Содержание к диссертации
Введение
1. Особенности компонентного состава и ресурсной составляющей промысловых бурых водорослей западного сегмента арктических морей России 7
1.1. Морфологическая характеристика и особенности распространения наиболее представительных видов Арктических бурых водорослей 7
1.2. Основной химический состав бурых водорослей и биологическая активность компонентов 1.2.1. Основной химический состав 10
1.2.2. Минеральные вещества 11
1.2.3. Органические вещества
1.2.3.1. Липидно-пигментный комплекс 13
1.2.3.2. Полифенольные соединения 16
1.2.3.3. Азотсодержащие вещества 18
1.2.3.4. Структурные и запасные углеводы 19
1.2.3.5. Целлюлозная составляющая биомассы бурых водорослей
1.3. Методы выделения компонентов биомассы бурых водорослей 26
1.4. Выводы. Постановка цели и задач исследования 31
2. Методическая часть 34
2.1. Объект исследований и маршруты экспедиционных работ 34
2.2. Отбор и консервация проб 36
2.3. Оборудование и реактивы 36
2.4. Анализ морской воды на точках отбора проб 38
2.5. Исследования микроструктуры талломов водорослей 39
2.6. Исследование химического состава биомассы водорослей
2.6.1. Исследование общего химического состава 39
2.6.2. Исследование минерального состава бурых водорослей 39
2.6.3. Определения элементного состава биомассы бурых водорослей 40
2.6.4. Исследование жирнокислотного состава водорослей 40
2.6.5. Определение содержания пигментов 42
2.6.6. Определение содержания полифенолов 42
2.6.7. Исследование аминокислотного состава 42
2.6.8. Анализ углеводной фракции
2.6.8.1. Определение легко- и трудно гидролизуемых полисахаридов43
2.6.8.2. Определение моносахаридного состава 44
2.7. Исследование водорослевой клетчатки 45
2.7.1. Определение содержания целлюлозы 45
2.7.2. ИК-спектроскопичекий анализ водорослевой клетчатки 45
2.7.3. Рентгенографический анализ 45
2.8. Медико-биологическая характеристика экстрактов бурых водорослей 46
2.8.1. Определение антиоксидантной активности экстрактов 46
2.8.2. Исследование биологической активности 47
2.9. Исследование сорбционных характеристик водорослевой целлюлозы 48
3. Исследование фракционного химического состава бурых водорослей (экспериментальная часть) 52
3.1. Макро- и микроэлементный состав биомассы 52
3.2. Изучение состава органической компоненты биомассы водорослей
3.2.1. Липидно-пигментный комплекс 60
3.2.2. Полифенольные соединения 64
3.2.3. Азотсодержащие вещества 65
3.2.4. Структурные и запасные углеводы 69
4. Исследование возможностей селективного разделения биомассы бурых водорослей на фракции компонентов 75
4.1. Разработка методологии разделения биомассы бурых водорослей 75
4.2. Динамика изменения морфологической структуры тканей водоросли в ходе обработок 77 4.3. Характеристика состава и свойств сверхкритического флюидного экстракта липидно-пигментного комплекса 80
4.4. Извлечение и характеристика фракции водорастворимых веществ 85
4.5. Извлечение альгиновых кислот 87
4.6. Выделение и характеристика представительных образцов водорослевой клетчатки 88
5. Оценка потребительских свойств новых препаратов из водорослевой биомассы 101
5.1. Медико-биологическая характеристика фракций водорослевого липидно-пигментного комплекса 101
5.2. Сорбционная характеристика водорослевой клетчатки
5.2.1. Факторы, влияющие на процесс сорбции 104
5.2.2. Структурная характеристика водорослевой клетчатки 105
5.2.3. Механизм сорбционных процессов на поверхности водорослевой клетчатки 107
5.2.4. Исследование влияния факторов на сорбционную емкость водорослевой клетчатки по отношению к тяжелым металлам 113
5.2.5. Исследование сорбционной емкости по отношению к патогенным микроорганизмам 120
Выводы 122
Список литературы 124
- Липидно-пигментный комплекс
- Исследования микроструктуры талломов водорослей
- Изучение состава органической компоненты биомассы водорослей
- Сорбционная характеристика водорослевой клетчатки
Введение к работе
Актуальность темы. Единственным местом европейской части России, в котором ведется добыча и переработка арктических бурых водорослей в промышленных масштабах является регион Западного сегмента Арктики: Баренцево и Белое моря, акватории островных и прибрежных территорий. При этом, промышленную ценность представляют водоросли рода ламинариевых (Laminaria digitata и Saccharina latissima) и фукусовых (Ascophillum nodosum и Fucus vesiculosus). Арктические бурые водоросли в ряду аквакультур обладают целым рядом особенностей. Они содержат ценные биологически активные вещества, такие как полифенолы, пигменты, альгиновые кислоты, маннит и другие компоненты. Текущие климатические тенденции характеризуются увеличением средней температуры воды, что приводит к изменениям в биосинтезе водорослевых компонентов и, как следствие, к изменению их химического состава. Это вызывает необходимость современных систематических исследований химического состава арктических бурых водорослей.
Как известно, арктические бурые водоросли характеризуются высоким содержанием полисахаридов, в связи с чем, они широко используются в качестве сырья для производства маннита, фукоидана и различных солей альгиновой кислоты. Соответственно, большинство применяемых технологий их переработки, в основном, направлены на извлечение полисахаридной составляющей. При этом целый ряд ценных компонентов биомассы становятся побочными продуктами и практически не используются. Это обуславливает необходимость разработки новых, современных методов комплексной переработки биомассы бурых водорослей, основанных на принципах “зеленой химии” и позволяющих получать, помимо углеводной составляющей, другие ценные компоненты, такие как химически не загрязненные препараты липидно-пигментного и полифенольного комплекса, а также энтеросорбент - водорослевую клетчатку.
Работа выполнена при поддержке: стипендии губернатора Архангельской области (2011/2012 гг), именной стипендии Правительства Российской федерации (2013-2014 гг), премии имени М.В.Ломоносова Администрации Архангельской области (2013 г), именной стипендии В.В.Потанина (2015-2016 гг), гранта РФФИ «Мой первый грант» (№ 16-33-00243), Госзадания Минобрнауки РФ на 2014-2016 гг (проект 4.1288.2014), Госзадания Минобрнауки РФ на 2017-2019 гг (проект 4.3273.2017).
Цель работы:
развитие научных основ современных способов разделения биомассы бурых водорослей на целевые группы компонентов с комплексной характеристикой их химического состава и структуры.
Для выполнения намеченной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Отбор, анализ и комплексная характеристика проб промысловых видов арктических бурых водорослей, с различных районов Белого и Баренцева морей.
-
Исследование состава минеральной фракции макрофитов западного сегмента Арктики и выявление тенденции в накоплении данных веществ.
-
Получение новых данных об индивидуальном компонентном составе веществ органической фракции биомассы бурых водорослей.
-
Разработка новой методологии разделения биомассы бурых водорослей с выделением целевых групп компонентов общей химической природы.
-
Характеристика индивидуального состава выделенных препаратов ли-пидно-пигментного комплекса и исследование их биологической активности.
-
Исследование структуры и свойств водорослевой целлюлозы, как потенциального энтеросорбента.
Научная новизна. На основании данных о химическом составе бурых водорослей предложена методология разделения их биомассы, новизна которой заключается в применении принципов “зеленой химии” (сочетание сверхкритической флюидной и жидкостной экстракции) для последовательного разделения растительной матрицы.
С применением современных методов анализа получены новые данные об индивидуальном составе жирнокислотной фракций арктических бурых водорослей. Преобладающими компонентами данной группы соединений являются мири-стиновая (до 8,6 %отн), пальмитиновая (до 18,7 %отн) и олеиновая (до 19,5 %отн) жирные кислоты. Обнаружено высокое содержание -3 и -6 полиненасыщенных жирных кислот (суммарное содержание ПНЖК в F.vesiculosus 40,5 %отн (-З - 17,8 %отн, -6 - 22,7 %отн), в L.digitata - 49,9 %отн (-З - 33,2 %отн, -6 - 16,7 %отн)). Исследуемые образцы водоросли вида L.digitata содержат 0,35 %масс жирных кислот от массы воздушно-сухого образца водоросли, в то время как водоросли вида F.vesiculosus - 1,61 %масс. Таким образом, наиболее перспективным источником фракции жирных кислот являются арктические бурые водоросли F.vesiculosus.
Установлено, что водорослевые целлюлозы представляют собой аморфные структуры с включениями кристаллических областей, преобладающей модификацией которых является la-форма (Fucus vesiculosus) и I-форма (Laminaria digitata).
Получены новые результаты исследований энтеросорбционных свойств водорослевой клетчатки. Показано, что очищенная водорослевая клетчатка проявляет выраженную сорбционную активность по отношению к тяжелым металлам и патогенным микроорганизмам.
Практическая значимость. Предложена методология комплексной, эффективной переработки биомассы бурых водорослей, отвечающая принципам “зеленой химии” (сочетание сверхкритической флюидной и жидкостной экстрак-
ции), основанная на подборе растворителей в соответствии с химической природой и свойствами выделяемых компонентов.
Выделены и охарактеризованы новые, перспективные препараты биологически активных веществ бурых водорослей, обладающие сорбционными, бактерицидными, фунгицидными, антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами: фракции липидно-пигментного комплекса и целлюлозосодержащий энте-росорбент на основе арктических бурых водорослей.
На защиту выносятся следующие положения:
-
Результаты комплексных исследований индивидуального и группового химического состава арктических бурых водорослей;
-
Методология разделения биомассы бурых водорослей на основе принципов “зеленой химии” заключающаяся в сочетании сверхкритической и жидкостной экстракции;
-
Оценка биологической активности фракций липидно-пигментного комплекса бурой водоросли вида Fucus vesiculosus;
-
Характеристика физико-химических и структурных особенностей водорослевой целлюлозы;
-
Оценка энтеросорбционных свойств водорослевой клетчатки.
Апробация работы. Результаты работы представлены на 17 международных и Всероссийских конференциях, а именно, на Международной конференции «Сверхкритические флюидные технологии в решении экологических проблем. Экстракция растительного сырья» (Архангельск, 25-27 июня 2012 г), XIII Международной конференции по химии объектов окружающей среды (Москва, 5-8 декабря 2012 г), V Международной конференции "Физикохимия растительных полимеров" (Архангельск, 8-11 июля 2013 г), Международной конференции “Биологически активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения” (27 мая - 1 июня 2013 г, Новый Свет, АР Крым, Украина), XV международной конференции по химии объектов окружающей среды (Брно, Чехия 3-6 декабря 2014 г), IX Международной научно-практической конференции "Теоретические и практические аспекты развития научной мысли: Медицинские науки, Фармацевтические науки, Ветеринарные науки, Биологические науки, Химические науки" (Москва, 27-28 марта 2015 г), VI Международной конференции «Физикохимия растительных полимеров» (Архангельск, 2015 г), Всероссийской конференции с международным участием «Комплексные научные исследования и сотрудничество в Арктике: взаимодействие ВУЗов с академическими и отраслевыми научными организациями» (Архангельск 2015 г), I Всероссийской конференции с международным участием «Химический анализ и медицина» (Москва, 9-12 ноября 2015 г), VII Всероссийской школы-конференции молодых ученых “Сверхкритические флюидные технологии в решении экологических проблем: создание перспективных материалов” (Архангельск, 13-15 сентября), на кластере конференций по органической химии “ОргХим-2016” (Санкт-Петербург, 27 июня
- 1 июля 2016 г), XIV европейской конференции по вопросам лигноцеллюлозы и целлюлозы (Отранс, Франция, 28 июля – 1 июля 2016 г), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2016» (Москва 2016 г), ХХ Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Екатеринбург 2016 г), онлайн конференции “Структура и физико-химические свойства целлюлоз и нанокомпозитов на их основе” (Петрозаводск, 6-7 октября 2016 г), VII Всероссийской конференции “Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья” (Барнаул, 24–28 апреля 2017 г), VII международной конференции Физикохимия растительных полимеров (Архангельск, 03-06 июля 2017 г).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, в том числе, 3 статьи в журналах, включенных в международные базы данных Web of Science и Scopus.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, общих выводов и списка цитируемый литературы. Материал изложен на 150 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 35 таблиц, в списке цитируемой литературы 259 источников.
Липидно-пигментный комплекс
Липиды. Липиды – широкая группа соединений, включающая в себя жиры, воска, стеролы, жирорастворимые витамины (A, D, E, K), моно-, ди- и триацилглицеролы, диглицериды, фосфолипиды и другие соединения. В то время как масла высших растений, как правило, состоят из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, содержащих 16 и 18 атомов углерода, водоросли содержат кислоты с цепочками от 14 до 22 атомов углерода [24].
Мурата и Наказо (2001) [25] утверждают, что основной источник липидов водорослей – фосфолипиды, в то время как исследования Бхаскар [26] и Хотимченко [27], напротив, полагают, что основным классом являются гликолипиды, а уже за ними следуют нейтральные липиды и фосфолипиды. Содержание липидов в бурых водорослях зависит от вида, географического положения, сезона, температуры, солености воды и интенсивности солнечного света. Кроме того, некоторые исследователи сообщают, что содержание липидов в водорослях, произрастающих в холодных регионах, выше, чем у водорослей тропических регионов [28, 29]. В среднем их содержание невелико и составляет 1-5%масс [30-32], жирные кислоты, как правило, составляют 20-50 %отн от общего содержания липидов [33].
Липиды морских водорослей содержат существенное количество длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), основными компонентами которых являются омега-3 жирные кислоты. Эйкозапентаеновая (EPA, 20:5, n-3) и докозагексаеновая кислоты (DHA, 22:6, n-3) – две наиболее важные кислоты морских липидов, вместе с их прекурсором - -линоленовой кислотой (ALA, 18:3, n-3) и докозапентаеновой кислотой (DPA, 22:5, n-3). Эйкозапентаеновая и докозагексаеновая кислоты обычно образуются из -линоленовой в результате элонгации и десатурации [24]. Обнаружено, что эти две кислоты вызывают существенные биохимические и физиологические изменения в организме. Помимо того, эти соединения выступают как структурный компонент клеток и мембран органелл и играют существенную роль в понижении содержания липидов в крови. Они также оказывают антиатеросклеротическое, антивоспалительное, гипотензивное и иммуномодулирующее действие [34, 35]. Основным источником данных кислот являются морские продукты, в частности, одноклеточный фитопланктон и морские водоросли. Наземные растения не способны синтезировать данные соединения. Помимо выше перечисленных кислот, в бурых водорослях содержится стеаридоновая кислота (С18:4, n-3), положительно влияющая на иммунную систему человека [36], а также ненасыщенные и полиненасыщенные омега-6 жирные кислоты.
Водоросли вида F.vesiculosus и L.digitata в большом количестве содержат миристиновую и пальмитиновую кислоты, а также ценные моно- и полиненасыщенные жирные кислоты.
Пигменты. Всего в водорослях существует три основных группы пигментов: хлорофиллы, каротиноиды и фикобилипротеины. Бурые (Phaeophytes), красные (Rhodophytes) и зеленые (Chlorophytes) водоросли разделены на три класса в соответствии с преобладающими в них пигментами, так, основными пигментами бурых водорослей являются фукоксантин и хлорофилл с. Кроме того, водоросли всех трех классов содержат пигмент хлорофилл а [37].
Хлорофиллы – это жирорастворимые пигменты, представляют собой комплекс ионов магния с порфириновым кольцом, участвуют в процессе фотосинтеза. Хлорофилл а поглощает видимый свет в голубой и красной областях (максимумы поглощения 430 и 662 нм), хлорофилл с, как правило, поглощает в оранжевой и красной области видимого спектра (585 и 630-638 нм) [38]. Молекула хлорофилла неустойчива, и воздействие на нее слабых кислот, солнечного света или кислорода воздуха, приводит к быстрому окислению с образованием целого ряда продуктов деградации [39]. Известно, что при приготовлении и потреблении пищи, содержащей хлорофилл, последний преобразуется в феофитин, пирофеофитин и феофорбид. Эти производные показывают антимутагенные свойства и могут играть большую роль в предотвращении раковых заболеваний [40]. Содержание хлорофилла в бурых водорослях может достигать 0,02 мг/г, что значительно меньше, чем в микроводорослях.
Каротиноиды – наиболее широко распространенные в природе пигменты, они присутствуют во всех водорослях, высших растениях и многих фотосинтетических бактериях. Данные соединения имеют цвет от красного до оранжевого и желтого. Каротиноиды – линейные полиены, которые функционируют как поглотители световой энергии, так и как антиоксиданты, инактивирующие реакционно-способные формы кислорода, образующиеся в результате воздействия света и воздуха [41].
Содержание каротиноидов в бурых водорослях невелико и может достигать порядка 0,2-0,3 мг/г. Каротиноиды наиболее интенсивно поглощают в голубой области спектра, однако, фукоксантин поглощает в зеленой области (400-560 нм) [42]. Некоторые каротиноиды защищают центры фотосинтетических реакций от избыточного света, являясь фотопротекторами [43]. Каротиноиды делятся на две группы: каротины, содержащие только молекулы углерода и водорода, и ксантофиллы, содержащие кислород [44]. Бета-каротин – основной и чаще всего единственный каротиноид, содержащийся в значительных количествах в биомассе бурых водорослей [45, 46]. Основным ксантофиллом бурых водорослей является фукоксантин, вторым по содержанию является виолаксантин, также были обнаружены антераксантин и зеаксантин [37]. В работах [44, 47] показано также наличие неоксантина и фукоксантинола как незначительных составляющих.
Фукоксантин – это ксантофилл с уникальной структурой, содержащий необычную алленовую связь и 5,6-моноэпоксид в своей молекуле [48]. Исследования показывают, что фукоксантин демонстрирует противораковую активность, в частности, он вызывал ингибирование роста клеток человеческой лейкемии с последующим их апоптозом [49, 50]. Кроме того, в работе [50] показано, что фукоксантин может выступать в качестве пищевой добавки для препятствия ожирению. Фукоксантин и каротиноиды проявляют антиоксидантную активность [51, 52] и противовоспалительное действие [53], каротиноиды также являются провитаминами витамина А.
Исследования микроструктуры талломов водорослей
Качественный и количественный минеральный состав биомассы водорослей был исследован методом рентгенофлуоресцентного анализа на волнодисперсионном рентгенофлуорисцентном спектрофотометре XRF-1800 по результатам двух параллельных определений, с коэффициентом вариации 1 Химический анализ проводили в центре коллективного использования научным оборудованием Арктика САФУ не более 6 %. Условия определения: напряжение 40 кВ, сила тока 95 мА, лампа с родиевым анодом, с использованием кристаллов анализаторов LiF, Ge, PET, TAP; детекторы сцинтилляционный и полупроводниковый, экспликация 40 с, в атмосфере вакуума. Результат выражали в процентах массовых.
Концентрацию ртути определяли методом атомной адсорбции (метод холодного пара), на атомно-адсорбционном спектрометре Mercury АА Analitic Jena по стандартной методике [134]. Сущность метода заключается в измерении величины поглощения луча света определенной (резонансной) длины волны от источника, проходящего через атомный пар.
Элементный состав биомассы водорослей определяли на элементном анализаторе EuroEA – 3000 с относительной погрешностью не более 5 %. Условия определения: CHNS-конфигурация, высокотемпературное сжигание пробы в присутствии кислорода с последующим газохроматографическим разделением и детектированием продуктов сгорания при помощи высокочувствительного катарометрического детектора. Температура печи 980 0С, температура детектора 115 0С, время окисления 6,6 секунд, давление 120 кПа. Относительная погрешность не более 5 %. Результат выражали в процентах массовых.
Экстракция липидов. Экстракцию липидов осуществляли по методике Блайя и Дайера [135]. Навеску измельченных водорослей с массой (1,0 ± 0,1) г помещали в коническую колбу объемом 50 мл и добавляли 4 мл дистиллированной воды. Затем в колбу добавляли 15 мл смеси хлороформ-метанол в соотношении 1:2 и перемешивали в течение 5 минут. Затем поочередно добавляли 5 мл хлороформа и 5 мл воды и перемешивали смесь после добавления каждого компонента в течение 5 минут. Далее раствор фильтровали и оставляли на несколько минут для расслоения водного и хлороформного слоев. Отбирали хлороформный слой, выпаривали досуха в роторном испарителе, остаток перерастворяли в 0,5 мл гексана и хранили при температуре -20 С.
Получение метиловых эфиров жирных кислот. Этерификацию жирных кислот осуществляли по методике Карро [136]. В пробирку Эппендорфа помещали 200 мкл экстракта, добавляли 0,5 мл 1 % метилата натрия и нагревали 5 минут при 55 С. Затем смесь охлаждали, прибавляли 0,5 мл 5 % раствора HCl в метаноле (раствор приготовлен путем пропускания газообразной хлороводородной кислоты через метанол) и нагревали еще 5 минут при 55 С. После охлаждения получившийся раствор перенесли в виалу объемом 4 мл, добавили 2 мл дистиллированной воды и провели трехкратную экстракцию 0,5 мл гексана. Экстракты объединяли, дважды промывали дистиллированной водой (по 0,5 мл), выпаривали в токе азота и взвешивали. Затем метиловые эфиры жирных кислот растворяли в 0,4 мл гексана и хранили при температуре -20 С.
Для проверки полноты этерификации в навеску водоросли до экстракции вносили 0,5 мл гексанового раствора, содержащего 2 мг нонадекановой кислоты. Для количественного анализа жирных кислот в раствор с метиловыми эфирами жирных кислот вносили 100 мкл гексанового раствора, содержащего 1 мг метилового эфира гептадекановой кислоты.
Газохроматографический метод анализа метиловых эфиров жирных кислот. Хроматографический анализ выполняли на газовом хроматографе Agilent Technologies 7820A GC System Maestro. Для разделения использовали колонку HP-INNOWAX, 60 м 0,25 мм 0,50 мкм. Газ носитель – азот. Детектор – пламенно-ионизационный. Начальная температура – 80 0С (5 минут). Конечная температура – 250 0С (47 минут). Скорость подъема 2,5 град/мин. Объем пробы – 2 мкл. Деление потока – 10:1. Температура испарителя – 280 0С. Температура детектора – 300 0С. Частота опроса детектора 20 Гц. Поток поддувочного газа для детектора (азот) – 23 мл/мин. Скорость газа-носителя в колонке – 2 мл/мин. Поток воздуха 300 мл/мин, водорода 30 мл/мин. Общее время анализа – 120 мин.
Пигменты экстрагировали из перемолотых водорослей ацетоном в аппарате Сокслета [137]. Разделение ацетонового экстракта бурых водорослей производили с помощью жидкостной хроматографии на ВЭЖХ системе LC-30 Nexera (Колонка Luna C-18 (Phenomenex), элюент: 80 % ацетонитрил, 20 % изопропанол, скорость потока 1 мл/мин, температура 35 0С, детектирование на 450 нм) с последующим детектированием пигментов при 665 и 440 нм на фотометрическом детекторе. Относительное значение стандартного отклонения при анализе не превышает 10 %. Результат выражали в мг/г.
Суммарное содержание полифенольной фракции определяли колориметрическим методом с применением реактива Folin-Ciocalteu [138]. В качестве стандарта использовали флороглюцин. Относительное значение стандартного отклонения при анализе не превышает 5 %. Результат выражали в процентах массовых.
Аминокислотный состав определяли ВЭЖХ методом [139] на аминокислотном анализаторе Biochrom 30+ после полного кислотного гидролиза пептидных связей раствором 6М соляной кислоты, в соответствии с ГОСТ [140] с относительной погрешностью не более 7 %. Результат выражали в процентах массовых.
Метод заключается в разделении смеси аминокислот на ионообменной колонке, с последовательным вымыванием аминокислот пятью литиево-цитратными буферными растворами с увеличением ионной силы и pH от первого к последнему. Далее проводится постколоночная дериватизация раствором нингидрина, образующим интенсивную окраску аминокислот и последующим фотометрическим детектированием цветных продуктов. Условия определения: тип колонки Peek, длинна 200 мм, диаметр 4,6 мм, буферный раствор на основе цитрата лития, скорость подачи буферного раствора 31,2 мл/ч, скорость подачи нингидрина 25 мл/ч. Относительное значение стандартного отклонения при анализе не превышает 10 %.
Влажность, содержание альгиновых кислот и маннита было определено стандартным методом по ГОСТ [132]. Моносахаридный состав биомассы бурых водорослей определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [20] и методом газовой хроматографии с масс детектированием (ГХ-МС).
Изучение состава органической компоненты биомассы водорослей
В отличие от наземных растений и животных, которые содержат незначительные количества йода, в водорослях обнаруживаются значительные количества этого вещества [161]. В нашем исследовании были обнаружены концентрации йода от 0,148 до 0,619 %масс для ламинариевых водорослей и от 0 до 0,102 %масс для фукусовых (таблица 3.3). В образцах исследованных ламинариевых водорослей различий между накоплением йода не обнаружено, а из двух фукусовых водорослей накопление йода более выражено в образцах Ascophyllum nodosum. Однако следует отметить, что среднее содержание йода в образцах ламинариевых водорослей из Баренцева моря в 1,5 раза выше, чем в образцах, отобранных в Белом море (0,321 и 0,225 %масс соответственно). Это можно объяснить более высокой соленостью Баренцева моря по сравнению с Белым (таблица 3.1). В работе Коровкиной и др. [162] так же отмечена положительная зависимость между соленостью и содержанием йода.
Несмотря на то, что существуют литературные данные о положительной зависимости между содержанием ионов Mg2+, Ca2+, K+ и Na+ в воде и накоплением этих элементов в водорослях [15], в ходе наших исследований эти тенденции не выявлены.
Распределение макро- и микроэлементов в бурых водорослях, обладающих богатым минеральным составом, зависит в большей степени от семейства, к которому принадлежит водоросль, чем от места произрастания.
Экологическое состояние мест произрастания бурых водорослей оценивалось по содержанию в биообразцах тяжелых металлов: свинца и ртути (таблица 3.3). Наиболее опасным для человека элементом, из рассматриваемых в нашей работе, является ртуть [18].
По результатам проведенного анализа образцов бурых водорослей установлено наличие лишь следов ртути, что соответственно не превышает нормативных показателей [163].
Свинец так же является токсичным тяжелым металлом, часто встречающимся в зонах, подверженных антропогенному воздействию. В большинстве образцов данный элемент не был найден, однако в некоторых образцах были обнаружены концентрации от 0,0002 до 0,0012 %масс (таблица 3.3), что, впрочем, является слабым превышением естественного фона.
Подобные результаты по содержанию свинца и ртути, в образцах бурых водорослей из акватории Белого моря, были получены в ходе исследования Подкорытовой и др. в 2009 году [20].
Таким образом, изучен состав минеральной фракции арктических бурых водорослей. Исследование тенденций накопления минеральных веществ биомассой бурых водорослей показало значительное влияние солености и катионного состава морской воды на общую минерализацию и макро- и микроэлементный состав макрофитов. Установлено, что Беломорские водоросли характеризуются меньшим количеством минеральных веществ в биомассе, в сравнении с макрофитами из Баренцева моря, что несомненно сказывается на содержании органо-минеральных комплексов в органической фракции. Можно утверждать, что органические компоненты Баренцевоморских макрофитов в большей степени связаны в комплексы с металлами. Соответственно, Беломорские макрофиты представляют большую промышленную ценность.
Влияние природно-климатических факторов в условиях изменяющегося климата высоких широт проявляется в изменении количественного и качественного состава органической составляющей биомассы водорослей. 3.2.1. Липидно-пигментный комплекс Пигменты. В данном исследовании экспериментально определено суммарное содержание хлорофиллов и каротиноидов. Содержание хлорофиллов варьируется от 0,005 до 0,045 %масс от абсолютно сухой массы водорослей, а содержание каротиноидов - от 0,005 % до 0,0250 %масс. Наибольшим содержанием пигментов характеризуются виды l.digitata и f.vesiculosus. При этом, при движении с севера на юг прослеживается тенденция к увеличению содержания как хлорофилла, так и каротиноидов (рисунок 3.1, 3.2).
Таким образом, фукусовые водоросли являются более ценными источниками хлорофилла и каротиноидов, чем ламинариевые. Хотя бурые водоросли сравнительно бедны пигментами, они могут являться перспективным источником данных биологически активных веществ, ввиду высоких урожаев и высокой степени возобновляемости данного вида сырья.
Состав жирнокислотной фракции В соответствии с данными, полученными при экстракции традиционным методом, исследуемые образцы водоросли вида L.digitata содержат жирные кислоты 0,35 %масс от массы воздушно-сухого образца водоросли, а водоросли вида F.vesiculosus – 1,61 %масс.
Согласно данным, полученным методом газовой хроматографии (таблицы 3.4 и 3.5) исследуемые образцы содержат кислоты разной степени насыщенности, основными компонентами являются миристиновая, пальмитиновая и олеиновая жирные кислоты. Экспериментально подтверждено, что основными насыщенными жирными кислотами рассмотренных водорослей являются миристиновая и пальмитиновая. Причем, если содержание пальмитиновой кислоты в l.digitata выше, чем в f. vesiculosus на 30 %, то содержание миристиновой кислоты выше в f.vesiculosus (таблица 3.4 и 3.5). Эти типы водорослей характеризуются высоким содержанием олеиновой кислоты (32,7 %отн для f.vesiculosus и 17,1 %отн для l.digitata). Кроме того, в обоих видах водорослей обнаружено относительно высокое содержание -3 и -6 полиненасыщенных жирных кислот – линолевой, -линоленовой, стеаридоновой, арахидоновой и эйкозапентановой кислот. В целом, соотношение жирных кислот в образцах обоих видов довольно схоже с литературными данными [20, 31, 164].
Сорбционная характеристика водорослевой клетчатки
Химический состав ВК представлен в таблице 4.6. Элементный состав очищенной клетчатки представлен в таблице 4.7.
Из представленных данных видно, что основным компонентом очищенной клетчатки является целлюлоза: 580±30 и 320±15 мг/г для L.digitata и F.vesiculosus, соответственно. В ходе очистки из целлюлозной матрицы полностью удаляются остаточные количества альгиновых кислот и легкогидролизуемых полисахаридов (ЛГП). Содержание белка в очищенной клетчатке довольно высоко: 350±35 и 260±26 мг/г для L.digitata и F.vesiculosus соответственно, при этом лишь незначительная часть белка извлекается в ходе очистки (удаляется порядка 10 %отн от содержания белков). Остаточные белки нерастворимы как в воде, так и в разбавленных растворах кислот и щелочей. Исходя из этого, можно сделать вывод, что данные белки, возможно, химически связаны с другими компонентами водорослей либо участвуют в образовании механической ткани водорослей, в связи с чем, они приобретают гидрофобные свойства.
Содержание минеральных веществ в очищенной клетчатке невелико: 35±2 и 42±2 мг/г для L.digitata и F.vesiculosus, соответственно. Их присутствие обусловлено наличием в водорослевой биомассе солей, а также способностью полисахаридов химически связывать различные металлы.
Тип клетчатки Содержание компонентов, мг/г в.с. клетчатки Целлюл оза Альгиновы е кислоты ЛГП Белки Минеральны е вещества L.digitata 305±20 210±5 41±2 170±20 71±4 F.vesiculosus 205±10 145±6 40±1 170±20 68±3 L.digitata (очищенная) 580±30 H.n.o. H.n.o. 350±35 35±2 F.vesiculosus(очищенная) 320±15 H.n.o. H.n.o. 260±26 42±2 - клетчатка получена в ходе комплексной переработки биомассы водорослей по предложенной схеме Таблица 4.7. Элементный состав очищенной водорослевой клетчатки Тип клетчатки Содержание элемента, %отн N С H S клетчатка F.vesiculosus 2,89±0,29 46,86±3,28 5,74±0,40 2,52±0,18 клетчатка L.digitata 4,68±0,47 45,77±3,20 7,07±0,49 2,72±0,19 очищенная клетчатка F.vesiculosus 4,77±0,48 49,21±3,44 5,62±0,39 0,74±0,05 очищенная клетчатка L.digitata 6,54±0,65 45,84±3,21 6,65±4,67 1,12±0,08 Рисунок 4.11. ИК-спектры образцов клетчатки после обработки водой: а – Fucus vesiculosus, б – Laminaria digitata Клетчатку после очистки водой анализировали методом ИК-Фурье-спектроскопии, полученные данные представлены на рисунке 4.11. В целом, полученные спектры для Fucus vesiculosus и Laminaria digitata весьма схожи. В спектрах обоих образцов наблюдаются полосы поглощения при 3300-3200 см-1 и 2950-2850 см-1, что соответствует валентным колебаниям ОН-групп и связей С-Н, соответственно. Наиболее интенсивными являются полосы в районе 1030 см-1, соответствующие колебаниям связей C-C, C-OH, C-H, что характерно для полисахаридов, вероятно для целлюлозы. Полоса поглощения при 1158 см-1 может соответствовать С-О-С колебаниям в молекулах полисахаридов. Кроме того, для образца водоросли Fucus vesiculosus наблюдаются полосы поглощения 1247 см-1 и 821 см-1, предположительно, отвечающие колебаниям связей S=O и C-O-S, что, означает наличие в образце клетчатки следов фукоидана. Также наблюдается интенсивная полоса около 1614 см-1, которая может соответствовать колебаниям связей O-C-O карбоксильного иона, что характерно для солей альгиновой кислоты. Для образца клетчатки, полученного из водоросли Laminaria digitata наблюдается полоса поглощения 898 см-1, которая, с одной стороны, может отвечать C-O-C, C-C-O и C-C-H колебаниям, характерным для полисахаридов, а с другой стороны, может означать присутствие полисахаридов с -гликозидной связью. Полосы поглощения при 1644, 1370, 1315 см-1 типичны для глюканов с 1-3 связью, что может свидетельствовать о наличии в образце целлюлозы и ламинарана.
Исследование свойств и структурных особенностей водорослевой целлюлозы Как было отмечено ранее, реакционная способность любого сорбента целлюлозного типа определяется его надмолекулярной структурой [192, 193]. Макромолекулы целлюлозы образуют в микрофибрилле области с различной степенью упорядоченности: кристаллические, характеризующиеся высокой степенью упорядоченности, и аморфные, распределение которых по длине микрофибриллы носит статистический характер. Количественно соотношение между кристаллической и аморфной фазами можно охарактеризовать степенью кристалличности.
Для изучения структуры полученных образцов использовался рентгеноструктурный анализ. На рисунке 4.12 приведены кривые распределения интенсивности рассеяния образцов водорослевой клетчатки, отснятых в геометриях на отражение и прохождение (просвет).
Как следует из рисунка 4.12, рентгенограммы образцов Fucus vesiculosus содержат только следы отражений кристаллической целлюлозы, в то время как на рентгенограммах образцов Laminaria digitata отражения от кристаллической целлюлозы выражены четко.
Степень кристалличности рассчитывалась из рентгенограмм, полученных в геометриях на отражение и просвет. Состав кристаллической составляющей оценивался из рентгенограмм, полученных на отражение. Полученные результаты представлены в таблице 4.8. Рисунок 4.12. Рентгенограммы образцов: Fucus vesiculosa, образцы 1, 3, 5: а - съемка на отражение; в - на просвет; Laminaria digitata, образцы 2, 4, 6: б - съемка на отражение; г на просвет. Теоретически рассчитанные рентгенограммы целлюлоз: — la; IP; — ЦП. тражения, не характерные для полиморфных фаз целлюлозы . Степень кристалличности (СК) и концентрации фаз целлюлозы в кристаллической компоненте ( -параллельная ориентация целлюлозных цепочек, Т- антипараллельная.), %отн
Клетчатка очищенная 19 42 - - 58 40 28 51 - 21 Из данных, представленных в таблице 4.8, следует, что в исходных образцах Laminaria digitata степень кристалличности выше почти вдвое, чем в исходных образцах Fucus vesiculosus - 28 % и 16 %отн, соответственно. В составе кристаллической компоненты этих образцов преобладает целлюлоза Іа - триклинная модификация с одним целлобиозным остатком на элементарную ячейку и параллельной ориентацией целлюлозных цепочек (60 и 66 %отн, соответственно). В образце Laminaria digitata наблюдается наличие целлюлозы I - моноклинной модификации с двумя целлобиозными остатками на элементарную ячейку и антипараллельной ориентацией целлюлозных цепочек.
Существует лишь несколько публикаций, в которых представлены данные о существовании природной целлюлозы II [194,195]. Стоит также отметить работу [85], авторы которой сообщают о наличии в составе водорослей целлюлоз с низкой степенью кристалличности, близких по строению к целлюлозе II, но таковой не являющейся. Таким образом, мы предполагаем, что в состав исследуемых образцов входит не целлюлоза II, а производное целлюлозы с неустановленной структурой схожей с целлюлозой
п.
Целлюлоза, содержащаяся в образцах клетчаток, обладает большей степенью кристалличности по сравнению с исходными водорослями, что особенно заметно для целлюлозы клетчатки из водоросли вида Laminaria digitata. Данный образец содержит 1а и I формы целлюлозы (37 % и 51 % соответственно), а также небольшое количество схожего с целлюлозой II производного. Клетчатка водоросли вида Fucus vesiculosus характеризуется меньшей по сравнению с Laminaria digitata степенью кристалличности (24 % и 42 %, соответственно) и преобладающим компонентом в ней является метастабильная целлюлоза 1а.