Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Лазерное возбуждение УЗ импульсов в биологических средах. Особенности оптики биологических сред 13
1.1. Обзор литературы 13
1.2. Лазерное возбуждение УЗ в однородно поглощаюшей среде 19
1.3. Лазерное возбуждение УЗ в неоднородно поглощаюшей среде 25
1.4. Лазерное возбуждение УЗ в рассеивающей среде 28
1.5. Факторы, влияющие на формирование регистрируемого сигнала (дифракция, нелинейные эффекты, диссипация) 35
1.6.,, Метод передаточных функций и процедура деконволюции 44
1.6.1. Метод перадаточных функций 44
1.6.2. Процедура деконволюции .46
1.7. Два способа регистрации оптико-акустического сигнала 47
Глава 2. Лазерная оптико-акустическая диагностика в режиме на просвет 49
2.1. Лазерная оптико-акустическая диагностики в режиме на просвет 49
2.2. Схема лазерного оптико-акустического спектрометра в режиме на просвет 50
2.3. Тестовые и калибровочные эксперименты режиме на просвет , 53
2.4. Лазерная оптико-акустическая диагностика в режиме на просвет для исследования характеристик крови 59
2.4.1. Измерение эффективности термо-оптического преобразования крови 61
2.4.2. Концентрация интенсивности света под поверхностью в крови 65
2.4.3. Измерение оптических характеристик крови 67
2.4.4. Измерение скорости седиментации крови 75
Глава 3. Лазерная оптико-акустическая диагностика в режиме на отражение .81
3.1. Особенности опто-акустической диагностики в режиме на отражение .81
3.1.1. Оптико-акустический сигнал, возбуждаемый широким лазерным пучком (дифракция несущественна ) 84
3.1.2. Оптико-акустический сигнал, возбуждаемый лазерным пучком
конечного диаметра (дифракция вносит вклад в формирование импульса) 87
3.1.3. Экспериментальная проверка теории регистрации оптико-акустического сигнала в режиме «на отражении» 95
3.2. Реконструкция распределения тепловыделения по оптако-акустическому сигналу в режиме «на отражение» 98
3.3. Схема оптико-акустического рефлектометра .103
3.4. Оптико-акустическая диагностика слоистых сред 106
Глава 4. Сканирующий оптико-акустический микроскоп 113
4.1. Конфокальный оптико-акустический приемник, работающий в режиме на отражение 114
4.2. Неинвазивная диагностика рака слизистой оболочки ротовой полости при помощи оптико-акустической микоскопии 119
4.2.1. Обоснование возможности диагностики раковых образований при помощи оптико-акустической микроскопии 119
4.2.2. Материалы и методы 122
4.2.3. ОА-микроскопия слизистой оболочки щеки хомяков и сравнение полученных ОА-изображений с гистологическими образцами 123
4.3 Оптико-акустический мониторинг распространения различных веществ вглубь тканей. 126
4.3.1. Материалы и методы. 127
4.3.2. Распространение водного раствора пищевой краски в коагулированном белке куриного яйца 129
4.3.3. Распространение водных растворов пищевой краски в кожу свиньи ex-vivo 133
Заключение 140
Литература 142
- Лазерное возбуждение УЗ в рассеивающей среде
- Тестовые и калибровочные эксперименты режиме на просвет ,
- Оптико-акустический сигнал, возбуждаемый широким лазерным пучком (дифракция несущественна
- Обоснование возможности диагностики раковых образований при помощи оптико-акустической микроскопии
Лазерное возбуждение УЗ в рассеивающей среде
Оптико-акустический эффект это эффект возбуждения акустических сигналов в среде под действием переменного светового излучения. Хотя данный эффект был открыт А.Беллом в 1880 году [1], практическое использование его стало возможно лишь после разработки новых средств измерений. Первые применения этого эффекта для исследования поглощения газов и при создании приемников лучистой радиации [2,3] появились в середине XX века. Применение лазеров [4-7] в оптоакустике дало старт к бурному развитию этой области науки. В настоящее время в рамках исследования и применения оптико-акустического эффекта существует три независимых направления: фотоакустическая спектроскопия, лазерная оптоакустика и лазерный ультразвук.
Наибольшее развитие получила фотоакустическая спектроскопия (см., например, книги [6-8], обзор [9], а также [10-12]). Это направление начало активно развиваться после работы A.Rosencwaig, A.Gersho 1976 года [10] и на данный момент по нему опубликовано огромное количество монографий, обзоров и трудов конференций (см., например, [11-19]). В фотоакустической спектроскопии акустические волны возбуждаются модулированным непреврывным световым излучением (модуляция может быть по амплитуде, а иногда и по положению или по поляризации). Фотоакустический сигнал является, как правило, гармоническим и информацию о свойствах среды несут амплитуда и фаза сигнала. Для получения информации о пространственном распределении, например, поглощения света, варьируют частоту модуляции в широком диапазоне, что требует значительного времени. Кроме того, задача восстановления распределения неоднородностей встречает серьезные математические трудности [13].
Уровень оптико-акустического (ОА) сигнала пропорционален переменной части светового потока. Поскольку лазеры импульсного действия позволяют получать гораздо большие интенсивности излучения, чем лазеры непрерывного действия, получило развитие другое направление оптоакустической спектроскопии - генерация ОА-сигналов импульсным лазерным излучением или лазерная оптоакустика. Лазерная оптоакустика [20] предполагает возбуждение импульсным излучением широкополосных акустических сигналов и их детектирование с высоким временным разрешением. В этом случае информацию о процессе взаимодействия излучения с веществом несет как амплитуда возбуждаемого сигнала, так и его временной профиль. При помощи лазерной оптоакустики могут исследоваться такие тонкие эффекты взаимодействия излучения с веществом как, например, лазерно-индуцированные фазовые переходы [21,22], абляция и т.д. (см., например, [23-26]). Лазерная оптоакустика позволяет исследовать распределение интенсивности света в веществе, неоднородности поглощения света и тепловыделения в различных средах [27-29]. При этом задача восстановления распределения неоднородностей сводится к классической томографии и может быть решена аналитически [29]. Кроме того, возможность исследования распределения интенсивности света в среде по профилю возбуждаемого акустического сигнала, позволяет получать гораздо более точные данные, чем использование абсолютных измерений, на которые могут сильно влиять изменения любого параметра измерительной системы (начиная от замены приемной части и заканчивая примесями на поверхности исследуемого объекта). Уже первые теоретические и экспериментальные работы, посвященные возбуждению акустических сигналов лазерным импульсным излучением, показали, что импульсный режим возбуждения позволяет получать мощные широкополосные звуковые импульсы [30-34]. Импульсной оптоакустике посвящены многочисленные работы (см., например, [20-39]).
Лазерно-ультразвуковой метод контроля использует генерацию звука лазерным импульсом, поглощаемым в тонком поверхностном слое исследуемой среды (или в специальном оптико-акустическом генераторе, расположенном на поверхности среды). При этом возбуждаемый ультразвуковой импульс распространяется в среде и регистрируется либо прошедший, либо рассеянный ультразвуковой сигнал с высоким временным разрешением. Это направление сродни ультразвуковому неразрушающему контролю и эхоскопии. Лазерный ультразвук отличается от них только лазерной генерацией коротких и мощных апериодических ультразвуковых импульсов, которые недоступны обычным ультразвуковым излучателям. Поскольку ультразвуковые преобразователи в случае лазерного ультразвука работают только на прием, это позволяет оптимизировать их режим работы и обеспечить необходимую эффективность приема и высокое временное разрешение. Этому направлению посвящены работы [40-42].
Тестовые и калибровочные эксперименты режиме на просвет ,
Случай регистрации сигнала в режиме на просвет широко изучен теоретически и экспериментально [20,29,51]. Как уже обсуждалось в главе 1, оптико-акустическая спектроскопия в режиме на просвет заключается в возбуждении импульсным лазерным излучением широкополосных акустических сигналов в исследуемой среде и регистрации профиля оптико-акустического сигнала с высоким временным разрешением. При этом, по регистрируемому профилю могут быть определены такие оптические коэффициенты как коэффициент поглощения, затухания и приведенный коэффициент рассеяния света на длине волны лазерного излучения. При использовании нескольких длин волн пробного излучения, возможно получение спектров оптических коэффициентов. В этом варианте ОА-диагностики лазерный луч направляется на поверхность исследуемой среды через прозрачную среду, граничащую с передней поверхностью исследуемой среды, а приемник акустических сигналов находится в контакте с тыльной поверхностью (см. Рис. 1.5а.)
Первые теоретические и экспериментальные результаты продемонстрировали, что определение оптических коэффициентов возможно по возбуждаемому в среде оптико-акустическому сигналу [20,45,51,52,81]. Теоретические и экспериментальные результаты, накопленные в 70- х и 80- х годах прошлого века создали основу оптико-акустической спектроскопии биологических сред. В последние 5 лет оптико-акустическая спектроскопия биологических сред развилась в отдельную область науки. Материалы конференций Biomedical Optoacoustic могут дать представление что из себя представляет современная оптико-акустическая спектроскопия биологических сред. Многочисленные применения оптико-акустической спектроскопии в режиме на просвет для исследования различных биообъектов можно найти в книгах [43,49,82] и публикациях [25,26,29,45,54,81].
В данной главе описаны результаты исследования крови методом оптико-акустической спектроскопии напросвет .
Импульсы лазера 1 попадают на делительную пластину 2 и частично ( 8%) отводятся на фотодиод 3. Сигнал с фотодиода используется для контроля формы лазерного импульса и синхронизации работы системы. Излучение, прошедшее пластину 2, далее проходит через гомогенизирующую пластину 4, который используется для создания гладкого гауссовского поперечного распределения интенсивности в лазерном пятне. Далее часть излучения ( 8%) отводится делительной пластиной 5 на измеритель энергии 6, снабженной калиброванной диафрагмой, что позволяет контролировать плотность энергии лазерного излучения в каждом импульсе. При помощи поворотной призмы 7 лазерное излучение направляется через диафрагму 8 на оптико-акустическую ячейку 9. Диафрагма 8 позволяет изменять диаметр пятна от 2 мм до 20 мм. Электрический сигнал с оптико-акустической ячейки 9 подается на осциллограф 10 (модель TDS-220, Tektronics). Далее полученный оптико-акустический сигнал обрабатывается на персональном компьютере. Импульсное излучение ND-YAG лазера (SpectraPhysics Со.) на трех различных длинах волн А=1064 nm, 532 nm и 355 nm использовалось для исследования оптических коэффициентов крови. Длительности лазерных импульсов на данных длинах волн были 2ri=14ns, 1 3 ns и 12 ns соответственно. Импульсное излучение Alexandrite лазера (Schwartz Electro-Optics, Orlando, FL, USA) на =757 nm (2r =60 ns) а также лазера HO-YAG (Schwartz Electro-Optics, Orlando, FL, USA) с длительностью 2тЛ=200 ns использовалось для исследования биологических объектов.
Фотодиод 3 (Thorlabs Со.) имел скорость нарастания lns. Темновой ток- 2.5 нА. Измеритель лазерной энергии б позволяет проводить измерения в диапазоне от 10 f-iJ до 100 мДж. Осциллограф 10 имел полосу 100 МГц и время нарастания переходной характеристики 3.5 не, что позволяло корректно отображать импульсы с длительностью более 10 не.
Схема оптико-акустической ячейки представлена на Рис. 2.2. Лазерное излучение проходит через прозрачное стекло 11. Прозрачное стекло позволяет проводить измерения в режиме близком к жесткой границе (7V=10). Измерения, проводимые в случае жесткой границы, имеют ряд преимуществ перед измерениями при свободной границе. Во-первых, для корректной регистрации возбуждаемого оптико-акустического сигнала необходимо соблюдение условия параллельности плоскости чувствительного элемента акустического приемника и плоскости фазового фронта акустической волны. В случае жесткой границы это условие достаточно легко обеспечивается. Во-вторых, закрепленная граница позволяет содержать исследуемую среду в герметичных условиях. Иногда условие герметичности становится критичным для биологических сред (см. далее п. 2.4.2) Еще одно условие, необходимое для оптико-акустической спектроскопии для правильной регистрации сигнала -акустический приемник должен иметь разрешение по крайней мере не хуже, чем длительность лазерного импульса. Нами использовались широкополосные акустические приемники WAT-13 и WAT-21.
WAT-13 имеет частотный диапазон до 100 МГц, что позволяет регистрировать сигналы с разрешением не хуже чем 3 не, Зависимость чувствительности данного приемника от частоты приведена ниже на Рис.2.3. WAT-21 имеет диапазон до 30 МГц, при этом его средняя чувствительность равна 0.1 мВ/Па. Кривая спектральной амплитуды
Оптико-акустический сигнал, возбуждаемый широким лазерным пучком (дифракция несущественна
Оптико-акустическая спектроскопия используется для исследования оптических свойств различных сред уже достаточно продолжительное время (см. [20,29,36,43,53-56,81,93]), однако, оптико-акустическая диагностика в режиме на отражение начала развиваться совсем недавно. Толчком к развитию этого направления стало исследование биологических сред [29,111-115]. Большинство диагностических применений, например, исследование рака кожи и слизистых оболочек, лазерная хирургия или только начавшая развиваться область оптико-акустического мониторинга характеристик крови (см. п. 2.4.2), требуют методики, способной неинвазивно исследовать среду при одностороннем доступе к исследуемой поверхности.
Схема оптико-акустической спектроскопии в режиме на отражение приведена на Рис. 1.56. В режиме на отражение приемник акустических сигналов находится с той же стороны от облучаемой поверхности, что и лазерный луч.
Механические напряжения, возбуждаемые лазерным импульсом, описываются выражениями (1.2) (см., например, [29]). Однако, как показано в [29], детектируемые сигналы для случаев регистрации в режиме на просвет и на отражение различны (см. (1.33) и (1.34)).
Теоретический анализ возбуждаемого бесконечно коротким лазерным импульсом акустического сигнала, распространяющегося в прозрачную среду, дан в работах [37,116]. При этом спектр продольной волны, распространяющейся в прозрачную среду, описывается выражением: где p- плотность, Cp- теплоемкость, /?- коэффициент объемного расширения поглощающей среды, соас= MacQ характерная частота возбуждаемых ультразвуковых импульсов, jua - коэффициент поглощения света исследуемой среды, (Оj - /ла х -характерная частота, на которой длина тепловой волны равна глубине проникновения света в среду, х= температуропроводность. Безразмерные параметры: РосР N = —0__ отношение акустических импедансов поглощающей и прозрачной сред ( /г ptrctr указывает на то, что параметр относится к прозрачной среде), параметр b = plr-\jxtr -{P-Jx) характеризует вклады теплового расширения в формирование оптико-акустических сигналов в прозрачной и поглощающей средах, R PUср"V%tr (рСр хУ отношение тепловых потоков на границе прозрачной и с} поглощающей сред, /3 = /9(1 —)- эффективный коэффициент теплового расширения, 3 с1 а с/ и сг скорости продольной и сдвиговой акустических волн, соответственно. STF -передаточная функция термооптических источников, которая зависит лишь от параметров исследуемой среды.
Теоретический анализ возбуждаемых лазерным импульсом акустических напряжений приведен в данной главе в частотном представлении. Как будет показано ниже, данное представление удобнее чем временное для объяснения сложных процессов, сопровождающих возбуждение и распространения акустических импульсов. Но, что более важно, при помощи частотного представления гораздо проще объяснить процедуру выделения спектральной передаточной функции из регистрируемого сигнала. А нашей главной целью является получение именно характеристик среды, то есть ее передаточной функции (в частотном или во временном представлении). Все приведенные ниже теоретические результаты можно привести к временному представлению, используя обратное Фурье преобразование.
Выражение (3.1) было получено для однородно поглощающей среды. Подобное выражение может быть получено для возбуждения ОА-сигнала в мутной среде (подобной биологической среде или эмульсии) [29,53]. В случае оптически рассеивающей среды, глубина проникновения света зависит не только от коэффициента поглощения, но и от коэффициента рассеяния [58,59]. Поэтому, полоса ультразвуковых частот, эффективно возбуждаемых лазерным импульсом в рассеивающей среде, будет определяться коэффициентом затухания света.
Выражение (3.1) еще раз демонстрирует, что спектр возбуждаемого ОА-сигнала является произведением спектра интенсивности лазерного импульса IQL(CO) И передаточной функции термооптических источников STF, которая зависит лишь от свойств самой среды (см. пункт 1.6): (і) теплового потока через границу прозрачной и поглощающей сред; (ii) оптических характеристик поглощающей среды; (iii) отношения акустических импедансов; Частоты в области соас представляют акустические волны, которые эффективно
Как было показано в пункте 1.5, регистрируемый сигнал отличается от сигнала, возбуждаемого бесконечно коротким лазерным импульсом. Основными факторами, ответственными за отличие регистрируемого сигнала, как было показано в пункте 1.5, являются конечная длительность лазерного импульса и изменения за счет дифракции, сопровождающие распространение акустического сигнала. Теоретический анализ акустических сигналов, регистрируемых в режиме на отражение при различных экспериментальных условиях, приведен впервые в работе [77]. Рассмотрим основные предельные случаи, важные для понимания экспериментальных результатов.
Обоснование возможности диагностики раковых образований при помощи оптико-акустической микроскопии
Таким образом видно, что данная процедура позволяет получить информацию о распределении термооптических источников не только качественную, но и количественную. Пример восстановления тепловых источников в модельной двухслойной среде позволяет надеяться, что и биологическая слоистая среда может быть исследована при помощи широкополосной оптико-акустической микроскопии в режиме на отражение .
В качестве биологической слоистой среды были исследованы слизистые оболочки щек хомяков (Syrian Golden Hamsters). Нормальная (здоровая) слизистая оболочка щеки хомяка состоит из четырех слоев. Первый наружный слой- epithelium, следующий за ним слой- lamina propria, третий по счету слой- muscle fiber mucosa и, наконец, последний слой- submucosa connective tissue. Толщины слоев меняются от особи к особи и в зависимости от размера животного, но общая толщина всех четырех слоев слизистой оболочки редко бывает более 600 urn. Более подробно структура слизистой оболочки щеки хомяка, а также детальное описание процедуры оптико-акустической микроскопии будут рассмотрены в главе 4. Здесь же остановимся лишь на обсуждении полученных оптико-акустических сигналов и применении процедуры деконволюции. Оптико-акустическая микроскопия слизистой оболочки щеки хомяка проводилась на второй гармонике ND-YAG лазера ((SpectraPhysics Со.) Х=532 нм, TL=6.5 не). Поверхность приемника FST-10 прикладывалась к щеке хомяка. Между поверхностью приемника и щекой был слой воды для обеспечения акустического контакта между ними.
ОА-сигнал, возбуждаемый в нормальной слизистой оболочке щеки хомяка и регистрируемый в режиме на отражение приемником FST-10, приведен на Рис.3.17. ОА-сигнал, возбуждаемый в слизистой оболочке щеки хомяка и регистрируемый в режиме на отражение приемником FST-10. 1,2,3,4 - ОА- сигналы, соответствующие внутренним слоям слизистой оболочки
Поскольку сама поверхность приемника является прозрачной непоглощающей средой, то, по-видимому, что какой-то поглотитель (например, грязь) вызывают данный сигнал. Между данным сигналом и следующим пиком ( z=110 им) существует область слабого поглощения, поскольку сигнал в данной области практически равен нулю. Очевидно, эта область соответствует слою воды, обеспечивающей акустический контакт между приемником и поверхностью щеки. Сильное поглощение представлено пиками 1 (z-110 им), 2 (z=215 рм), 3 (z=378 им), 4 (Z=478UM). ВИДНО, что каждый из сигналов подвергся влиянию дифракции, поскольку имеет отрицательную часть. К сигналу, данному на Рис.3.17, была применена процедура деконволюции. Результирующее распределение термооптических источников приведено на Рис.3.18. В качестве р Гф был использован сигнал, возбуждаемый в растворе красного пищевого красителя. Коэффициент поглощения данного раствора на длине волны 532 нм был равен Ц.а = 2000
Так как длительность лазерного импульса для данного лазера на второй гармонике равна TL=6.5 не, следовательно, соотношение juaCQTL=\.95 и соотношение Mac0rL \ выполняется. Форма ОА-сигнала, используемого в качестве Preference практически не отличается от той, что приведена на Рис.3.9. Распределение тепловых источников, полученное после процедуры деконволюции, показано на Рис.3.18. ш
Видно, что все особенности сигнала, приведенного на Рис.3.17 сохранились: поверхности приемника соответствует небольшой пик в точке z=0; ярко выраженные четыре пика на тех же самых глубинах, что и в начальном сигнале. Однако есть и различия. Во-первых, данное распределение не содержит отрицательных сигналов, поскольку оно является распределением термооптических источников. Во-вторых, в области между поверхностью приемника и пиком 1, тепловые источники не равны нулю, что, очевидно, связано с присутствием какого-то слабого поглотителя в воде, выполняющей роль акустически связывающей жидкости. Это может быть объяснено тем, что часть грязи с поверхности щеки хомяка попала в слой воды, что и создало дополнительный поглотитель. В-третьих, видно, что спад каждого сигнала близок к экспоненциальной зависимости. Особенно хорошо это видно на сигнале 2, экспоненциальная аппроксимация спада которого показана дополнительно пунктирной линией. Реально, каждый из слоев является сложным неоднородным объектом (см. далее Главу 4 и гистологические описания слоев), поэтому нельзя ожидать, что спад сигнала будет представлять собой идеальную экспоненциально затухающую зависимость такую же, как для случая однородной среды (см. Рис.3.13). Однако усредненный показатель коэффициента затухания для каждого слоя найти можно. Так, для epithelium (слой 1) - jile/r =540±45 см"1 ; для lamina propria (слой 2) juejr=2\5±\\ см"1 ,3 слой - muscle fiber mucosa имеет //e r=325±88 см"1 , наконец, для последнего слоя ubmucosa с ormective t issue - jue/r =96±46 см"1 . Напомним лишь, что данные оптические коэффициенты были получены на длине волны 532 нм. Слизистая оболочка щеки хомяка вся пронизана кровеносными сосудами. Поскольку гемоглобин является сильным поглотителем на длине волны 532 нм, а экспериментальное изучение слизистой оболочки проводилось in vivo, то, очевидно, что основной вклад в поглощение внесла именно кровь, которая присутствовала в каждом слое. Для других длин волн оптические коэффициенты слоев будут отличаться от приведенных здесь. К сожалению, в литературе отсутствуют данные об оптических свойствах слоев слизистой оболочки, поэтому сравнить полученные результаты не с чем. Данное подробное описание и объяснение регистрируемых сигналов и восстановленного распределение термооптических источников было приведено для того, чтобы наглядно объяснить процедуру получения двумерных оптико-акустических изображений, описанную в
