Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Лазерная инженерия соединительных тканей 19
1.1. Исторический экскурс 19
1.2. Лазерная термопластика перегородки носа и ушной раковины
1.2.1. Строение и физико-химические свойства хрящей 23
1.2.2. Изменение формы хрящей при лазерном нагреве 27
1.2.3. Эксперименты in vivo. Режимы лазерного облучения 30
1.2.4. Практика лазерной коррекции формы хрящей 37
1.2.5. Разработка аппаратуры для лазерной термопластики хрящей 41
1.3. Лазерная инженерия грудино-реберного комплекса (ГРК) 45
1.3.1. Деформации грудной клетки и актуальность лазерной термопластики ГРК 45
1.3.2. Температурные поля, индуцируемые в реберном хряще лазерным излучением 48
1.3.3. Неустойчивость нагрева при малом коэффициенте поглощения 53
1.3.4. Релаксация механических напряжений и стабильность новой формы 54
1.3.5. Лазерное стереолитографическое моделирование ГРК 58
1.4. Лазерная пластика поверхностной мышечно-фасциальной системы (ПМФС) 61
1.4.1. Актуальность лазерного лифтинга ПМФС 61
1.4.2. Динамика лазерного нагрева и физических свойств ПФМС 62
1.4.3. Физико-химические свойства жировой ткани и их изменени 65
1.4.4. Гистологические исследования 68
1.4.5. Эксперименты in vivo и клинические испытания 69
1.5. Лазерная обработка костной ткани 71
1.5.1. Лазерное формирование отверстий в костной ткани для стапедэктомии 71
1.5.2. Генерирование акустических волн в костной ткани при лазерной абляции 76
1.5.3. Лазерная карбонизация костной ткани 78
1.5.4. Динамика оптических свойств костной ткани в ходе лазерного облучения 85
Заключение к Главе 1 95
Глава 2. Физико-химические процессы при умеренном лазерном нагреве хрящей 96
2.1. Основные типы лазерной термо-модификации биотканей 96
2.2. Диффузионно-лимитированные термо процессы 101
2.2.1. Лазерный нагрев хрящевой ткани. Экспериментальные результаты 101
2.2.2. Моделирование массопереноса при лазерном нагреве 102
2.2.3. Термодиффузия воды в хрящевой ткани 107
2.2.4. Структурные изменения в хрящах как диффузионно-лимитированный процесс 111
2.3. Динамика физико-химических свойств хрящей 115
2.3.1. Релаксация механических напряжений 115
2.3.2. Усадка и изменение формы поверхности 119
2.3.3. Динамика отражения и пропускания света 120
2.3.4. Термохимические изменения в хрящевой ткани 125
2.4. Динамика оптических параметров биологических тканей при лазерном нагреве 127
2.4.1. Методы измерения оптических параметров биологических тканей 127
2.4.2. Прямая и обратная задачи распространения света в биотканях 131
2.4.3. Оптические параметры хрящей на длине волны 1.56 мкм при лазерном нагреве 140
2.4.4. Коэффициенты поглощения хряща и роговицы глаза при лазерном нагреве в диапазоне длин волн 2.2-8.5 мкм 150
Заключение к Главе 2 153
Глава 3. Управляемый лазерный нагрев биологических тканей и его применения 156
3.1. Моделирование температурного поля, индуцируемого лазерным излучением 156
3.1.1. Тепловая задача при лазерном нагреве биотканей 156
3.1.2. Описание разностной схемы 157
3.1.3. Алгоритм расчета 160
3.1.4. Температурное поле в хрящевой ткани при изменении оптических параметров 162
3.2. Бесконтактное измерение теплофизических и оптических параметров биологических
тканей и материалов 163
3.2.1. Подходы к измерению температуропроводности, удельной теплоемкости и эффективного коэффициента поглощения 163
3.2.2. Расчет температурного поля и решение обратной задачи 166
3.2.3. Практическая реализация методики 167
3.2.4. Оптимизация измерений и анализ погрешности 170
3.3. Разработка оптических и теплофизических эквивалентов биологических тканей 174
3.3.1. Физические эквиваленты биологических тканей 174
3.3.2. Синтез ПАА гидрогелей 176
3.3.3. Теплофизические и оптические параметры хрящевой ткани и ПАА гидрогелей 176
3.4. Лазерный нагрев биологических тканей по заданному сценарию 181
3.4.1. Лазерный нагрев с обратной связью 181
3.4.2. Расчет температурного поля в условиях работы ПИД-регулятора 183
3.4.3. Оптимизация параметров ПИД-регулятора 186
3.4.4. Реализация лазерного нагрева с обратной связью 192 3.5. Возможности дистанционной лазерной калориметрии в открытой системе 193
3.5.1. Динамика изменения мощности лазера при нагреве с постоянной скоростью 193
3.5.2. Моделирование температурного поля в условиях протекания энергоемких процессов... 194
3.5.3. Варианты реализации лазерной калориметрии 197
Заключение к Главе 3 198
Глава 4. Рефлектометрия биотканей 200
4.1 Спеклометрия термической модификации биотканей 200
4.1.1. Динамика спеклов при лазерном нагреве хрящей 200
4.1.2. Автоматизированная спеклометрия диффузно отраженного света при лазерном нагреве биотканей 205
4.1.3. Спеклометрия лазерного нагрева биотканей с помощью волоконного жгута 209
4.1.4. Анализ кинетики термической модификации биотканей 212
4.2. Рефлектометрия анизотропных тканей 215
4.2.1. Литературные сведения и постановка задачи 215
4.2.2. Материалы и методы 216
4.2.3. Контуры равной интенсивности 219
4.2.4. Сравнение теории с экспериментом 222
4.2.5. Влияние вектора поляризации 225
4.3. Поляриметрическая визуализация структур биотканей 227
4.3.1. Постановка задачи и краткий обзор литературы 227
4.3.2. Визуализация текстуры кожи при раннем фиброзе 229
4.3.3. Математическая обработка поляризационных изображений 231
4.3.4. Разработка поляризационной аппаратуры 236
Заключение к Главе 4 240
Глава 5. Оптическая модель биологической ткани 243
5.1. Рассеяние света в случайно-неоднородной двухфазной среде 243
5.2. Распределение фотонов между фазами среды 250
5.3. Коэффициент анизотропии 251
5.4. Матрица рассеяния неоднородной двухфазной среды 252
Заключение к Главе 5 254
Выводы к диссертации 255
Список сокращений 257
Благодарности 257
Список литературы
- Строение и физико-химические свойства хрящей
- Структурные изменения в хрящах как диффузионно-лимитированный процесс
- Подходы к измерению температуропроводности, удельной теплоемкости и эффективного коэффициента поглощения
- Спеклометрия лазерного нагрева биотканей с помощью волоконного жгута
Введение к работе
Актуальность темы. Интенсивное развитие квантовой электроники и лазерной техники в последние десятилетия предопределило создание ряда медицинских технологий с использованием лазерного излучения. Лазерное воздействие на биоткани позволяет осуществлять модификацию их физико-химических параметров и достигать лечебного результата, который зависит от параметров излучения - длины волны, длительности воздействия, плотности энергии и др.
Часто при лазерных операциях требуется локализовать температурное поле в заданной зоне внутри биоткани. Это позволяет минимизировать повреждения в примыкающих областях. Температурное поле, инициируемое лазерным излучением в биотканях, является неоднородным и нестационарным. Оно зависит от светового поля внутри ткани, коэффициента поглощения, теплоемкости, температуропроводности, граничных условий и др. При заданных характеристиках среды сценарий нагрева ткани однозначно определяется пространственно-временным распределением плотности мощности лазерного излучения. Этот сценарий существенно усложняется при изменении оптических и теплофизических свойств тканей в процессе лазерного воздействия. Тогда лазерное воздействие может стать неустойчивым и трудно контролируемым. Например, карбонизация биоткани приводит к резкому увеличению поглощения излучения, что вызывает перегрев и дальнейшее ускорение ее разрушения. Денатурация белков, испарение воды при локальной лазерной гипертермии вызывают также изменение оптических свойств и рост глубины проникновения излучения, что может привести к повреждению близлежащих тканей. Для разработки соответствующих лазерных медицинских технологий требуется глубокое понимание микро- и макроскопических процессов, инициируемых лазерным излучением в биотканях. Лишь в этом случае можно выявить физические параметры, отражающие состояние биотканей в ходе лазерной процедуры, с помощью которых можно автоматически изменять мощность лазера при достижении определенных условий. Развитие информационных технологий открыло возможности использовать в качестве управляющих параметров сложные функционалы измеряемых физических полей, связанных с лазерно-индупированными процессами в биотканях, и на этой основе создавать надежные системы контроля их состояния.
Поэтому актуальными задачами являются исследования процессов, инициируемых лазерным излучением в различных биологических тканях, а также разработка автоматизированных лазерных медицинских систем, осуществляющих неин-вазивную диагностику оптических и теплофизических характеристик биоткани в реальном времени и варьирующих условия облучения по заданным сценариям. Цели работы.
-
Исследование термических процессов, инициируемых в соединительных тканях при лазерном воздействии.
-
Разработка методов неразрушающей диагностики состояния биологических тканей в реальном времени.
-
Определение измеряемых характеристик состояния соединительных тканей, способных служить основой для разработки интеллектуальных лазерных медицинских систем с обратной связью.
Для достижения поставленных целей были сформулированы и решены сле-
дующие задачи:
Анализ процессов в хрящевых тканях при лазерном нагреве и определение контролируемых параметров, связанных с релаксацией напряжений в хряще, а также разработка систем обратной связи для лазерной коррекции формы хрящей, позволяющих в реальном времени осуществлять контроль состояния ткани и управлять мощностью лазерного излучения.
Определение параметров лазерного термического воздействия на цельные реберные хрящи для стабильного изменения их формы в условиях коррекции врожденных деформаций грудной клетки детей.
Разработка метода измерения оптических и теплофизических параметров биологических тканей на основе радиометрии при лазерном нагреве и компьютерного моделирования создаваемого температурного поля.
Разработка оптического и теплофизического эквивалента хрящевых тканей для моделирования температурных полей, индуцируемых лазерным излучением и калибровки лазерной медицинской аппаратуры.
Измерение оптических параметров хрящевых тканей и исследование их динамики в условиях лазерного нагрева и релаксации напряжений.
Определение и анализ поведения статистических характеристик спеклов, образующихся при отражении зондирующего пучка поляризованного света от хрящей при лазерном нагреве, разработка методики и инструментария для определения момента достижения релаксации механических напряжений.
Разработка методики определения параметров пропорционально-интегрально-дифференциального (ПИД) регулятора мощности лазерного излучения для нагрева биотканей с минимальными отклонениями температуры от заданной и исследование возможностей такого нагрева для диагностики биотканей.
Определение оптимальных условий для лазерной стапедопластики методом лазерной абляции костных тканей с целью минимизации амплитуды акустических волн и увеличения скорости абляции.
Выявление поляризационных, спектроскопических и радиометрических характеристик кожи человека при послойной абляции излучением Er:YAG лазера (к=2.97 мкм) для контроля допустимых доз воздействия.
Исследование сокращения поверхностной мышечно-фасциальной системы (ПМФС) при лазерном нагреве in vitro и in vivo и выявление безопасных режимов для лазерной термопластики.
Выявление факторов, характеризующих оптическую анизотропию биотканей по распределениям интенсивности диффузно отраженного света.
Разработка коррелометрической методики проявления скрытой текстуры биотканей по поляризационным изображениям и автоматизированной компактной камеры для видеорефлектометрии биологических тканей.
Разработка оптической модели биотканей как двухфазных сред со случайно ориентированными границами раздела и получение аналитических выражений для фазовой функции рассеяния и матрицы рассеяния, учитывающих вероятность локализации излучения в различных фазах.
Научная новизна работы.
В диссертации разработан новый подход к управляемому изменению формы хрящевой ткани, основанный на ее локальном лазерном нагреве. Определены режимы изменения формы ряда соединительных тканей (хрящей перегородки носа и ушной раковины, реберного хряща, мышечно-фасциальной системы). Показано, что при
достижении условий лазерно-индуцированной релаксации напряжений в хряще наблюдаются характерные экстремумы интенсивности зондирующего света, а также статистических параметров спекл-картин. Эти особенности использованы при создании систем обратной связи для безопасного проведения лазерной коррекции формы хряща. Разработана оригинальная аппаратура для осуществления контролируемой лазерной коррекции формы перегородки носа человека, прошедшая клинические испытания и успешно используемая в медицинской практике. Показана возможность лазерной термопластики реберных хрящей толщиной до 10-12 мм для лечения врожденных деформаций грудной клетки детей. Определены оптимальные режимы лазерной термопластики поверхностной мышечно-фаспиальной системы человека.
Определены оптимальные параметры излучения эксимерных лазеров для ста-педэктомии; исследовано влияние термических и фотохимических реакций, инициируемых в костной ткани, на пороги ее абляции.
Разработана методика бесконтактного измерения оптических и теплофизиче-ских характеристик биотканей с помощью лазерного нагрева и радиометрического контроля температурного поля на поверхности образца; создан оптический и теп-лофизический эквивалент хряща на основе полиакриламидного гидрогеля для моделирования температурных полей при лазерном нагреве хрящевых тканей и калибровки лазерной медицинской аппаратуры.
Разработан метод оптимизации параметров ПИД регулятора мощности излучения лазера для нагрева локальной области среды с минимальными отклонениями температуры от заданного сценария. Метод основан на численном решении нестационарной задачи нагрева лазерным излучением, мощность которого управляется ПИД регулятором. Исследованы потенциальные возможности системы, включающей управляемый лазерный нагрев с радиометрическим контролем температуры, для биомедицинских применений и для калориметрии энергоемких термических процессов в открытых системах.
Определены оптические параметры (коэффициенты поглощения, рассеяния и анизотропии рассеяния хрящевой ткани на длине волны 1.56 мкм) с использованием интегрирующих сфер и решения обратной задачи переноса излучения в среде. Выявлено изменение этих параметров при лазерном нагреве образца до 70 С и установлено, что коэффициент поглощения уменьшается на 24%. Это дает заметную поправку в температурное поле (~10С), что необходимо учитывать при планировании операций с использованием лазеров.
Экспериментально исследовано распространение сфокусированного поляризованного пучка света в оптически неоднородной анизотропной фибриллярной среде. Показано, что контуры равной интенсивности света, диффузно отраженного от среды, имеют вид эллипсов, одна из осей которых вытянута вдоль фибрилл. Вблизи точки входа пучка света в среду большая полуось контура равной интенсивности направлена перпендикулярно фибриллам, отношение полуосей эллипса зависит от направления вектора поляризации зондирующего света и степени ориентированности фибрилл. При удалении от точки входа в среду большая полуось эллипса вытягивается вдоль фибрилл, а отношение полуосей перестает зависеть от поляризации зондирующего света.
Разработан метод выявления скрытой текстуры биологических тканей из кросс-поляризованных изображений путем преобразования в коэффициенты корреляции всех возможных подматриц по отношению к шаблонной подматрице, а
также компактная видеосистема, позволяющая последовательно захватывать два кадра с ортогональными поляризациями и осуществлять анализ скрытых текстур.
Предложена оптическая модель биоткани как неоднородной среды, состоящей из органической компоненты и внутритканевой жидкости со случайно ориентированными границами между ними; получены аналитические выражения для фазовой функции рассеяния, матрицы рассеяния и распределения фотонов между компонентами среды. Полученные выражения позволяют описывать состояние поляризации распространяющегося в биоткани света и предсказывают более реалистичное поведение фотонов при малых углах рассеяния по сравнению с известной функцией Хеньи-Гринштейна.
Исследованы особенности ПК спектров и радиометрического отклика кожи человека при послойной абляции излучением Er:YAG лазера. Наблюдаемые изменения могут служить критерием толщины удаленного слоя кожи, обеспечивающим безопасность процедуры лазерного омоложения.
Защищаемые положения:
-
Эффективная и безопасная термопластика соединительных тканей может быть обеспечена с помощью лазерно-информационных систем, включающих локальный нагрев ткани, измерения температурного поля, временного и пространственного распределения интенсивности зондирующего света, компьютерную обработку измеряемых параметров и математическое моделирование световых и температурных полей.
-
Высокая скорость абляции биотканей (кожа, кость) при высоком качестве поверхности в зоне воздействия, а также минимизация побочного действия генерируемых акустических волн, могут быть обеспечены с помощью лазерно-информационной системы, включающей импульсный лазер, датчики амплитуды акустических волн, измерители ПК радиометрического отклика и ИК-Фурье спектров.
-
Кросс-корреляционный анализ поляризационных цифровых изображений биотканей и анализ контуров равной интенсивности отраженного света позволяют выявить их скрытую текстуру и степень оптической анизотропии.
-
Лазерно-информационные системы, включающие ПК термографию температурного поля поверхности объекта, компьютерное моделирование лазерно-индуцированных температурных полей и оптимизированный модуль обратной связи, позволяют реализовать локальный нагрев объекта с минимальными отклонениями от заданного сценария при плавном изменении мощности излучения.
-
Оптические и теплофизические параметры твердых материалов, энергоемкость термических процессов в открытых системах можно измерять дистанционно с помощью программируемого лазерного нагрева при контроле динамики температурного поля и мощности лазерного излучения.
Практическая значимость.
Полученные в диссертации результаты позволяют определить физические характеристики состояния биоткани при лазерном нагреве и обеспечить максимальную эффективность и безопасность соответствующих медицинских процедур. Они были использованы для выявления характеристических параметров, с помощью которых можно управлять мощностью лазерного излучения, при коррекции формы и регенерации ряда биологических тканей. Метод бесконтактного измерения коэффициента поглощения, температуропроводности и теплоемкости биотканей и био-
материалов был использован при разработке оптического и теплофизического эквивалента хряща, позволяющего моделировать температурные поля при лазерном нагреве. Такой эквивалент стал удобным материалом для калибровки лазерной медицинской аппаратуры, используемой при септохондрокоррекции.
Предложены лазерно-информационные системы, позволяющие нагревать биоматериалы по заданному сценарию и строго контролировать индуцируемые тепловые процессы. Это открывает новые возможности для диагностики материалов, например, для калориметрии энергоемких процессов в открытой системе. Разработанный метод лазерной термографии биотканей позволяет получить информацию о кровотоке путем картирования температуропроводности и теплоемкости подкожных тканей пациента.
Разработан новый метод диагностики биотканей с помощью поляризованного света, позволяющий визуализировать скрытую текстуру биотканей и контролировать ее модификацию при действии различных факторов. Для реализации метода создана автоматизированная компактная поляризационная камера и оптический адаптер к серийному гинекологическому микроскопу. Они были использованы для визуализации раннего фиброза кожи и для контроля состояния шейки матки. Предложенный метод измерения контуров равной интенсивности при диффузном отражении тонкого поляризованного луча позволяет выявить изменения оптической анизотропии тканей, что является важным при планировании лазерных операций.
Полученные выражения для плотности вероятности угла рассеяния и матрицы рассеяния позволяют рассчитать блуждание пучка поляризованного света в двухфазной неоднородной среде и преодолеть недостатки существующих моделей биотканей при описании малоуглового рассеяния света.
В клиниках России и Греции проведено более 1100 операций по коррекции формы перегородки носа с помощью лазерной аппаратуры, разработанной на основании исследований, проведенных автором диссертации и при его непосредственном участии. Получено разрешение Управления по контролю за продуктами на производство аналогичной аппаратуры в США. Личный вклад автора.
Диссертационная работа выполнена в рамках плановых научно-исследовательских работ Института проблем лазерных и информационных технологий Российской академии наук (ИПЛИТ РАН) и инициативных проектов РФФИ. Часть работ была выполнена совместно с учеными США, Англии, Франции, Греции в рамках международного сотрудничества ИПЛИТ РАН. Автор диссертации являлся руководителем грантов РФФИ №№ 96-02-18202-а, 00-02-16263-а, 04-02-16743-а, 04-02-97203-Наукоград и 07-08-00448-а, результаты которых вошли в диссертацию.
В диссертации представлены результаты исследований, выполненных лично автором, при его решающем участии или под его руководством в период с 1994 по 2015 г. в лаборатории лазерной химии. Часть работы выполнена в соавторстве с сотрудниками ИПЛИТ РАН (Воробьева Н.Н., Захаркина О.Л., к.ф.м.н. Омельченко А.И.), химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (д.х.н. Игнатьева Н.Ю, академик РАН Лунин В.В, к.х.н. Баранов С.А. и к.х.н. Кондюрин А.В.), Саратовского государственного технического университета имени Гагарина Ю.А (проф. Зимняков Д.А.). Эксперименты на животных и клинические испытания осуществлялись в основном врачами и морфологами Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (академик РАМН Овчинников Ю.М., д.м.н. Свистушкин В.М., д.м.н. Шехтер А.Б., д.м.н. Никифорова Н.Н., к.м.н. Шах Г.Ш.) при непосред-
ственном участии автора диссертации. Личный вклад автора в работу состоит: в формулировке ее концепции, основных положений и выводов; в разработке экспериментальных методик и проведении экспериментов; обработке, анализе и обобщении результатов. Большое влияние оказали д.ф.-м.н., профессор Баграташвили В.Н., д.ф.-м.н. Соболь Э.Н. и академик РАН Панченко В.Я. Апробация работы
По материалам диссертации опубликована 61 статья в рецензируемых российских и международных изданиях, патент и методика ГСССД, более 40 тезисов докладов на российских и международных конференциях. При этом 52 статьи опубликованы в журналах, входящих в перечень рецензируемых изданий ВАК, рекомендуемых для докторских диссертаций. Основные результаты работы доложены на российских и международных конференций, в их числе: SPIE Photonics West (San Jose, USA, 1992-1999, 2000, 2002, 2003, 2004-2006, 2009-2011), OSA Biomedical Optics -Topical Meetings (Florida, USA, 2004, 2006, 2008, 2010, 2012), Optics of Biological Particles - NATO Advanced Research Workshop (Novosibirsk, 2005), Coherent and Nonlinear Optics Lasers Applications and Technologies (Minsk, Belarus, 2007); International Conference on Laser Applications in Life Sciences (Moscow, Russia, 2007), Saratov Fall Meeting (Saratov, Russia, 2000, 2001, 2004-2008, 2010); International Laser Physics Workshop (Barcelona, Spain, 2009), International Laser Physics Workshop (Saraevo, Bosnia and Herzegovina, 2011), Троицкая конференция "Медицинская физика и инновации в медицине" (Троицк, Россия, 2004, 2006, 2008, 2010, 2012, 2014), V международная конференция по лазерной физике (Москва, 2001), Международные конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, Украина, 2001, 2002, 2003 и 2007), «Лазеры: применение и технологии» (Москва, 2002), "Применение лазеров в науках о жизни" (Москва, 2007), "Лазеры и лазерно-информационные технологии: фундаментальные проблемы и применения" (Шатура, 2014) и др.
Достоверность полученных результатов подтверждается их повторяемостью, большим количеством измерений с их статистической обработкой и оценкой областей достоверности и анализом ошибок экспериментов, проверкой некоторых измерений независимыми методами на другом оборудовании, согласием результатов ряда экспериментов с результатами, полученными другими авторами, высоким уровнем цитирования работ автора диссертации (индекс Хирша - 16). Структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, 5 глав и общих выводов. Работа изложена на 280 страницах машинописного текста и включает 13 таблиц, 133 рисунка и список литературы из 460 наименований.
Строение и физико-химические свойства хрящей
Идея изменения формы хрящей под действием лазерного излучения впервые была предложена и реализована в работе [2]. На ее основе при участии автора диссертации была разработана и внедрена в медицинскую практику технология лазерной термопластики хрящей. Ее можно условно разбить на несколько стадий. Сначала хрящу придается новая желаемая конфигурация с помощью внешнего механического воздействия. Затем проводится лазерное облучение областей максимальных механических напряжений с использованием специально выбранных параметров излучения. При этом обеспечивается объемный нагрев ткани в локальных областях до температуры около 70 С в течение 5-10 секунд. В итоге происходит релаксация механических напряжений, стремящихся вернуть хрящ к исходному состоянию, новая форма хряща стабилизируется.
Дальнейшие детальные исследования физико-химических механизмов релаксации напряжений в хрящевых тканях осуществлялись главным образом сотрудниками Института лазерных и информационных технологий РАН [6, 7]. В них участвовали также российские и зарубежные врачи и гистологи. В 1995 году в Москве и Троицке начались исследования in vivo на ушных хрящах свиней, которые в 1998 году были продолжены в Ноттингеме, Великобритания (Н.Джонес). Исследования изменений физико-химических свойств хрящевых тканей при лазерном воздействии обычно подкреплялись гистологическими и морфологическими исследованиями облученных образцов [8-10]. Это позволило выявить допустимые дозы облучения, определить оптимальные режимы. В 1997 году к исследованиям проблем лазерной коррекции формы хрящей присоединились ученые из США под руководством доктора медицины и естественных наук BJ.F Wong (лазерный институт им. Бекмана, г. Ирвайн, штат Калифорния). Они внесли значительный вклад в общий объем исследований механизмов релаксации напряжений - на новом уровне подтвердили полученные ранее результаты и дали им развитие (см., например, работы [11-15]).
В работе [16] исследовался процесс изменения формы для перегородки носа свиньи при нагреве с помощью излучения Nd:YAG лазера (? = 1.32 мкм). В работе [17], являющейся, по сути, продолжением работы [16], изогнутый образец после лазерного воздействия помещали в ванну с нормальным солевым раствором, температура которого варьировалась от 22 до 74 С, и регистрировали возврат формы как функцию времени. Позже [18] было установлено, что на стабильность формы изогнутого хряща влияет последовательность облучения разных сторон образца. Это связано с тем, что при изгибе одна из сторон хрящевой пластины обычно растянута, а другая сторона сжата. Исследовался также вопрос о стабильности формы хрящей и гибели клеток in vitro также в случаях лазерной термопластики перегородки носа свиньи импульсно-периодическим излучением Nd:YAG лазера (? = 1.32 мкм) [19] и перегородки носа человека непрерывным излучением диодного лазера (к=\А6 мкм) [20]. Следует особо выделить работу [21], в которой образец перегородки носа свиньи при решейпинге с помощью Nd:YAG лазера (? = 1.32 мкм) контролируемо охлаждался спреем с обратной связью. Для нагрева хряща до необходимой температуры 70 С в течение 2 с была увеличена плотность мощности лазерного излучения до 50 Вт/см . Это позволило уменьшить интегральную тепловую нагрузку, что значительно повысило выживаемость клеток. Важно, что образец хряща при этом приобретал устойчивую дугообразную форму.
Еще один класс исследований проводился с образцами хрящей, которые после лазерной обработки в режиме шейпинга имплантировали под кожу животного (кролика) на достаточно длительное время. В работе [22] исследовалась стабильность новой формы выделенных ушных хрящей 21 кроликов. Освобожденный от надхрящницы ушной хрящ кроликов, форма которого была изменена под воздействием излучения СОг - лазера (мощность 3 Вт, диаметр пятна 2 мм, время облучения 0.5 сек), был имплантирован под кожу тем же кроликам. Через 6, 8 и 12 месяцев хрящ сохранял свою измененную форму и жизнеспособность. Оптическая и электронная микроскопия показали сохранность большинства хондроцитов в облученной зоне.
Аналогичная постановка эксперимента была выполнена в работе [23] с Nd:YAG лазером {Х=\.Ъ2 мкм). Здесь наблюдалась потеря целостности хряща и понижение выживаемости клеток в широком диапазоне параметров облучения. Возможно, авторы этой работы ошиблись в выборе режимов облучения или не учли принцип локальности и дискретности воздействия. В более поздней работе [20] также изучались имплантированные образцы хрящей ушной раковины кролика после шейпинга с помощью диодного лазера (к=1А6 мкм). Конфокальная микроскопия образцов, специально окрашенных для визуализации живых и погибших клеток, показала, что сразу после лазерного нагрева хондроциты в основном погибают, однако, спустя 4 недели нахождения облученных образцов под кожей количество живых хондроцитов в зоне облучения практически полностью восстановилось.
В работе [24] использовался твердотельный лазер на эрбиевом стекле (Я,=1.54 мкм, модель "Aramis", Quantel Medical, France) для термопластики ушного хряща кроликов. Важной особенностью этих экспериментов было использование устройства для контактного охлаждения, которое за 2 секунды до начала лазерного облучения охлаждало поверхность кожи до температуры +5С с целью предотвращения перегрева кожи, слизистой оболочки и надхрящницы. Это позволило проводить лазерное воздействие на хрящ уха непосредственно через кожу, избегая ее перегрева. Кривизна ушной пластины задавалась с помощью перфорированной цилиндрической пластины, через отверстия которой проводилось лазерное облучение уха кролика с помощью световода. В качестве параметра, характеризующего динамику последующего распрямления хряща, использовался радиус его кривизны. Биопсия для гистологии и иммуногистохимии делалась через 1, 3 и 6 недель после облучения. Была показана долговременная стабильность новой формы и регенеративная активность клеток с образованием нового матрикса хряща.
В работах [25, 26] сообщается об эксперименте по изменению формы трахеального хряща собак in vivo с помощью Nd:YAG лазера (Я,=1.44 мкм). Эксперимент выполнялся в две стадии. На первой стадии хирургическим путем создавали модель деформированной трахеи, которая окончательно формировалась в течение 6 недель. На второй стадии форму трахеи сначала механически выправляли к норме и затем бесконтактно прогревали с помощью эндоскопического лазерного инструмента. Облученные хрящи сохраняли новую форму в течение 6 недель наблюдения. Гистолические исследования в зоне облучения показали восстановление структуры хряща и числа хондроцитов. К сожалению, этот эксперимент на собаках остался единственным.
Структурные изменения в хрящах как диффузионно-лимитированный процесс
При изучении процессов теплопередачи, костную ткань можно рассматривать как квазиоднородную среду с усредненными значениями г/, С, и а=т]1С, при условии, что характерный размер неоднородности гораздо меньше, чем длина распространения тепла (l«L). В противном случае (l»L), передача тепла в каждом отдельном компоненте ткани происходит независимо от остальных компонентов. Например, для длинного импульса СОг-лазера (г 0.05 с), становятся справедливыми соотношения L» Е, I и может быть использована формула (1.5.3) с усредненными оптическими и теплофизическими параметрами ткани. Большие различия между некоторыми измеренными и оцененными данными (см. Таблицу 1.5.1) говорят, что в таких случаях неоднородности следует учитывать. Сравнение с экспериментом. Подставляя в (1.5.3) экспериментально измеренные пороги карбонизации Рс 2 Вт, определенные при г = 0.05 с и го- 0.45 мм, находим (с учетом соотношения N = q0pr ) температуру карбонизации кости: Гс 400С, что согласуется с температурой, указывающей начало интенсивного термического разрушения кости [123] и биополимеров [129, 130]. Сравнение теоретических и экспериментальных зависимостей от длительности лазерного импульса порога карбонизации представлено на Рисунке 1.5.8
Теоретическая зависимость размера зоны карбонизации от мощности излучения, рассчитанная по формуле (1.5.3) и экспериментальные точки хорошо согласуются вблизи порога карбонизации (Рисунок 1.5.9). Значительное различие между результатами наблюдается при высоких значениях N связано с тем, что формула (1.5.3) не учитывает расход энергии на формирование кратера. Использование теоретической модели, учитывающей энергетический вклад абляции [113] дает лучшее согласие теории и эксперимента (кривые Г и 2 на Рисунке 1.5.9). Тем не менее, формула (1.5.3) позволяет оценить температуру на границе между темными и светлыми областями зоны лазерного воздействия: Ть=Тс ехр (гс2 —г )/г \, где гс и rw - радиусы темных и светлых областей, соответственно. Подставляя в это выражение экспериментальные значения гс и rw получим Тъ = 500С, что примерно соответствует температуре начала интенсивного окисления углерода в воздухе [128, 130]. При облучения костной ткани в инертной среде, процесс окисления затруднен, и размер карбонизации (темная область, Рисунок 1.5.4) возрастает. Примыкающая к области кратера белая зона нагревается до температуры, превышающей температуру плавления апатита. Эта область уже не содержит никаких органических элементов, и в ней наблюдается более высокая концентрация Са в сравнении с другими зонами.
В случае воздействия на костную ткань импульсами KrF лазера (Я = 248 нм, г 20 не) справедливо соотношение L« I и чтобы оценить температурное поле следует использовать формулы (1.5.2) и (1.5.5). Подставляя в (1.5.2) экспериментальный порог абляции Фа=0.5 Дж/см , мы находим, что температура абляция должна быть Га 150С. В случае облучения одиночными УФ импульсами, никакой карбонизации не происходит, хотя энергии кванта излучения (около 5 эВ) достаточно для расщепления связей. Карбонизация наблюдалась лишь при длинных импульсах ССЬ-лазера и при импульсно-периодическом облучении KrF-лазером. В последнем случае (ц, = 5 Гц, N = 200), порог карбонизации Фс составил около 0.2 Дж/см2. Отсюда, можно сделать вывод, что это не фотохимическое расщепление химических связей, а более медленный процесс, который регулирует кинетику карбонизации. Таким процессом может быть диффузия выделяющихся газов или атомов углерода, которые коагулируют с образованием микрочастиц, обеспечивая при этом высокий коэффициент поглощения. Ранее было обнаружено, что в процессе лазерной обработки полимеров образуются частицы сажи [131, 132]. Это видно также в спектрах комбинационного рассеяния света [133, 134].
Время карбонизации. Время, необходимое для процесса диффузии можно оценить с помощью простых соотношений: rc=l2IDc, Dc=D0exp(-E/T). (1.5.7) Далее примем, что 0 = 0.01 см2/с иЕ= 5000 К [128]. Формула (1.5.4) позволяет оценить минимальную температуру, достигаемую при Фс = 0.2 Дж/см2, vp = 5 Гц, и п = 200, т.е. при температуре Г2" = 83С начинает происходить карбонизация. Обратим внимание, что диссоциация химических связей при такой температуре еще не происходит. То есть, этот порог по температуре, скорее всего, связан с фотохимическими процессами. Для протекания карбонизации, прежде всего, необходимо обеспечить минимальную температуру, при которой скорость диффузии атомов углерода в твердом теле достаточно велика.
Подставив Т = 356 К в выражения (1.5.7), получаем Dc = 8-10" см/с и rc = 50 с. Полученное значение гс хорошо согласуется с экспериментальным значением времени nlvv = 40 с, когда зона лазерного воздействия начинает чернеть. Если плотность энергии излучения превышает Фс, число лазерных импульсов ис, необходимых для карбонизации, уменьшается.
Карбонизация сопровождается резким увеличением коэффициента поглощения. Как показано в [135], при Ао = 248 нм значения а для аморфного гидрогенизированного углерода и кристаллического графита равны 10 и 10 см" , соответственно.
Карбонизация и абляция. Поскольку при неравенстве » L температура поверхности образца пропорциональна коэффициенту поглощения, развитие процесса карбонизации в случае коротких лазерных импульсов должно резко ускорить нагрев материала и вызвать ее абляцию, и именно это было обнаружено экспериментально при импульсном облучении как СОг, так и KrF лазерами. В последнем случае, абляция происходила, когда плотность энергии лазерного излучения лишь немного превышала порог карбонизации (Фа = 0.26 Дж/см при п = 200, и Фс = 0.2 Дж/см ). Объемная плотность энергии, выделяющейся в слое толщиной 10" см была в этом случае s ± 2.6-10 Дж/см , что достаточно для испарения поглощающего слоя.
Предположим, что абляция начинается не с первого лазерного импульса, а после окончания карбонизации. Такая гипотеза согласуется с нашими экспериментами и результатами работы [136]. Отношение между глубиной абляции, плотностью энергии лазерного импульса и частотой повторения (при п пс) может быть выражено следующим образом: Za=Z0(l-nc/n) = Z0(l-l\/Dc), г0=Ф/є. (1.5.8) Приближенная формула (1.5.8) основана на предположении, что коэффициент поглощения а резко увеличивается после пс лазерных импульсов. При Ф = 2.1 Дж/см и v = 100 Гц, для процесса карбонизации требуется лишь 30 импульсов. В этом случае мы имеем Г3т = 170С, Dc = 10" см /с и значение гс = 0.4 с соответствует времени воздействия. Средняя глубина абляции за импульс Za = ФІє = 8 мкм, что коррелирует с экспериментальным значением 7 мкм (Рисунок 1.5.12). Поскольку пс возрастает с ростом v и уменьшается с ростом Ф, то формула (1.5.8) описывает зависимости Za от Ф и v. Для Ф = 1.6 Дж/см , v = 1 Гц, и v = 10 Гц, получим Za = 0.6 и 0.3 мкм, соответственно, что коррелирует с экспериментальными данными (Рисунок 1.5.12).
Роль диффузионной карбонизации в ускорении нагрева биологических тканей при импульсно-периодическом лазерном воздействии более отчетливо проявляется для ПК излучения. Это, в частности, следует из теоретического анализа, представленного в работе [137], где указано, что механизм абляции может измениться вследствие повышения энергии лазерного излучения или длительности воздействия в результате осушки поглощающего слоя. При невысоких значениях Ф может существовать предельная частота следования импульсов vpm, ниже которой абляция прекращается после некоторого числа импульсов, когда температура становится недостаточной для развития более энергоемких механизмов абляции, связанных с распадом или испарением измененного материала [113]. Поэтому время, необходимое для перфорации костной пластины, может нелинейно зависеть от плотности энергии излучения в импульсе и частоты следования импульсов.
Подходы к измерению температуропроводности, удельной теплоемкости и эффективного коэффициента поглощения
Обычно задача импульсной ИК радиометрии сводится к определению значения параметра \х. Часто при расчетах предполагается, что изменения плотности потока теплового излучения линейно зависят от температуры (функция Планка линеаризуется по приращению температуры) и в полосе чувствительности ИК детектора АА применяется усредненная величина коэффициента поглощения а . Использование этих приближений существенно упрощает вычисления [283], но возникают систематические погрешности в определении коэффициентов поглощения [284].
В работе [285] подробно рассмотрены источники ошибок при измерениях коэффициентов поглощения методом импульсной ИК радиометрии и оценены их величины. Суммарная погрешность измерения коэффициента поглощения при описанных упрощениях модели дает величину -0.35. При учете реального спектра поглощения биоткани, спектральной чувствительности ИК детектора и спектра теплового излучения можно уменьшить ошибку измерений до 5%. Принимая, что коэффициенты температуропроводности хряща и воды одинаковые, то есть =1.4-10" см /с, длительность импульса тр=6 мкс оценим предельные значения коэффициентов поглощения, которые можно измерить методом ИИКР: іл«(хтр) =1.2-104 см"1.
Искомый коэффициент поглощения ju определяли численно, подгоняя модельную зависимость Z(t) к экспериментальной зависимости 7/(0- Критерием выбора ju служил минимум их квадратичной разности.
Для температур выше 360 К коэффициент поглощения (отмечен символом / збо) уменьшается практически линейно. Средняя относительная ошибка измерений //збо составила примерно 12%. В большинстве измерений средняя дисперсия для полос поглощения воды 2.9 и 6.1 мкм была 10 и 6 %, соответственно. Заметим, что максимум поглощения мы наблюдали при длине волны 2.97 мкм, тогда как измерения спектра поглощения методом ИК Фурье спектроскопии дали максимум на длине волны 2.87 мкм.
Результаты измерений коэффициента поглощения роговицы глаза представлены в Таблице 2.4.3. Значения ju для роговицы глаза в сравнении с хрящом оказались ниже. Увеличение коэффициента поглощения с ростом температуры наблюдалось лишь для /1=3.22 мкм, в то же время для других длин волн (3.00 и 2.81 мкм) величина ju с ростом температуры уменьшалась.
С помощью двойной интегрирующей сферы исследована динамика оптических параметров хрящевой ткани (коэффициенты поглощения, рассеяния и анизотропии рассеяния) на длине волны 1.56 мкм при лазерном нагреве. Показано, что эффективный коэффициент поглощения уменьшается примерно на 20% при нагреве от комнатной температуры до 70-80С за счет деформации полосы поглощения внутритканевой воды. Это необходимо учитывать для обеспечения безопасности лазерных процедур.
Методом импульсной ИК радиометрии измерены коэффициенты поглощения хрящевой ткани и роговицы глаза вблизи полос поглощения воды 2.9 и 6.1 мкм с учетом реальных спектров поглощения объектов, теплового излучения и чувствительности датчика. Показано, что при лазерном нагреве биотканей свыше 50 С коэффициент поглощения значительно уменьшается, причем его относительные изменения для полосы поглощения 2.9 мкм существенно больше, чем для полосы поглощения 6.1 мкм. Рассмотрено влияние высыхания приповерхностного слоя образца в течение эксперимента на ошибки измерения.
При лазерном нагреве хрящевой ткани до 70 С происходит изменение первичной структуры коллагеновых волокон, которое можно наблюдать по изменению спектров КР в области колебаний группы амид III и изменения протеогликановой системы, которые можно наблюдать по выходу гликозаминогликанов в буферный раствор и изменению молекулярной массы хондроитин-сульфатов.
Предложена модель термической релаксации механических напряжений и изменения формы хрящей при умеренном лазерном нагреве, основанная на диффузионно-лимитированной перестройке структурных элементов матрикса хрящевых тканей. Отрыв этих элементов и скорость их диффузии зависят от температуры и состояния внутритканевой жидкости. Для устойчивого изменения формы требуется диффузионное смещение структурных элементов на некоторое критическое расстояние, которое может быть оценено равным приблизительно 5 мкм. Отсюда вытекает, что устойчивое изменение формы может произойти лишь за некоторое минимальное время, зависящее от максимальной температуры. С другой стороны время воздействие ограничено процессами денатурации белков. Это позволяет построить область допустимых режимов лазерного решеипинга хрящей в координатах плотность энергии - время действия. Экспериментальные результаты решеипинга хрящей с анализом гистологических изменений ткани качественно подтвердили предложенную модель.
При дегидратации (лиофильной сушке) хрящей можно выделить три области поведения скорости изменения массы: медленная (I), быстрая (II) и снова медленная (III). Изменения массы являются обратимыми, если температура образца не превышает 340К. На первых стадиях процесса высыхания хряща кинетика потери воды хрящом определяется массопереносом воды в хрящевой пластине, а на поздней стадии, когда свободной воды остается мало, процесс высыхания замедляется, так как кинетика высыхания определяется, в значительной степени, переходом воды из «связанного» в «свободное» состояние. Поскольку энергия активации диффузионного процесса близка к теплоте фазового перехода освобождения связанной воды, то можно представить механизм диффузии воды в хрящевом матриксе - как процесс последовательного разрыва и образования связей между молекулами воды и протеогликанами (процесс абсорбции - десорбции воды протеогликанами).
Время термической денатурации хрящевых тканей и роговицы глаза при действии излучением лазера на свободных электронах в диапазоне длин волн 2.2-8.5 мкм, определяемое по характерному изменению интегральной интенсивности рассеяния зондирующего света, хорошо описываются в рамках модели диффузионно-лимитированной перестройки структурных элементов ткани.
Релаксация механических напряжений в хрящевых тканях происходит в диапазоне температур 65-70С и сопровождается обратимыми изменениями оптических параметров, выражающихся в характерных изменениях интенсивности прошедшего через образец или отраженного от образца зондирующего пучка света. Эти изменения имеют экстремум на уровне примерно 15-20% от начального уровня, который хорошо коррелирует с моментом релаксации механических напряжений.
При локальном лазерном нагреве хрящевой ткани в режиме релаксации механических напряжений происходит усадка ткани, вызванная диффузией внутритканевой воды из нагретой области, что выражается в изменении профиля поверхности. Это существенно влияет на распределение интенсивности отраженного или прошедшего зондирующего пучка света. Изменения поверхности ткани может быть принято во внимание при помощи интегрирующих оптических систем, суммирующих сигналы по множеству направлений.
Спеклометрия лазерного нагрева биотканей с помощью волоконного жгута
Величина 1(f) отражает действие возмущений, стремящихся вывести систему с заданного режима нагрева. Природой этих возмущений является теплопроводность и конвекция (3.4.1)-(3.4.3). Поэтому в первую очередь 1(f) зависит от температуропроводности {%) и коэффициента теплообмена с окружающей средой (И). С другой стороны, величина 1(f) определяется градиентом температурного поля в окрестности точки г = 0, z = 0. В свою очередь, температурное поле, его пространственная конфигурация и динамика, определяется совокупностью параметров %, рСр, a, WL. ИЗ ЭТИХ соображений становится ясно, что величины 1(f) и А, строго говоря, являются зависимыми.
Однако выяснилось, что этой зависимостью можно пренебречь при рассмотрении контролируемого лазерного нагрева биологических тканей с температуропроводностью %, удельной теплоемкостью рСр и эффективным коэффициентом поглощения а, принимающими значения в интервалах от 0.1 до 0.2 мм/с, от 2.5 до 3.5 Дж/см/К и от 7.5 до 15 см" , соответственно. Подобная ситуация реализуется, когда градиент температуры в окрестности точки г = 0, z = 0 слабо зависит от рСр, a, WL В указанных пределах. Из предположения, что величина 1(f) не зависит от А, следует важное утверждение. В любой момент времени t одно и то же управляющее воздействие f(f) при некотором значении 1(f) будет осуществляться при выполнении условия:
Другими словами, при выполнении условия (3.4.25) будет реализовываться одна и та же скорость нагрева независимо от значений рСр, а и WL. При этом оптимальное значение параметра ПИД-закона Кс можно выразить в явном виде через теплофизические и оптические параметры облучаемой биологической ткани: Неизвестная феноменологическая константа Вкс из уравнения (3.4.26) может быть определена после расчета оптимальных параметров ПИД-закона при различных значениях рСр, aaWi для каждого режима нагрева. Методом линейной регрессии были определены соответствующие каждой паре рСр и а коэффициенты пропорциональности к (при этом коэффициент корреляции R составлял не меньше 0.99): Для каждого из режимов, которые характеризуются скоростями нагрева от 0.1 до 5С/с, были рассчитаны величины параметра Вкс- Оказалось, что зависимость Вкс от скорости нагрева в степени 0.5 линейна (Рисунок 3.4.3). Оптимальная работа ПИД-регулятора определяется не только правильно выбранным значением Кс, но и двумя другими параметрами Tt и 7 , которые входят в выражение для 1(f). По результатам расчета оптимальные значения Гг не зависят от рСр и а и представлены в Таблица 3.4.1, а величина Td равна нулю при любых рСр и а.
Анализ параметров ПИД-закона при различных значения коэффициента теплообмена с окружающей средой (И) и температуропроводности (%) показал, что погрешность вычисления искомых параметров не зависит от используемых при расчете величин h и % в достаточно широком диапазоне. Таким образом, для реализации лазерного нагрева с заданной постоянной скоростью достаточно вычислить Кс с помощью величины Вкс, рСр, ос и WL ПО формуле (3.4.28), выбрать Tj из Таблицы 3.4.1 и положить Td равной нулю.
Быстрый нагрев и удержание заданной температуры. Суть режима заключается в быстром нагреве контрольной области образца от комнатной температуры до заданной температуры Tset. После чего система управления должна удерживать постоянное значение температуры Tset. Подобный режим необходим при исследованиях кинетических зависимостей различных термических процессов в открытой системе.
Оптимальные значения параметров ПИД-закона были использованы для расчета времени tp, по истечении которого отклонение температуры не превышает заданной величины А = 0.05 set. Расчеты показали, что значения tp лежат в интервале от 1 до 20 с. Обеспечение
быстрого (в пределах 1-4 с) выхода на заданную температуру (в интервале от 30 до 100 С) возможно только при значениях WL В пределах 1-3 мм. Дальнейшее увеличение размера лазерного пятна приводит к значительному возрастанию времени выхода системы на заданную температуру. Температуропроводность и коэффициент теплообмена с окружающей средой можно не принимать во внимание при выборе параметров ПИД-закона. Детальный анализ влияния этих параметров можно найти в работе [288]. 3.4.4. Реализация лазерного нагрева с обратной связью
Разработанный метод выбора оптимальных параметров ПИД-закона был проверен экспериментально. На Рисунках 3.4.5, 3.4.6 представлены зависимости температуры от времени, полученные с помощью измерительного комплекса, включающего лазер, термопару. Для управления мощностью лазера по ПИД-закону было разработано программное обеспечение (на языке Lab View), которое осуществляло сбор, обработку данных с АЦП термопар и корректировку мощности лазера в соответствии с ПИД-законом.
Действительно, протекание термического процесса в нагреваемом объекте приводит к тому, что система управления компенсирует количество теплоты, выделяющееся или поглощающееся при нагреве. При этом зависимость P(t) начинает себя вести немонотонно, что дает возможность детектировать протекание термического процесса и измерить его энергоемкость. В идеальном случае для реализации лазерной калориметрии необходимо, чтобы функция P{t) была гладкой, однако на практике функция P{t) может быть произвольной, иметь множество разрывов и значительных скачков (Рисунок 3.5.1).
Реализация гладкой функции P{t) в принципе невозможна, поскольку на нее всегда накладывается некоторый шум, вызванный погрешностью измерения температуры и установки мощности аппаратным регулятором лазера. Дисперсия шума зависит от используемых параметров ПИД-закона и минимальна при использовании оптимальных значений Кс, Т, Td (Рисунок 3.5.2).