклазную и гуанилатциклазную системы (Ткачук В.А., 1979, Shram М, 1984, Walter J., 1984), фосфоинозитидный обмен и регулируют цитоплазматический кальций (Berridge M.J., 1984).
Внутриклеточные посредники гормонального действия активируют специфические протеинки-назьг, которые через фосфолирирование одного или нескольких специфических ферментов или других белков меняют функционирование клеточных систем и состояние клетки.
Во многих клетках более половины известных биологически активных веществ с различным физиологическим действием могут влиять через один и тот же вторичный посредник. Это, с одной стороны, указывает на универсальность системы передачи регуляторной информации через клеточную мембрану. С другой стороны, тканевая специфичность, фаза развития и функциональное состояние клетки определяют специфичность внутриклеточной реализации гормонального сигнала.
Наиболее изучены такие сигнал-проводящие системы, как аденилатциклазный комплекс (АЦ), осуществляющий превращение АТФ в цАМФ и фосфоинозитидный обмен (ФИ-обмен). Гидролиз фосфатидилинозитол-4-5-дифосфата осуществляется фосфолипазой С с образованием двух внутриклеточных сигнальных молекул: диацилглицерола и инозитол-1-4-5-трисфосфата (Berridge M.G., 1984). Диацилглицерол активирует протеинкиназу С, тогда как инозитол-трисфосфат осуществляет посредническую роль при освобождении внутриклеточного кальция из саркоплазматического ретикулума. В проведении сигнала от рецепторов гормонов или нейротрансмиттеров на аденилатциклазу и фосфолипазу С участвуют G-белки (Bockaert J. etal., 1987).
От функционирования всех звеньев сигнал-проводящих систем зависит как жизнедеятельность клеток в нормальных условиях, так и клеточная адаптация при изменении условий окружающей среды и регуляция метаболических процессов. В зависимости от природы активирующего стимула и типа клеток взаимодействие агониста с рецептором может приводить к таким явлениям, как клеточный рост (Hatzinger Р.В., Stevens J.L., 1989), клеточная дифференци-ровка (Black B.L., Smith J.E., 1989) или адаптация метаболизма клеток к изменившимся условиям ее существования, которая в некоторых случаях может привести к патологии. Превышение внешним (физическим или химическим) фактором пороговых величин, которые зависят от времени экспозиции и функционального состояния клетки, может привести к необратимым изменениям, например, при гипоксии (Trandroyen F.T. et al., 1992). Несмотря на различный конечный результат, процессы клеточной активации, адаптации и патологии часто вовлекают одни \ те же биохимические процессы, однако неизвестно, играют ли в них самостоятельную ролі сигнал-проводящие системы.
Два жизненно важных фактора - давление и состав газовой среды - при изменении вели чин их определяющих при нормальных условиях, становятся экстремальными и вызывают каї специфические, так-и неспецифические реакции организма (П.Бэр, 1878, Лазарев Н.В., 1941
Актуальность проблемы. Живой организм находится в постоянном взаимодействии с окружающей средой. От силы и времени воздействия факторов среды, а также от исходного состояния организма зависит степень изменения уровня функционирования его систем. Гормональная регуляция при действии экстремальных факторов не только позволяет физиологическим системам приспособиться к этим факторам, но и наряду с нервной и иммунной системами обеспечивает координацию работы различных органов, особенно важную в экстремальных условиях. Стоит отметить, что во многих случаях, особенно при действии экстремальных факторов, регуляторная функция одновременно становится защитной. Открытое и великолепно обоснованное Г.Селье участие симпато-адреналовой системы в механизмах адаптации высокоразвитых организмов, включая дистресс, на много лет привлекло внимание исследователей к участию гормональной системы в приспособительных реакциях и регуляции физиологических процессов при изменении факторов окружающей среды. Гораздо хуже исследованы внутриклеточные регуляторные процессы, опосредующие действие экстремальных факторов, а также гормонов, факторов роста, цитокинов и других биологически активных веществ на органы и ткани при развитии так называемой «неспецифической стресс-реакции».
В дополнение к взаимодействию с внешней средой жизнь многоклеточного организма в высокой степени зависит от того, насколько его клетки способны обмениваться информацией, чтобы координировать свою программу метаболизма и развития. Регуляция метаболических процессов и взаимодействие клеток в многоклеточной системе (ткань, орган, организм) основана на связывании специфических веществ (гормоны, биологически активные амины, факторы роста и другие), высвобождаемых одной группой клеток, со специфическими рецепторными белками на клетках-мишенях. Это взаимодействие вызывает одно или множество изменений в активности внутриклеточных или мембранных белков, т.е. ферментов или ионных каналов в клетках-мишенях, которые в дальнейшем модифицируют физиологическую активность клетки. Перечень биологически активных компонентов насчитывает сотни веществ, включая различные гормоны, рилизинг-факторы, аминокислоты, моноамины, нейротрансмиттеры, факторы роста, простагландины, лейкотриены, цитокины.
Биологически активные вещества могут связываться со своими специфическими рецепторами, а иногда и с несколькими видами рецепторов для одного лиганда, и активируют или ингибируют одну или несколько так называемых вторичных мессенджерных систем: аденилат-циклазную и гуанилатциклазную системы (Ткачук В.А., 1979, Shram М., 1984, Walter J., 1984), фосфоинозитидный обмен и регулируют цитоплазматический кальций (Berridge M.J., 1984).
Внутриклеточные посредники гормонального действия активируют специфические протеинки-назы, которые через фосфолирирование одного или нескольких специфических ферментов или других белков меняют функционирование клеточных систем и состояние клетки.
Во многих клетках более половины известных биологически активных веществ с различным физиологическим действием могут влиять через один и тот же вторичный посредник. Это, с одной стороны, указывает на универсальность системы передачи регуляторной информации через клеточную мембрану. С другой стороны, тканевая специфичность, фаза развития и функциональное состояние клетки определяют специфичность внутриклеточной реализации гормонального сигнала.
Наиболее изучены такие сигнал-проводящие системы, как аденилатциклазный комплекс (АІД), осуществляющий превращение АТФ в цАМФ и фосфоинозитидный обмен (ФИ-обмен). Гидролиз фосфатидилинозитол-4-5-дифосфата осуществляется фосфолипазой С с образованием двух внутриклеточных сигнальных молекул: диацилглицерола и инозитол-1-4-5-трисфосфата (Berridge M.G., 1984). Диацилглицерол активирует протеинкиназу С, тогда как инозитол-трисфосфат осуществляет посредническую роль при освобождении внутриклеточного кальция из саркоплазматического ретикулума. В проведении сигнала от рецепторов гормонов или нейротрансмиттеров на аденилатциклазу и фосфолипазу С участвуют G-белки (Bockaert J. etal., 1987).
От функционирования всех звеньев сигнал-проводящих систем зависит как жизнедеятельность клеток в нормальных условиях, так и клеточная адаптация при изменении условий окружающей среды и регуляция метаболических процессов. В зависимости от природы активирующего стимула и типа клеток взаимодействие агониста с рецептором может приводить к таким явлениям, как клеточный рост (Hatzinger Р.В., Stevens J.L., 1989), клеточная дифференци-ровка (Black B.L., Smith J.E., 1989) или адаптация метаболизма клеток к изменившимся условиям ее существования, которая в некоторых случаях может привести к патологии. Превышение внешним (физическим или химическим) фактором пороговых величин, которые зависят от времени экспозиции и функционального состояния клетки, может привести к необратимым изменениям, например, при гипоксии (Trandroyen F.T. et al., 1992). Несмотря на различный конечный результат, процессы клеточной активации, адаптации и патологии часто вовлекают одни у те же биохимические процессы, однако неизвестно, играют ли в них самостоятельную ролі сигнал-проводящие системы.
Два жизненно важных фактора - давление и состав газовой среды - при изменении вели чин их определяющих при нормальных условиях, становятся экстремальными и вызывают каї специфические, так и неспецифические реакции организма (П.Бэр, 1878, Лазарев Н.В., 1941
Беннет П., 1975 и др.). Гипобария, приводящая к гипоксии, и гипербария, вызывающая гипе-роксию, а также проявляющая необычные свойства индифферентных при нормальном атмосферном давлении газов, - два полюса воздействия, в которые в силу естественных или искусственных обстоятельств может попасть живой высокоорганизованный организм, включая человека. Необходимо отметить, что при изменении параметров газовой среды в естественных условиях и при проведении комплексных моделируемых исследований с участием человека или в экспериментах на животных, как правило, трудно или невозможно выяснить первичные эффекты и клеточные механизмы возникновения и развития у человека и животных таких патологических состояний, как азотный наркоз, нервный синдром высоких давлений (НСВД), деком-прессионные расстройства и др. (Бресткин М.П., 1949, Зшіьцман Г.А., 1979).
Несмотря на довольно широкое использование различных биологических моделей в экспериментальных исследованиях, до настоящего времени не проводилось детального изучения состояния внутриклеточных посредников гормонального действия и их роли в реализации эффектов экстремальных факторов. Данные, имеющиеся в литературе по результатам изучения вторичных посредников при гипоксии разрозненны, так как эксперименты проводились в различных условиях и на разных типах клеток, что значительно затрудняет проведение сравнительного анализа. При действии повышенного давления были изучены лишь некоторые характеристики ионных токов, хотя мембранные изменения при высоком давлении предполагают модификацию мембранно-связанных систем, в том числе аденилатциклазной системы или интенсивности фосфоинозитидного обмена.
Цель работы. Целью настоящего исследования являлось выяснение роли систем внутриклеточных посредников в механизме адаптации клетки к таким изменяющимся физико-химическим факторам среды, как атмосферное давление и содержание кислорода, а также повышенное парциальное давление индифферентных газов в окружающей среде.
Исходя из этой цели были поставлены следующие задачи:
изучить изменение фосфоинозитидного обмена в культивируемых клетках под влиянием гипоксии in vitro, сопоставить клеточные эффекты гипоксии и кальций-мобилизующих агентов,
исследовать механизмы гомо- и гетерологической десенситизации клетки при действии кальций-мобилизующих агентов и гипоксии,
определить динамику изменений содержания циклических нуклеотидов в тканях и биологических жидкостях животных и человека в условиях недостатка кислорода,
изучить влияние имитационных длительных насыщенных погружений на различные глубины с использованием индифферентных газов (азота, гелия, аргона) на метаболизм и состояние мембран эритроцитов у человека,
сопоставить in vitro эффекты высокого гидростатического давления и высокого давления инертных газов на мембрану эритроцитов лабораторных животных,
исследовать динамику мембранного потенциала in vitro с использованием биологическої модели при компрессии,
изучить изменения фосфоинозитидного обмена в культивируемых клетках при ДЄЙСТВИ1 факторов гипербарии, сопоставить влияние высокого гидростатического давления, высокоп парциального давления инертных газов in vitro на проведение кальций-мобилизующего сиг нала в клетке.
Экспериментальные исследования выполнялись в рамках плановых НИР Института ме дико-биологических проблем, по Государственной программе «Мировой океан», Научнс технической программе по решению важнейших медико-биологических проблем ГКНТ, Феде ральной целевой научной программе фундаментальных и поисковых исследований Миннаук России, грантам РФФИ.
Научная новизна. В диссертационной работе на культуре клеток обнаружена активаци фосфоинозитидного обмена при гипобарической гипоксии и показано, что это приводит к гс мологической и гетерологической десенситизации клеток к кальций-мобилизующим агентам і Р-адренергической стимуляции. Экспериментально доказано существование одного из мех; низмов потери чувствительности Р-адренергической системы клеток при недостатке кислород; который включает в себя активацию протеинкиназы С в ответ на обратимую стимуляцию гщ ролиза фосфоинозитидов при гипоксии, действии кальций-мобилизующих агонистов, либо ні обратимую активацию этого фермента форболовыми эфирами. Впервые выявлены особенное! изменения содержания циклических нуклеотидов в тканях и биологических жидкостях живо ных и человека при острой и хронической гипоксии, а также участие циклазных систем в адаї тации организма к недостатку кислорода.
Экспериментально установлено, что высокое гидростатическое давление и высокое па циальное давление индифферентных газов (в диапазоне 3-Ю МПа) приводит к снижению чу ствительности культивируемых клеток сосудистой стенки человека к гистамину, серотонину брадикинину. Эта десенситизация носит фунюционачьный характер и исчезает после медленнс декомпрессии или периода последействия, равного периоду декомпрессии.
Проведенное исследование клинико-биохимических показателей крови человека п] глубоководных спусках методом насыщенных погружений с использованием различных и дифферентных газов (азота, гелия, аргона) в дыхательной газовой среде показало, что наблі даются начальные признаки изменения липидного обмена и дисфункции печени, выраженное которых зависит от длительности погружения и величины давления. При этом доказана при ципиальная возможность использования аргона в дыхательной газовой среде в гермозамкнуті объектах при нормальном и повышенном до 0,1 МПа давлении.
Впервые обнаружено, что при длительном имитируемом погружении на глубину более 200 м с использованием в качестве дыхательной газовой среды гелиокса происходит уменьшение поперечных и продольных размеров эритроцитов человека. Декомпрессия влечет за собой появление редко встречающихся в нормальных условиях необычных форм эритроцитов (эхино-циты, сфероциты и др.).
Практическая ценность работы. Предложенный в диссертации подход к анализу внутриклеточных сигнал-проводящих систем позволяет более полно выяснить чувствительность клетки к гормональным стимулам и оценить механизмы метаболической адаптации к экстремальным воздействиям различной природы. Данные о состоянии аденилатциклазной системы при гипоксии необходимо учитывать при назначении и подборе р-блокаторов и р-агонистов пациентам в условиях кислородной недостаточности.
По данным клинико-биохимических исследований крови показана безопасность длительного пребывания человека в кислородно-азотно-аргоновой среде при избыточном давлении 0-0,1 МПа. Биохимический анализ плазмы крови обследуемых после имитируемых спусков методом насыщенных погружений свидетельствует о том, что при медицинском обследовании водолазов и акванавтов необходимо особое внимание обращать на такие показатели, как уровень григлицеридов, холестерина и его фракций в плазме крови, поскольку длительное пребывание в условиях высокого давления приводит к повышению атерогенного риска. Кроме этого, необходимо отслеживать динамику активности таких органоспецифических ферментов, как ACT и АЛТ в плазме крови обследуемых после воздействия гипербарии, поскольку наши результаты свидетельствуют о возможном развитии дисфункции печени в этих условиях.
Для проведения экспериментальных исследованиях на биомоделях и животных по разработанным совместно с д.м.н. Б.Н.Павловым медико-техническим требованиям были созданы гипербарические комплексы, позволяющие моделировать условия высокого гидростатического давления и высокого давления инертных газов (ВГД-1, КОНиКМ).
С учетом результатов экспериментальных исследований действия факторов гипербарической среды в соавторстве с Б.Н.Павловым, В.В.Смолиным, Г.М.Соколовым разработаны два ГОСТа РФ «Гипербарическая среда обитания. Термины и определения» и «Предельно допустимые параметры гипербарической среды обитания». Результаты работы были использованы при подготовке и чтении курсов лекций «Космическая физиология и медицина», «Экологическая медицина» и спецкурсов «Барофизиология» и «Молекулярная эндокринология» для студентов факультета фундаментальной медицины МГУ.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на: VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии (1982); Всесоюзном симпозиуме
«Легочные артериальные гипертензии» (Фрунзе, 1988); IX, X, XI Всесоюзных конференциях по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва-Калуга, 1990, 1994, 1998); II, III и Y Международной конференции по биологии высокого давления (Франция, 1990, США, 1992, Россия, 1997); Международном совещании по патофизиологии (Москва, 1991); Всесоюзной конференции «Физиологические механизмы развития экстремальных состояний» (Санкт-Петербург, 1995); I Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996); Международном рабочем совещании по вегетативным нарушениям (Германия, 1996); IV Международной конференции «Биологическое действие высокого давления и биотехнология» (Германия, 1998); VIII Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва,1998); III Международной конференции "Гипоксия в медицине" (Москва, 1998); XYII Всероссийском съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998). Основное содержание диссертации отражено в 45 опубликованных в открытой печати работах.
Основные положения, выносимые на защиту:
Экстремальные факторы внешней среды (повышенное парциальное давление индифферентных газов, высокое гидростатическое давление, гипер- и гипоксия) приводят к полиморфной потере чувствительности клетки к сигналам различной природы (кальций-мобилизутощие агенты, (3-адренергнческие стимуляторы). В реализации механизмов десенситизации ведущую роль играют системы внутриклеточных посредников гормонального действия, активно осуществляя через систему обратных связей влияние на различные этапы проведения внешнего сигнала в клетку.
Воздействие гипобарической гипоксии in vitro имеет сходство с действием кальций-мобилизующих агентов; в обоих случаях после активации фосфоинозитидного обмена и повышения цитоплазматического кальция происходит десенситизация клеток к Р-адренэргическим агонистам и кальций-мобилизующим гормонам. Необходимым звеном внутриклеточной регуляции, через которое гипоксия меняет функционирование Са-мобилизующей и р-адрен-ергической систем, является протеинкиназа С.
Длительные погружения на различные глубины, судя по клинико-биохимическим показателям крови, не приводят к выраженным сдвигам метаболизма у человека, однако обнаруженные обратимые изменения ряда показателей указывают на возможную дисфункцию печени. В реализации клеточных эффектов в условиях гипербарии ведущую роль играет высокое гидростатическое давление per se. В электро-невозбудимых клетках независимо от состава газовой среды высокое давление, меняя структурно-функциональные свойства клеточной мембраны, нарушает проведение внешнего регуляторного сигнала в клетку.
Структура и объем диссертации. Диссертация содержит 290 страниц машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и библиографии. В диссертации содержится 27 таблицы, 5 фотографий и 26 графиков. Библиография включает 470 наименований (116 отечественных и 364 зарубежные работы).