Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Медико-социальная и клиническая значимость сахарного диабета 15
1.2. Медико-социальная и клиническая значимость сенсоневральной тугоухости 16
1.3. Распространенность и особенности сенсоневральной тугоухости у пациентов с сахарным диабетом 20
1.4. Характер клинического сочетания сенсоневральной тугоухости и сахарного диабета 25
1.5. Роль молекулярно-генетических факторов в патогенезе хронических осложнений сахарного диабета 27
1.5.1. NO-синтаза 3 27
1.5.2. Глутатион-S-трансфераза 29
1.5.3. Матриксная металлопротеиназа 9 31
1.5.4. Параоксоназа 1 32
1.5.5. Метилентетрагидрофолатредуктаза 33
1.5.6. Супероксиддисмутаза 2 35
1.6. Лечение хронической сенсоневральной тугоухости 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Планирование исследования 39
2.2. Общая характеристика обследованных пациентов 39
2.2.1. Общая характеристика обследованных групп пациентов 42
2.2.2. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с сахарным диабетом 45
2.3. Методы лабораторного исследования углеводного обмена 48
2.4. Методики аудиологического обследования 50
2.5. Методики молекулярно-генетического скрининга 54
2.6. Характер изучаемой слухоулучшающей терапии 62
2.7. Методы статистической обработки 64
Глава 3. Результаты собственных исследований 65
3.1. Результаты исследования состояния слуха у пациентов с сахарным диабетом 2 типа 65
3.1.1. Результаты исследования остроты слуха методом тональной пороговой аудиометрии 65
3.1.2. Результаты исследования отоакустической эмиссии 75
3.1.3. Результаты исследования состояния разборчивости речи 76
3.2. Связь клинических особенностей течения сахарного диабета и состояния слуха 78
3.3. Основные результаты генетического обследования пациентов с сахарным диабетом 2 типа 3.3.1. Полиморфизм «нулевой» делеции гена глутатион-S-трансферазы-1 82
3.3.2. Полиморфизм «нулевой» делеции гена глутатион-S-трансферазы-1 86
3.3.3. Полиморфизм Q191R гена параоксоназы 1 91
3.3.4. Полиморфизм Glu298Asp гена NO-синтазы 3 92
3.3.5. Полиморфизм C677T гена метилентетрагидрофолатредуктазы 93
3.3.6. Полиморфизм C1562T гена матриксной металлопротеиназы 9 94
3.3.7. Полиморфизм Val9Ala гена супероксиддисмутазы 2 95
3.4. Результаты проведения слухоулучшающей терапии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа с сенсоневральной тугоухостью 96
Глава 4. Обсуждение результатов 101
Выводы 108
Практические рекомендации 109
Перспективы дальнейшей разработки темы 110
Список сокращений и условных обозначений 111
Список литературы 112
Приложение 138
- Распространенность и особенности сенсоневральной тугоухости у пациентов с сахарным диабетом
- Методики молекулярно-генетического скрининга
- Полиморфизм «нулевой» делеции гена глутатион-S-трансферазы-1
- Результаты проведения слухоулучшающей терапии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа с сенсоневральной тугоухостью
Распространенность и особенности сенсоневральной тугоухости у пациентов с сахарным диабетом
В 1857 году в литературе появилось первое сообщение о нарушении слуха у пациента, перенесшего диабетическую кому [112]. С тех пор было проведено множество исследований, посвященных распространенности СНТ, особенностям её клинического течения у лиц с СД, их результаты неоднозначны. Встречаемость СНТ среди пациентов с СД разнится от 28,5% до 95% [72, 172]. Указанные различия между клиническими исследованиями, проводимыми даже в последнее десятилетие, могут объясняться неоднородностью клинических групп. Выявление СНТ у пациентов при СД существенно зависит от возраста пациентов [57, 145, 188]. Это позволяет предполагать, что механизмы пресбиакузиса имеют более значимое патогенетическое значение для повреждения слуха, чем метаболические нарушения, вызванные течением СД. В то же время, надо отметить работы, в которых связь СНТ с СД наблюдалась только у пациентов в группе моложе 50–65 лет [52, 195]. На сочетание СНТ и СД оказывают влияние неспецифические генетические особенности популяции, определяемые, в частности, этнической принадлежностью [57]. Встречаемость СНТ при СД увеличивается в условиях отсутствия компенсации нарушений углеводного обмена и уже существующих хронических диабетических осложнений [52, 57, 107, 145, 157, 195]. Ряд работ демонстрируют отсутствие связи между СД и СНТ [55, 97, 178]. С другой стороны, ряд авторов рассматривает нарушение слуха как одно из диабетических осложнений, развивающихся по механизму микроангиопатии, нейропатии в тканевых элементах слухового анализатора.
Таким образом, в настоящее время нет единого мнения относительно этиологии и патогенеза СНТ при СД. Следует обратить внимание на то, что в исследованиях последних 20 лет другие исследователи, тем не менее, указывают на ассоциацию между этими заболеваниями. Вероятно, это происходит благодаря использованию более точных, чем тональная пороговая аудиометрия, диагностических методов (высокочастотная аудиометрия, отоакустическая эмиссия, слуховые вызванные потенциалы) (таблица 2).
Таким образом, по результатам многочисленных исследований показано, что нарушения слуха при СД могут ухудшаться при отсутствии достаточного гликемического контроля и наличии хронических диабетических осложнений [52, 57, 107, 145, 157, 195].
Основные выводы о закономерностях сочетания СНТ и СД, которые можно сделать при анализе представленных работ, следующие. Общепринятым методом оценки остроты слуха и выявления тугоухости является тональная пороговая аудиометрия. Более совершенным вариантом тональной пороговой аудиометрии и, соответственно, более чувствительным к выявлению начального повреждения является методика пороговой аудиометрии в расширенном диапазоне частот.
Согласно критериям ВОЗ состояние тугоухости верифицируется при порогах чувствительности к тонам на 3-х речевых частотах (0,5, 1, 2 кГц), начиная с 25 дБ [204]. Единого мнения о том, нарушение восприятия каких частот следует считать характерным для СД, в настоящее время нет. Рядом исследователей было выявлено повышение порога чувствительности на всех частотах [52, 56, 157], другими — только к высоким [107, 188, 195]. В единичных исследованиях, как в работе Bamanie A. H. и соавт. [57], при анализе 109 случаев пациентов с СД 2 типа отмечено, напротив, нарушение восприятия тонов на низких и средних частотах [57], что, возможно, обусловлено этническими особенностями клинической группы (коренные жители Саудовской Аравии).
Другой аудиологической методикой для обследования пациентов с тугоухостью является регистрация длинно- и коротколатентных слуховых вызванных потенциалов. Суть метода в регистрации электрического импульса, возникающего в головном мозге в ответ на тестирующий сигнал (щелчок или тон). Последовательные колебания (пики) отражают состояние синаптических переключений при прохождении электрического импульса по нервной цепи слухового анализатора. Особенность этих методик — объективность получаемых результатов, а также возможность уточнить топическое звено нарушения проведения нервного импульса от рецептора до слуховой коры головного мозга.
Регистрация вызванных потенциалов у пациентов с СД выявляла уменьшение амплитуды пика V [121] или всех пиков [122], увеличение латентности пика V [33, 63, 64, 92, 96, 121], увеличение длительности интервала I–V [79, 121, 122, 171, 200]. Такие изменения свидетельствуют о сокращении нейрональной клеточности в синаптических участках анализатора (уменьшение амплитуды пика), о снижении скорости проведения и/или нарушении синхронности проведения сигнала на ретрокохлеарном участке из-за повреждения миелиновой оболочки (увеличение латентности) [3].
Методики молекулярно-генетического скрининга
Определение полиморфизмов генов осуществлялось в отделе молекулярно-генетических технологий и нанобиотехнологий (зав. д.м.н., член-корр. РАН М. В. Дубина) НИЦ ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И. П. Павлова» МЗ РФ.
Для выделения ДНК из лейкоцитов периферической крови модифицированным фенольным методом [124] проводили забор венозной крови в вакуумную пробирку с антикоагулянтом (после забора образец замораживали). Клетки осаждали и разрушали клеточные и ядерные мембраны при помощи буферного раствора Канкеля в объеме 0,5 мл. Фенол, хлороформ и их смесь 1:1 применяли для экстракции белков. ДНК осаждалалась с использованием этанола с СН3СООNa, после чего центрифугировалась. Полученный осадок отмывали в спирте этиловом, сушили, а затем растворяли в дистилированной воде. ДНК хранилась при +4С.
Для определения генетических полиморфизмов использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом.
Использовались автоматический термоциклер “Терцик” ("ДНК-технология", Москва) и Taq-полимераза (“Promega”, США).
Реакционная смесь включала ДНК, праймеры соответствующих пар, смесь дезоксинуклеотидфосфатов, амплификационный буфер, формамид, Taq-ДНК-полимеразу и минеральное масло. Проводилась денатурация образца в течение 5 мин при +95С, после чего делали 35 циклов ПЦР [12]. При амплификации фрагмента температура отжига ДНК была специфична, выбор осуществлялся в соответствии с используемыми праймерами.
После этого полученные субстанции подвергали электрофоретическому разделению в полиакриламидном геле в трис-боратном буфере. Его продолжительность определяли по движению красителей буфера для нанесения проб. Оценку результатата проводили после окрашивания этидием бромистым в ультрафиолетовом свете [36].
В исследовании использовали реактивы следующих фирм: “Serva” Германия, “Reanal Laboratories” Венгрия, “Вектон” Россия, “Promega”, “Fisherbiotech Laboratories”, “Fermentas”, бычий сывороточный альбумин.
Для типирования MTHFR использовали два праймера [120]. После проведения ПЦР получали фрагмент ДНК в 198 пар пуклеотидов. После рестрикционного анализа при замене С на Т в 677 позици MTHFR и образуется сайт рестрикции, идентифицирующий этот вариант аллели по появлению фрагментов ДНК с 178 и 20 парами нуклеотидов. Если аллель нормальный, после ретсрикционного анализа размер получаемого фрагмента не изменялся (рисунок 1).
Определение Q191R в PON-1 осуществлялось ранее описанным способом [47]. При амплификации использовались два праймера. После ПЦР проводили рестрикцию продукта длиной 99 пар нуклеотидов. При полиморфном варианте получались фрагменты ДНК размером 28, 31 и 41 пар нуклеотидов. При диком типе проявляются 2 фрагмента: 40 и 59 пар нуклеотидов (рисунок 2).
Определение делеции GSTM-1 осуществлялось с использованием двух праймеров при амплификации [215]. Получение продукта рестрикции в 231 пар нуклеотидов означало наличие дикого аллеля гена в гетеро- или гомозиготном состоянии. Такие варианты обозначали GSTM-1+. При отсутствии описанного фрагмента регистрировалась делеции гена GSTM-1 в гомозиготном положении (обозначали как GSTM-1 0) (рисунок 3).
Для генотипирования делеции гена GSTT-1 использовался набор из двух пар праймеров по методу Abdel-Rahman S. и соавт. [45]. Продукт ПЦР длиной 480 пар нуклеотидов указывал на наличие генотипа GSTT-1 1, при отсутствии такового регистрировали гомозиготную «нулевую» делецию (GSTT-1 0).
С целью определения замены С1562Т ММР-9 использовали два известных праймера [213]. Продуктом ПЦР был фрагмент размером 435 пар нуклеотидов. Сайт рестрикции для рестриктазы SphI появляется при замене в -1562 позиции С на Т (рисунок 5).
Для определения замены Val9Ala в SOD-2 применяли ранее указанный метод (Tiwari et al., 1999). После амплификации образовывался фрагмент размером 91 пар нуклеотидов. При варианте Ala9 образовывался фрагмент в 91 пару нуклеотидов, при Val9 — фрагменты в 17 и 74 пары нуклеотидов (рисунок 6).
Для определения замены Glu298Asp в NOS-3 применяли ранее указанный метод (MacLeod M. J. et al, 1999). Осуществляли амплификацию с двумя известными праймерами, после чего образовывался фрагмент 200 пар нуклеотидов. При варианте Asp298 регистрировали фрагменты длиной 101 и 99 пар нуклеотидов, при Glu298 — один, размером 200 пар (рисунок 7).
Полиморфизм «нулевой» делеции гена глутатион-S-трансферазы-1
Результаты типирования «нулевой» делеции гена GSTT-1 представлены в таблице 28 приложения. Различия в частоте обнаружения генетического полиморфизма между двумя группами были не значимы.
Распределение пациентов с СД 2 типа по генотипу GSTT-1 в зависимости от наличия СНТ представлено в таблице 29 приложения. Данных о статистически значимом различии в частоте обнаружения «нулевой» делеции гена в подгруппах с СНТ и без неё получено не было. Результаты обработки аудиометрических показателей представлены на рисунках 16, 17 и в таблицах 30, 31 приложения.
Представленные в таблицах 30 и 31 приложения и на рисунках 16 и 17 данные демонстрируют у пациентов с СД 2-го типа влияние генотипа GSTT-1 на тональный слух (и по воздушному, и по костному проведению). «Нулевая» делеция GSTT-1 проявляется худшими показателями тонального слуха практически на всех частотах.
Ниже представлены (рисунки 18 и 19 и таблицы 32 и 33 приложения) аудиологические данные контрольной группы с учетом характера генотипа GSTT-1.
В контрольной группе не было получено данных, указывающих, что этот генотип оказывает влияние на остроту слуха (таблицы 32, 33 приложения).
В таблице 22 представлены показатели разборчивости речи у пациентов с СД 2-го типа в зависимости от характера генотипа GSTT-1. Аналогично состоянию тонального слуха у пациентов с СД 2 типа при носительстве генотипа GSTT-1 0 наблюдались и худшие показатели речевой разборчивости (таблица 23).
При попарном сравнении приведенных показателей встречаемости генотипов GSTT-1 + и GSTT-1 0 у пациентов при различной степени СНТ с использованием критерия согласия 2 не обнаружено статистически значимых различий.
Результаты проведения слухоулучшающей терапии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа с сенсоневральной тугоухостью
В таблицах 29 и 30 представлены данные «Русского речевого теста 2» по результатам курсов лазерной терапии и лечения комплексным препаратом на основе янтарной кислоты.
Как видно из представленных данных, клинического эффекта лазеротерапии на функциональное состояние центрального звена слухового анализатора не наблюдалось (p 0,05).
Проведение парентерального курса комплексным препаратом на основе янтарной кислоты у пациентов с СД 2 типа в сочетании с СНТ оказывало слухоулучшающее действие, что демонстрировалось улучшением показателей разборчивости речи в условиях маскеров «шум толпы» и «женское многоголосие» (p 0,05).
Для выяснения вопроса о существовании генетических маркеров чувствительности к слухоулучшающей терапии комплексным препаратом на основе янтарной кислоты был предпринят анализ результатов лечения с учетом различных вариантов изучаемых генотипов (таблица 31).
Из представленных данных видно, что статистически значимое улучшение речевой разборчивости отмечено при «нулевых» мутациях GSTT-1, GSTM-1, гомозиготном носительстве полиморфизма Val9Ala в гене SOD-2. У пациентов с «диким» вариантом генотипа MTHFR, ММР-9 было выявлено улучшение показателей разборчивости речи только при «женском многоголосии».