Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Характеристика древесного сырья и способы его подготовки для биокаталитической конверсии 8
1.2 Ферментные комплексы на основе целлюлолитических и гемицеллюлазных ферментов 25
1.3 Характеристика сульфатной целлюлозы как субстрата для биокаталитической конверсии 32
1.4 Продукты биокаталитической конверсии сульфатной целлюлозы и направления их использования 43
1.5 Выводы по обзору литературы. Постановка цели и задач исследования 50
Глава 2. Методическая часть 52
2.1 Характеристика образцов сульфатной целлюлозы 52
2.2 Характеристика ферментных препаратов Penicillium verruculosum 52
2.3 Ферментативный гидролиз сульфатной целлюлозы 53
2.4 Определение компонентного состава сульфатной целлюлозы 54
2.5 Определение состава гидролизатов после ферментативного гидролиза 54
2.6 Определение длины и ширины целлюлозных волокон и доли сосудов в волокнистой массе 56
2.7 Исследование структуры волокон сульфатной целлюлозы и целлюлозных остатков после ферментативного гидролиза 57
2.8 Определение степени кристалличности сульфатной целлюлозы, целлюлозных остатков после ферментативного гидролиза и продуктов на их основе 57
2.9 Фракционирование целлюлозного остатка после ферментативного гидролиза 57
2.10 Получение порошковой целлюлозы из целлюлозных остатков биоконверсии сульфатной целлюлозы 58
2.11 Получение гелей из целлюлозных остатков биоконверсии сульфатной целлюлозы 59
Глава 3. Экспериментальная часть 61
3.1 Влияние различных факторов на процесс биоконверсии сульфатной целлюлозы 61
3.2 Структурно-морфологические изменения волокон хвойной и лиственной сульфатной целлюлозы в процессе ферментативного гидролиза 73
3.3 Характеристика растворимых продуктов биоконверсии сульфатной целлюлозы 84
3.4 Характеристика целлюлозных остатков биоконверсии сульфатной целлюлозы 85
3.5 Получение порошковой целлюлозы из целлюлозных остатков биоконверсии сульфатной целлюлозы 93
3.6 Получение гелей из целлюлозных остатков биоконверсии сульфатной целлюлозы 95
3.7 Концепция биозавода в составе целлюлозно-бумажного предприятия 100
Выводы 105
Список использованных источников 107
Приложение. Акт испытаний порошковой целлюлозы в качестве субстрата для производства целлюлолитических ферментов 128
- Характеристика древесного сырья и способы его подготовки для биокаталитической конверсии
- Продукты биокаталитической конверсии сульфатной целлюлозы и направления их использования
- Влияние различных факторов на процесс биоконверсии сульфатной целлюлозы
- Концепция биозавода в составе целлюлозно-бумажного предприятия
Введение к работе
Актуальность темы. Сульфатная целлюлоза – волокнистый полуфабрикат целлюлозно-бумажного производства, предназначенный для производства различных видов бумаги. Одновременно сульфатная целлюлоза рассматривается в качестве перспективного сырья для биокаталитической конверсии с получением растворов сахаров, в основном глюкозы, предназначенных для последующей биохимической переработки в биоэтанол, органические кислоты. Новые возможности для производства моносахаридов из растительной целлюлозы открывает ферментативный гидролиз (ФГ) с применением комплекса карбогидраз на основе мутантного штамма Penicillium verruculosum. Этот комплекс имеет ряд преимуществ перед применяемыми в промышленности комплексами на основе Trichoderma, в частности имеет оптимальный набор целлюлозолитических ферментов. Особенности строения целлюлозы как полимера, такие как развитая кристаллическая структура и высокая степень полимеризации, существенно ограничивают степень конверсии целлюлозы в глюкозу. В результате при ФГ целлюлозы получаются нерастворимые целлюлозные остатки, которые недостаточно охарактеризованы. Актуальной является задача рационального использования не только растворимых, но и твердых, не поддающихся гидролизу остатков процесса биоконверсии сульфатной целлюлозы. Представляет интерес направленная ферментативная деструкция волокон целлюлозы до фрагментов, пригодных для применения в качестве порошковой целлюлозы.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 14–04–98825 «Применение
новых гликозилгидролаз для биомодификации полисахаридного комплекса
растительного происхождения» и проекта Минобрнауки №15.8815.2017/8.9
«Молекулярно-биологические методы в биотехнологии термостабильных
ферментов».
Цель и задачи исследования. Цель данной работы – оценить целесообразность применения биокаталитической конверсии сульфатной целлюлозы комплексом карбогидраз Penicillium verruculosum для получения порошковой целлюлозы и растворов сахаров.
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Определить факторы ферментативного гидролиза сульфатной целлюлозы
комплексными препаратами P. verruculosum, обеспечивающие получение
ферментолизатов с максимально высокой концентрацией сахаров.
2. Определить выход и состав растворимых продуктов биоконверсии
сульфатной целлюлозы комплексными ферментными препаратами P. verruculosum.
3. Охарактеризовать целлюлозные остатки ферментативного гидролиза
сульфатной целлюлозы и предложить направления их использования.
4. Усовершенствовать метод определения кристалличности целлюлозы и
продуктов ее ферментативной деструкции.
5. Разработать концепцию биозавода в составе целлюлозно-бумажного
комбината.
Научная новизна. Установлено, что значительные структурно-
морфологические изменения волокон хвойной и лиственной сульфатной целлюлозы происходят в течение первых 2–3 часов ФГ. Увеличение ширины волокон сульфатной целлюлозы, вызванное набуханием слоя S2 клеточной стенки, связано с разрушением поверхностных слоев целлюлозных волокон под действием ксиланаз и эндоглюканаз (ЭГ). Укорочение волокон в 3–5 раз и наблюдаемое в связи с этим накопление фракции очень коротких волокон (менее 0,1 мм) вызвано разрушением длинных волокон в поперечном направлении в результате ферментативной деструкции ЭГ, что приводит к увеличению доступности кристаллической структуры слоя S2 вторичной клеточной стенки для действия целлобиогидролаз (ЦБГ). Такие изменения структуры волокон обеспечивают эффективное проведение ФГ при высокой начальной концентрации субстрата (10–15 %) и получение ферментолизатов с концентрацией сахаров до 60–108 г/л. При ФГ лиственной сульфатной целлюлозы установлена высокая устойчивость сосудов к действию целлюлаз, выявлено наличие трудногидролизуемой фракции, представленной фрагментами первичных клеточных стенок сосудов и волокон. Определен выход целлюлозных остатков после ФГ сульфатной целлюлозы, оценены степень кристалличности, адсорбционная активность и способность к гелеобразованию. Разработан новый метод расчета степени кристалличности твердых веществ по данным дифрактометрии, основанный на оценке скорости изменения функции I=f(2) по всему диапазону углов рассеяния, гарантирующий соблюдение принципа аддитивности при изменении кристаллической и аморфной составляющей вещества. Показано, что высокие значения степени кристалличности получены при выходе целлюлозных остатков 70–83 % от исходной целлюлозы.
Практическая значимость полученных результатов.
Предложена концепция биозавода в составе целлюлозно-бумажного
предприятия для получения порошковой целлюлозы и растворов сахаров.
Новый метод расчета степени кристалличности рекомендуется для оценки кристалличности целлюлозы и продуктов на ее основе.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
-
Закономерности процесса биоконверсии небеленой и беленой сульфатной целлюлозы из хвойных и лиственных пород древесины комплексами карбогидраз Penicillium verruculosum.
-
Характеристика продуктов биокаталитической конверсии сульфатной целлюлозы.
-
Новый метод расчета кристалличности целлюлозы по данным дифрактометрии.
-
Характеристика порошковой целлюлозы, полученной из целлюлозных остатков ферментативного гидролиза сульфатной целлюлозы.
5. Концепция биозавода в составе целлюлозно-бумажного комбината.
Апробация результатов исследования. Основные положения
диссертационной работы представлены на II Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (г. Саратов, 2014 г.); на 13 Европейской конференции по лигноцеллюлозе и целлюлозе (EWLP–2014, г. Севилья, Испания, 2014 г.); на Международной научной конференции «Биотехнологии в химико-лесном комплексе» (г. Архангельск, 2014 г.); на VI и VII Международных конференциях "Физикохимия растительных полимеров» (г. Архангельск, 2015 г., 2017 г.); на Международной научной конференции SGEM VIENNA GREEN (Вена, Австрия, 2016 г.); на VII Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2017 г.); на Международной научно-практической конференции «Молекулярно-генетические и биотехнологические основы получения и применения синтетических и природных биологически активных веществ» (Нарочанские чтения – 11) (Минск – Ставрополь, 2017 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России, которые включены в базы SCOPUS и Web of science.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трх глав, выводов, списка использованных источников, приложения. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 36 рисунков, список использованных источников включает 214 наименований.
Характеристика древесного сырья и способы его подготовки для биокаталитической конверсии
Использование целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ) древесного происхождения в качестве возобновляемого источника органического сырья представляет большой практический интерес [1, 2]. Важной характеристикой древесного сырья является химический состав [3–9]. Хвойные породы содержат в своем составе больше целлюлозы и лигнина, но меньше гемицеллюлоз в сравнении с лиственными породами. Различается состав гемицеллюлоз, хвойные породы содержат больше гексозанов, но меньше пентозанов, чем лиственные. Химический состав древесины одной и той же породы может меняться в зависимости от района, условий произрастания, возраста дерева, а иногда и времени рубки. Даже в стволе одного и того же дерева могут наблюдаться заметные различия в компонентном составе как по высоте, так и по диаметру ствола. Древесина корней и веток также отличается по составу от древесины ствола [3–5, 7–9].
Древесина представляет собой композицию полисахаридов (целлюлоза, ге-мицеллюлозы) и ароматического полифункционального биополимера нерегулярного строения (лигнин) [6]. Основные компоненты древесины: целлюлоза, ге-мицеллюлозы и лигнин находятся в стенках волокон, где образуют сложную лигноуглеводную матрицу. Макромолекулы целлюлозы формируют фибриллы, являющиеся элементами надмолекулярной структуры.
Толщина самой клеточной стенки варьируется в широких пределах от 1 до 10 мкм в зависимости от породы дерева. Клеточная стенка волокон состоит из двух основных структурных частей - первичной стенки Р и вторичной стенки S (Рисунок 1.1) [9].
Первичная стенка Р – тонкий слой толщиной 0,1...0,3 мкм. Первичная стенка в растительной клетке после деления содержит целлюлозу, гемицеллюлозы, пектиновые вещества и белки. Растительные клетки скреплены между собой межклеточным веществом (истинной срединной пластинкой). Структура межклеточного вещества (ML) аморфна, целлюлоза в нем отсутствует. В период развития и растяжения клетки межклеточное вещество состоит из пектиновых веществ, однако после одревеснения клеточной стенки основным компонентом становится лигнин. Толщина межклеточного вещества составляет 0,2…0,5 мкм с утолщениями в углах клетки. Лигнин откладывается в период одревеснения, он сначала появляется в первичной стенке в углах клетки, затем в межклеточном веществе и всей первичной стенке, после чего постепенно лигнифицируется вторичная стенка [7]. Межклеточное вещество и первичные стенки двух смежных клеток тесно срастаются между собой, образуя сложную срединную пластинку (P + ML + P ) [7]. В первичной стенке Р доля целлюлозы невелика, ее микрофибриллы образуют беспорядочную рыхлую сетку.
Слои вторичной клеточной стенки волокон различаются ориентацией целлюлозных микрофибрилл (Рисунок 1.1). У трахеид и волокон либриформа характер ориентации микрофибрилл в слоях вторичной клеточной стенки примерно одинаков. Переход от первичной стенки Р к слою S1 постепенный и иногда его трудно обнаружить. Структура первичной стенки не препятствует увеличению размеров клетки в начале ее роста и расширения, при этом материал стенки имеет достаточную прочность. Эту прочность первичной стенке придает каркас из целлюлозных микрофибрилл, скрепленных ксилоглюканом и пектиновыми веществами [7–9].
В период утолщения клеточной стенки в результате деятельности протоплазмы образуется вторичная стенка, которая в свою очередь состоит из трех слоев: наружного слоя S1, среднего слоя S2 и внутреннего слоя S3. Однако некоторые исследователи [3] считают, что последний слой, отличающийся особой структурой и химическим составом, следует рассматривать как индивидуальный слой – третичную стенку Т. Слой S1 имеет толщину 0,1…0,3 мкм в зависимости от части годичного кольца (поздняя и ранняя) и древесной породы. В слое S1 наблюдается спиральная ориентация микрофибрилл, которые образуют две и более (до 4…6) ламелл с противоположным направлением пологих спиралей. Угол их наклона к оси волокна составляет от 70 для трахеид до 50 для клеток либриформа. Переход между слоями S1 и S2 более резкий (через переходную ламеллу S12 с пологой ориентацией правонаправленных спиралей), и соединены эти слои непрочно. Целлюлоза в слое S1 имеет большую степень кристалличности, чем в слое S2 [7]. Толщина слоя S2 в среднем составляет 2…6 мкм с колебаниями от 1 мкм (в ранней древесине) до 7…9 мкм (в поздней древесине). Слой S2, образующий основную часть клеточной стенки с наиболее высокой степенью ориентации, состоит из тонких ламелл (30…40 в ранней древесине и до 150 и более в поздней). Микрофибриллы в этих ламеллах идут по крутым спиралям (правонаправленным) под углом к оси волокна от 5…10 в ранней древесине до 20…30 в поздней. Между слоями S2 и S3 (Т) также существует тонкий переходной слой (S23), состоящий из нескольких ламелл с изменением угла ориентации микрофибрилл.
Слой S3 (или третичная стенка Т) самый тонкий (0,1…0,2 мкм). Он также имеет спиральную ориентацию микрофибрилл. У древесины разных пород отмечают значительные колебания угла ориентации микрофибрилл (от 90 до 50 к оси волокна). Структура слоя более рыхлая, чем у слоя S1. Для слоя S3 характерны спиральные утолщения на внутренней поверхности. Они образуют «бородавчатый слой» (W) толщиной 0,1…0,25 мкм. Этот слой формируется при отмирании протопласта и прекращения жизнедеятельности клетки, содержит лигноподобное вещество с примесью гемицеллюлоз, пектиновые вещества и белки. Целлюлозные фибриллы в ней ориентированы практически перпендикулярно оси волокна [7]. Данный слой выстилает полость клетки (люмен).
Распределение слоев клеточной стенки в трахеидах по массе оценивают в среднем следующим образом: Р 7…14 %; S1 5…11 %; S2 73…84 %; S3(Т) 3…4 %. У поздних трахеид толщина стенки увеличивается за счет слоя S2, доля которого возрастает и соответственно уменьшаются доля остальных слоев [7]. Для волокон либриформа: Р + ML 1 %, S1 10 %, S2 87 %, S3 (T) 2 % [9].
Таким образом, в древесных волокнах S1 и S3(Т) образуют как бы спиральную «обмотку» вокруг основного слоя клеточной стенки – слоя S2 и защищают его от внешних воздействий со стороны срединной пластинки и полости. Отмечают высокую устойчивость слоев S1 и S3(Т) и особенно первичной стенки Р, а также бородавчатой мембраны W к действию химических реагентов [3]. Спиральная структура клеточной стенки обусловливает высокую механическую прочность древесных и целлюлозных волокон.
Стенки сосудов и паренхимных клеток по ориентации микрофибрилл несколько отличаются от стенок волокон. Определенные особенности в ориентации целлюлозных микрофибрилл характерны для клеточных стенок реактивной древесины [9]. В стенках трахеид сжатой древесины в слое S2 угол ориентации близок к 45, т.е. намного больше, чем у нормальной древесины. В стенках волокон тяговой древесины микрофибриллы ориентированы почти параллельно оси волокна. Изучение окаймленных пор показало, что в торусах мембран наблюдается кольцевая ориентация микрофибрилл целлюлозы, а в окружающей торус маргинальной (краевой, наружной) зоне мембраны тяжи микрофибрилл ориентированы радиально и удерживают торус [9]. В заболонной древесине торусы не лигнифицированы; отложение в них лигнина происходит при образовании ядровой или спелой древесины.
Продукты биокаталитической конверсии сульфатной целлюлозы и направления их использования
Состав продуктов биоконверсии целлюлозы определен многими факторами: видом и составом катализируемого субстрата, используемыми для гидролиза ферментными препаратами, физическими параметрами осуществления биоконверсии, конструктивными особенностями ферментеров [157]. В настоящее время научные исследования в области ФГ сульфатной целлюлозы направлены в основном на получение растворов сахаров с последующей их переработкой в этанол [153, 158– 161].
Целлюлозный этанол характеризуется высоким октановым числом, является экологически чистым моторным топливом [162]. Он может быть использован в качестве жидкого носителя энергии, добавки к топливу, исходного сырья для химической промышленности, может быть смешан с бензином для производства кислородсодержащего топлива, что способствует снижению выбросов парниковых газов [163]. Однако для конкурентоспособного производства сахаров в промышленном масштабе (стоимостью 0,3 доллара за кг) необходимы экономически эффективная технология предварительной обработки, низкий расход ферментативных препаратов [161]. Американские исследования в целом прогнозируют низкую стоимость этанола: 0,24–0,34 $ за литр, в отличие от европейских: 0,41–0,57 $ за литр. Исходя из теоретического выхода этанола 250–300 г/кг исходного растительного сырья, концентрация субстрата для достижения конечной концентрации этанола 40-50 г/л должна составлять 15 % [164]. Но из-за расходов, за исключением использования в пищевых продуктах или стимуляторах, производство этанола до сих пор не было выгодно [165]. Некоторые авторы предлагают сахара, полученные в результате ФГ целлюлозосодержащего сырья, использовать для продажи [165, 166]. Стоимость тонны сахаров в данном случае оценивается 408 $, тогда как 1 л этанола стоит 0,13 $. Минимальный доход от продажи сахаров, необходимый для достижения 15 % внутренней нормы прибыли, варьируется от 150 до 748 $ за тонну. Так, для сульфатной целлюлозы минимальный доход должен составлять 303…564 $ [166].
Помимо этанола из сахаров, полученных при ФГ целлюлозы, в соответствующих биохимических процессах можно синтезировать биобутанол, янтарную, лимонную, молочную и другие органические кислоты [167]. Хотя выход биобутанола по сравнению с выходом этанола будет гораздо ниже, биобутанол имеет множество преимуществ и может найти широкое применение для удовлетворения потребности в экологически безопасном топливе. В отличие от биоэтанола, биобутанол может добавляться к транспортному топливу в более высоких концентрациях. Ряд органических кислот, а также их производные, широко используются в процессах получения полимерных материалов (Таблица 1.2), мировое потребление которых к 2010 году выросло втрое и составило 260 млн. т, при этом 42 % рынка – это упаковочные материалы [167].
Большинство органических кислот используются в качестве мономеров для химического синтеза полиэфиров, сополимеров на их основе. Широко используемые в настоящее время биоразлагаемые полимерные упаковочные материалы, расходные материалы медицинского назначения производят на основе молочной и янтарной кислот и их производных [167]. Янтарная кислота может быть использована для получения пластмасс, смол, лекарственных препаратов, в пищевой промышленности, в медицине. Наиболее перспективным способом получения янтарной кислоты является биокаталитический синтез (анаэробное сбраживание сахаров, в частности глюкозы), при котором продукт характеризуется высокой чистотой. Выход янтарной кислоты составляет 0,5…0,9 г ВС/г глюкозы за 10…60 ч синтеза (Таблица 1.3) [167].
Биокаталитический процесс получения молочной кислоты в настоящее время считается наиболее оптимизированным с точки зрения степени конверсии, получения максимальной конечной концентрации продукта: до 231 г/л молочной кислоты возможно получить в процессе с подпитками субстратом (глюкозой).
В составе гидролизатов сульфатной целлюлозы кроме глюкозы в значительном количестве определяется ксилоза [153]. Использование ксилозы в качестве субстрата позволяет получить 0,85 г молочной кислоты/г субстрата (Таблица 1.3). На растворах ксилозы также возможно выращивание дрожжеподобных организмов, используемых для получения кормовых добавок для сельского хозяйства [27, 167]. Из ксилозы получают ксилит [27]. Ксилит находит применение в пищевой промышленности в качестве подсластителя. Он известен также как пищевая добавка, которая служит влагоудерживающим агентом, стабилизатором и эмульгатором. В химической промышленности ксилит используется в производстве синтетических смол, поверхностно-активных веществ и эфиров.
Помимо растворимых продуктов биоконверсии сульфатной целлюлозы остаются негидролизуемыми нерастворимые целлюлозосодержащие биоматериалы. При переработке лигноцеллюлозного сырья основным направлением утилизации негидролизуемого остатка является его использование в качестве топлива [7, 8, 27], в том числе в виде пеллет. Однако после ФГ сульфатной целлюлозы остатки представляют собой сильно разрушенные целлюлозные волокна, которые содержат устойчивую к ФГ часть целлюлозы вместе с гемицеллюлозами. Представляет интерес направленная деструкция целлюлозы до частично разрушенных фрагментов с заданной молекулярной массой. Материалы, полученные таким образом, могут быть использованы в различных технологиях, в том числе в нанотехнологиях [168]. Таким образом, актуальной является задача рационального использования твердых, не поддающихся гидролизу остатков процесса биоконверсии сульфатной целлюлозы. Представляет интерес направленная деструкция целлюлозы до фрагментов с заданной молекулярной массой и последующее их применение для производства МКЦ и порошковой целлюлозы.
Порошковая и микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) являются одними из самых распространенных производных целлюлозы. В качестве сырья для их получения могут быть использованы природные целлюлозы: хлопковая, льняная, древесные целлюлозы, выделенные из хвойных и лиственных пород древесины сульфатной или сульфитной варкой; целлюлоза, выделенная из багассы, тростника, соломы и др. [169, 170]. Известны различные способы получения МКЦ: механический (размол), термомеханический, химический (гидролиз), осаждение целлюлозы из растворов в форме порошка. Перечисленными методами получают МКЦ с сильно амортизированной структурой (порошковая целлюлоза со степенью кристалличности 36–58 %) и кристаллической структурой со степенью кристалличности 63–83 %, с довольно широким диапазоном распределения частиц по размерам (20– 400 мкм). [171, 172]. Из лигноцеллюлозных материалов МКЦ выделяли: кислотным гидролизом целлюлозы [173], термокаталитическим способом из беленых сульфатных целлюлоз [174]. При кислотном гидролизе хлопковой целлюлозы получается МКЦ с предельной степенью полимеризации 165–180 и степенью кристалличности 77–83 %. Существуют также способы, основанные на паровом взрыве, щелочной экстракции и отбелке [172]. Из целлюлоз древесины хвойных и лиственных пород, целлюлозы льна, хлопкового линта методом гидролиза слабым раствором кислоты были получены образцы МКЦ с очень схожей наноструктурой и кристалличностью 54–65 % [175]. Технологии производства порошковой целлюлозы основаны на использовании механической дезинтеграции природного целлюлозного материала или кислотного гидролиза волокнистой целлюлозы для удаления аморфных областей с последующим механическим размолом, фильтрацией, промывкой и сушкой [156, 176]. Порошковая целлюлоза может быть получена из целлюлозных отходов различных производств, которые не используются и не утилизируются.
Порошковая целлюлоза и МКЦ обладают хорошими сорбционными свойствами [177-180], поэтому находят широкое применение в фармацевтической и пищевой промышленности, в технологии окраски и различных областях техники, в качестве укрепляющей добавки при выработке биокомпозитов [171, 172, 175, 176]. Они также находят применение в областях, не характерных для традиционных целлюлозных волокон. МКЦ широко используется в производстве лекарственных форм различных препаратов, в качестве диетологической добавки, самостоятельного средства при лечении некоторых желудочно-кишечных заболеваний [177–180]. Порошковая целлюлоза может быть использована для концентрирования микробных суспензий, для выделения и аффинной хроматографии ферментов [156].
В последние годы развивается получение так называемой нанофибриллири-рованной или наноцеллюлозы, которая является разновидностью порошковой целлюлозы или МКЦ [181, 182]. Частицы наноцеллюлозы имеют высокую сорбцион-ную и реакционную способность, так как являются диспергированными различными методами до микро- и наночастиц [183]. Основными преимуществами данных препаратов целлюлоз являются химическая инертность, устойчивость к растворителям, возможность получения частиц различной формы и в широком диапазоне размеров, высокая степень кристалличности и т.д. [171].
Влияние различных факторов на процесс биоконверсии сульфатной целлюлозы
Сульфатный способ широко применяется в промышленности для выработки целлюлозы из различных хвойных и лиственных пород древесины. Часть сульфатной целлюлозы используется в небеленом виде, часть подвергается отбелке с целью удаления остаточного лигнина и получения высококачественного продукта для производства бумаги. Сульфат-целлюлозные волокна, полученные при варке в промышленных условиях, по структуре клеточных стенок могут сильно отличаться от волокон лабораторных образцов сульфатных целлюлоз. Наиболее важное значение имеют такие факторы промышленной сульфатной варки как температура и расход варочных реагентов, а также режим завершения варки и снижения температуры и давления, когда может происходить контракция (сжатие) целлюлозных волокон. Чтобы нивелировать влияние этих факторов, в данной работе использовали только промышленные образцы сульфатной целлюлозы.
Для исследуемых образцов сульфатной целлюлозы содержание целлюлозы высокое, около 75 % в лиственной целлюлозе и 80–81 % – в хвойной целлюлозе (Таблица 3.1). Образцы целлюлозы существенно отличаются по составу и содержанию гемицеллюлоз. Ксилан, присутствующий в небеленой сульфатной целлюлозе, содержит в своем составе гексенуроновые кислоты [9]. Остаточное содержание лигнина в небеленых образцах низкое, 2–3 %. Содержание экстрактивных веществ в небеленой хвойной сульфатной целлюлозе низкое – 0,1–0,2 %, выше их содержание в небеленой лиственной сульфатной целлюлозе – около 1 %. Технические целлюлозы всегда содержат некоторое количество минеральных веществ, примерно 1 %.
Одним из направлений современных научных исследований в области биоконверсии сырья растительного происхождения являются поиск и создание новых продуцентов ферментов, осуществляющих гидролиз полисахаридов растительного сырья, увеличение общей активности уже известных ферментных комплексов (преимущественно генно-инженерными методами). Важен количественный и качественный состав ферментных комплексов.
Биоконверсию сульфатной целлюлозы осуществляли смесью препаратов Р .verruculosum В1 и рекомбинантного ферментного препарата P.verruculosum F 10 в соотношении 3:1. Препарат В1 - многокомпонентный препарат широкого спектра действия. Отличительной особенностью комплекса В1 является почти полное отсутствие -глюкозидазы (целлобиазы). Добавление препарата F10 позволяет сбалансировать ферментный препарат по целлобиазе, что обеспечивает уменьшение накопления промежуточных продуктов гидролиза и позволяет достичь более высокой степени конверсии субстратов при ферментативном гидролизе.
Состав продуктов биокаталитической конверсии сульфатной целлюлозы зависит от многих факторов. Степень деструкции самой целлюлозы может быть различной: от модификации целлюлозы с частичным разрушением аморфной составляющей и сохранением ее надмолекулярной кристаллической структуры до полного разрушения кристаллической части целлюлозы с образованием моносахаридов. Степень конверсии сульфатной целлюлозы в данной работе определяли по выходу ВС и глюкозы по отношению к абсолютно сухому субстрату.
Наличие нецеллюлозных компонентов в составе сульфатных целлюлоз оказывает значительное влияние на ее ФГ. Большая концентрация ксилана в наружных слоях клеточных стенок хвойных и лиственных сульфат-целлюлозных волокон вследствие его переосаждения из раствора на заключительном этапе варки может ограничить действие целлюлаз, если в составе ферментного комплекса нет ксила-наз. Беленые образцы целлюлоз были получены после отбелки по ECF-схеме: Кс– Д0–Щ–Д1–Щ–Д2, где Кс – это стадия обработки небеленой сульфатной целлюлозы ксиланазой. Расход ксиланазы на этой стадии небольшой [29], так как решается задача разрушения некоторой части сорбированного ксилана, чтобы улучшить диффузию белящих реагентов внутрь структуры волокна. Для последующего ФГ эта стадия полезна, так как увеличивает доступность целлюлозы для действия целлю-лаз.
Повышенная концентрация лигнина в наружных слоях клеточных стенок волокон небеленых целлюлоз, служит физическим барьером, ограничивающим действие целлюлаз. В образцах небеленых сульфатных целлюлоз содержание остаточного лигнина всего 2–3 % от волокна. Однако и это очень небольшое количество лигнина отрицательно влияло на результаты ФГ. Удаление остаточного лигнина в процессе отбелки целлюлозы привело к увеличению степени конверсии через 48 ч ФГ для образцов хвойной целлюлозы на 32 %, для лиственной целлюлозы на 17 % (Рисунок 3.1, 3.2). Вероятно, главная причина состоит в том, что остаточный лигнин в составе ЛУК защищает полисахариды от действия целлюлаз и ксиланаз.
При удалении остаточного лигнина заметно увеличивается накопление в растворе ВС и глюкозы уже на начальной стадии процесса, значительная разница сохраняется и концу процесса ФГ. Сравнительная характеристика степени конверсии небеленых и беленых сульфатных целлюлоз после 48 часов ФГ представлена в таблице 3.2.
Выход глюкозы из беленых образцов сульфатной целлюлозы значительно выше, чем из небеленых (таблица 3.2). Остаточный лигнин сульфатной хвойной небеленой целлюлозы оказывает сильное отрицательное воздействие на ФГ, после его удаления при промышленной отбелке выход ВС и глюкозы увеличивается на 18 % и 36 % соответственно. Больше глюкозы получается при ФГ беленой хвойной целлюлозы, так как в этой целлюлозе содержится больше собственно целлюлозы, чем в лиственной сульфатной целлюлозе.
Важно отметить, что эти данные получены для образцов влажной (невысу-шенной) целлюлозы, структура волокон которой сильно отличается от структуры сухих волокон. При высушивании лигнин в технической целлюлозе может отчасти играть и положительную роль как аморфный материал, препятствующий сближению микрофибрилл целлюлозы при ороговении волокон. Именно этим объясняются странные, на первый взгляд, результаты польских ученых [153], которые утверждали, что полное удаление лигнина не требуется для максимального выхода глюкозы из сульфатной хвойной целлюлозы. По их данным, максимальное значение выхода глюкозы (98,9 %) было получено для образца целлюлозы с числом каппа 47,7, а при более высоком числе каппа, равном 86,2, и более низком числе каппа, равном 17,2, выход глюкозы снижался на 11,3 %, до 87,6 %. Однако, когда лигнина в волокне очень немного, его положительное влияние на ороговение волокон уменьшается, в результате образуется более плотная и сомкнутая структура клеточной стенки, что затрудняет действие карбогидраз.
Одним из ключевых факторов, влияющих на скорость конверсии сульфатной целлюлозы и выход глюкозы, во многом определяющим стоимость самого процесса является расход ферментных препаратов. При ФГ сульфатной целлюлозы расход ферментных препаратов варьировали от 5 до 65 ед. АФБ/г целлюлозы (концентрация субстрата 5 %). Максимальный выход растворимых продуктов конверсии был достигнут при расходе 65 ед. АФБ/г целлюлозы: 92 и 96 % для влажных небеленых и беленых образцов хвойной целлюлозы, соответственно. При таком расходе наблюдался практически полный ФГ глюканов до глюкозы. Следует отметить, что достаточно высокий уровень конверсии сульфатной целлюлозы достигался уже при расходе препарата 10 ед. АФБ/г целлюлозы: выход глюкозы за 24 ч составил 58 % при гидролизе небеленой хвойной целлюлозы, 74 % – при гидролизе беленой хвойной целлюлозы (Рисунок 3.3). Важно отметить, что использование расхода целлюлаз 10 ед. АФБ/г целлюлозы рекомендовано с экономической точки зрения [210]. Такой расход был выбран для дальнейших экспериментов.
Важным условием для эффективной биоконверсии сульфатной целлюлозы является величина доступной поверхности субстрата к ферментативному воздействию. Использование влажных (невысушенных) образцов хвойной сульфатной целлюлозы привело к высокому выходу растворимых продуктов гидролиза (Рисунок 3.4). Высушивание образцов целлюлозы приводит к ороговению волокна и образованию плотной структуры, что резко снижает доступность субстрата для ферментативного воздействия и выход растворимых продуктов при аналогичных условиях ФГ снижается на 30–40 %. В дальнейших экспериментах использовали только влажные образцы сульфатной целлюлозы.
Важным показателем для рентабельного производства биохимических продуктов является конечная концентрация глюкозы в ферментолизате. Основным фактором, определяющим этот показатель, является концентрация субстрата (целлюлозы) при ФГ.
Ранее во многих исследованиях использовали сравнительно низкую концентрацию целлюлозу, как правило, не более 5 % [152–154, 212–214]. В наших экспериментах, при концентрации субстрата 2–5 % концентрация раствора глюкозы составляла от 12 до 40 г/л после 24 ч гидролиза (Рисунок 3.5, 3.6).
Концепция биозавода в составе целлюлозно-бумажного предприятия
Сульфатная целлюлоза представляет больший интерес как субстрат для биоконверсии. Важные преимущества использования процесса сульфатной варки как стадии предварительной обработки древесного сырья заключаются в следующем. Во-первых, проводится регенерация неорганических химикатов, используемых для варки. Во-вторых, растворенные органические вещества и остаточный лигнин сжигаются для получения энергии. В-третьих, используется хорошо отлаженная система очистки сточных вод. Кроме того, процесс и оборудование являются проверенными технологиями, используемыми на многих ЦБК, и, следовательно, связаны с низким риском для инвестиций [24]. При биоконверсии целлюлозосодержащего сырья будущее принадлежит таким технологиям, которые обеспечивают комплексное использование растворимых и нерастворимых продуктов ферментативного гидролиза.
Известно несколько статей, посвященных технико-экономическому анализу интегрированных предприятий на базе сульфат-целлюлозных заводов с использованием различных вариантов биорефайнинга [154, 158, 212–214]. Некоторые из направлений биорефайнинга с производством биоэтанола признаны экономически приемлемыми для условий США [154]. Перспективным направлением считается получение раствора сахаров 50 %-ной концентрации как товарного продукта [166]. Для конкурентоспособного производства сахаров в промышленном масштабе (стоимостью 0,3 доллара за кг) необходимы экономически эффективная технология предварительной обработки, низкий расход ферментативных препаратов [161]. Очень важным является высокая начальная концентрация раствора сахаров, что снижает затраты на его упаривание.
Концепция биозавода в составе целлюлозно-бумажного предприятия была предложена на основании проведенных исследований. Учитывая возможные направления использования растворимых продуктов и целлюлозных остатков процесса биокаталитической конверсии влажной (невысушенной) сульфатной целлюлозы, рациональным является включение биозавода в состав целлюлозно-бумажного предприятия. В РФ есть несколько предприятий, выпускающих беленую сульфатную целлюлозу. Это три целлюлозно-бумажных комбината Группы «Илим» (филиал АО "Группа "Илим" в г. Коряжме, филиал АО "Группа "Илим" в г. Братске, филиал АО "Группа "Илим" в г. Усть-Илимске), а также АО "Архангельский целлюлозно-бумажный комбинат", АО "Монди Сыктывкарский ЛПК" и ОАО «Светогорск» компании ЗАО «Интернешнл Пейпер».
Преобразование целлюлозно-бумажного предприятия в биозавод, т.е. добавление к основному циклу производства блока биопереработки сульфатной целлюлозы с применением комплекса ферментных препаратов P. verruculosum, позволит производить предприятию наряду с целлюлозой широкий спектр товарных продуктов и принести дополнительную прибыль.
Схема биоконверсии беленой сульфатной целлюлозы показана на рисунке 3.28.
Представленные стадии биоконверсии предусматривают получение рсатво-римых продуктов ФГ и целлюлозного остатка, представляющего собой порошковую целлюлозу. Такая схема биоконверсии может быть реализована в составе цел-люлозно-бумажного предприятия как отдельный биозавод, который использует влажную целлюлозу (часть потока), энергию, химикаты и воду ЦБК и направляет на очистные сооружения предприятия свои сточные воды.
На основании проведенных исследований рекомендуются следующие условия ФГ хвойной беленой целлюлозы:
- концентрация хвойной беленой целлюлозы 15 %; рН среды 5,0;
- продолжительность 10 часов; температура 50 ОС;
- расход комплекса ферментных препаратов P. verruculosum, 10 ед. АФБ/г целлюлозы.
В результате в качестве продуктов получаются порошковая целлюлоза с выходом 64 % от исходной целлюлозы и раствор сахаров с концентрацией глюкозы 60 г/л.
Преимущества предлагаемого проекта биозавода в составе ЦБК:
- использование влажной (невысушенной) сульфатной хвойной беленой целлюлозы (нет затрат на сушку целлюлозы, высокая реакционная способность к ФГ);
- расход ферментных препаратов на экономически приемлемом уровне;
- короткая продолжительность ФГ (сокращение в 2–4 раза по сравнению с известными режимами);
- высокая концентрация субстрата 15 % (обеспечивается высокая концентрация раствора сахаров и снижение затрат на их переработку в товарные продукты);
- рациональное использование целлюлозных остатков после ФГ в виде порошковой целлюлозы и продуктов на ее основе.
При ФГ с использованием концентрации суспензии целлюлозы примерно 15 % требуется оборудование для работы при средней концентрации массы. Блок-схема биоконверсии сульфатной целлюлозы. Сульфатную целлюлозу отжимают для концентрации 30–35 % на фильтр-прессе, после которого к волокнистой массе подают раствор ферментных препаратов вместе с разбавляющей водой. Далее насосами средней концентрации волокнистую массу вместе с ферментными препаратами перекачивают в реактор для биоконверсии, где поток массы проходит сверху вниз. Таким реактором может быть типовая башня отбелки целлюлозы.
По завершению биоконверсии необходимо отделить ферментолизат сахаров и целлюлозные остатки гидролиза, для чего можно использовать различные центрифуги. Полученные ферментолизаты, содержащие глюкозу и другие сахара, предназначены для переработки в перспективные виды товарных продуктов – био-этанол, биобутанол, органические и/или аминокислоты, кормовые добавки и другие продукты биосинтеза. Целлюлозные остатки биоконверсии будут использованы для получения порошковой целлюлозы и продуктов на ее основе.
Распространенными направлениями использования моносахаридов после ферментативного гидролиза целлюлозы являются получение этанола, органических кислот. Учитывая состав и свойства целлюлозных остатков биоконверсии сульфатной целлюлозы, предложено использовать их для получения порошковой целлюлозы. Предстоит уточнить, какие продукты на основе порошковой целлюлозы будут наиболее востребованы на рынке. Одно из возможных направлений – использование порошковой целлюлозы для замены импортной МКЦ при получении препаратов целлюлаз, успешно проверено (акт испытаний, приложение).