Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Основная часть
2.1. Обзор литературы 13
2.1.1. Биологически активные вещества в кормлении сельскохозяйственных животных и механизм их действия 13
2.1.1.1. Пробиотики 15
2.1.1.2. Пребиотики 24
2.1.1.3. Фитобиотики 28
2.1.1.4. Синбиотики. Комплексные кормовые добавки
2.1.2. Практическое использование пробиотических добавок кормового назначения в рационах молочного скота и свиней 34
2.1.3. Заключение по обзору литературы 41
2.2. Собственные исследования 44
2.2.1. Материалы и методы исследований 44
2.2.1.1. Научно-производственная база и схема исследований 44
2.2.1.2. Некоторые аспекты технологии производства 51
2.2.1.3. Характеристика изучаемых пробиотических добавок 2.2.1.3.1. «Пробиоцел» 57
2.2.1.3.2. Модификации «Пробиоцела» - «ПРО-А», «ПРО-Н» 60
2.2.1.3.3. «Шрот облепиховый активированный» 64
2.2.1.3.4. Биологически активная кормовая добавка «Ферм-КМ» и ее модификации - синбиотики «ПроСтор-М» и «ПроСтор» 67
2.2.1.3.5. Новые комплексные пробиотические добавки, содержащие ассоциацию бактерий, в том числе, продуцент лизина, а также пребиотики и фитобиотики 70
2.2.1.3.6. Пробиотический комплекс нового поколения «А2» 71
2.2.1.4. Заключение по разделу 72
2.2.2. Результаты собственных исследований 74
2.2.2.1. Использование пробиотических комплексов в комбикормах для крупного рогатого скота 74
2.2.2.1.1. Эффективность использования в комбикормах для лактирующих высокопродуктивных коров пробиотика «ПРО-А» 74
2.2.2.1.2. Эффективность использования в комбикормах для лактирующих высокопродуктивных коров комплексного растительного концентрата с пробиотиком на основе Bacillus subtilis 85
2.2.2.1.3. Использование пробиотической кормовой добавки «А2» в кормлении высокопродуктивных молочных коров з
2.2.2.1.4. Использование пробиотической кормовой добавки «А2» в кормлении телят 129
2.2.2.1.5. Использование пробиотика на основе бактерий Bacillus subtilis В-8130 в кормлении телят 155
2.2.2.1.6. Эффективность использования ДБА «ПроСтор» при выращивании и откорме бычков черно-пестрой породы 192
2.2.2.2. Эффективность использования пробиоти ческих комплексов в комбикормах для растущего молодняка свиней. 209
2.2.2.2.1. Эффективность пробиотика «ПРО-А» в кормлении доращиваемых и откармливаемых свиней 209
2.2.2.2.2. Эффективность различных модификаций пробиотика «ПРО-А» в кормлении растущего молодняка свиней 230
2.2.2.2.3. «Шрот облепиховый активированный» в кормлении молодняка свиней 248
2.2.2.2.4. Использование ферментно-пробиотических и синбиотических добавок «Ферм-КМ», «ПроСтор-М», «ПроСтор» в кормлении растущего молодняка свиней 263
2.2.2.2.5. Эффективность использования в кормлении свиней комплексного пробиотического препарата, содержащего ассоциацию бактерий, в том числе, продуцент лизина, а также пребиотики и фитобиотики 299
3. Заключение 310
3.1. Обсуждение результатов исследований 310
3.2. Выводы 320
3.3. Предложения производству 322
3.4. Перспективы дальнейшей разработки темы. 323
Список использованной литературы
- Биологически активные вещества в кормлении сельскохозяйственных животных и механизм их действия
- Результаты собственных исследований
- Использование пробиотика на основе бактерий Bacillus subtilis В-8130 в кормлении телят
- Эффективность использования в кормлении свиней комплексного пробиотического препарата, содержащего ассоциацию бактерий, в том числе, продуцент лизина, а также пребиотики и фитобиотики
Введение к работе
Актуальность темы. Современная система полноценного питания сельскохозяйственных
животных подразумевает научно-обоснованное балансирование рационов кормления по
питательным веществам, энергии, макро-, микроэлементам и витаминам. С целью дальнейшего
роста продуктивности животных при сохранении их здоровья активно внедряются в практику
кормления различные биологически активные вещества, в том числе, препараты про- и
пребиотического действия (Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева, 2008; Л.В. Топорова и др., 2008; Н.А.
Ушакова и др., 2009; Л.Н. Гамко и др., 2010; Н.П. Буряков и др., 2013; Р.А. Кривошеев, Н.С.-А.
Ниязов, 2015; R. Fuller, 1989; G.W. Tannock, 1995). Многочисленными исследованиями
установлено, что использование в рационах пробиотиков кормового назначения может
оказывать иммуномодуляторное, противоинфекционное воздействие на животных (Н.А.
Ушакова и др., 2012), повышать защитные функции организма против патогенных бактерий,
вирусов, регулировать состояние кишечного микробиоценоза, оптимизировать процесс
пищеварения и функции кишечника (Б.В. Тараканов, 2003; M.B. Roberfroid, 1998; M. Vrese et
al., 2007; G.M. Chu et al., 2011; C.L. Ferreira et al., 2011). Большое внимание уделяется
разработке кормовых пробиотических добавок на основе непатогенных штаммов Bacillus
subtilis и их широкая производственная апробация в кормлении сельскохозяйственных
животных. В отличие от других представителей экзогенной микрофлоры они отличаются
высокой жизнеспособностью, являются продуцентами протеолитических, амилолитических
ферментов, могут принимать участие в начальных этапах расщепления клетчатки, безвредны,
технологичны в производстве, стабильны при хранении, экологически безопасны и при этом
имеют высокую антагонистическую активность к широкому спектру патогенных и условно-
патогенных микроорганизмов, устойчивы к литическим ферментам, повышают
неспецифическую резистентность организма хозяина, обеспечивают высокую ферментативную
активность пищеварительной системы (Р.М. Попов, 2009; Н.А. Ушакова и др., 2010; О.И.
Бобровская, 2012). Исходя из вышеизложенного, актуальной задачей является разработка и
изучение эффективности новых пробиотических комплексов в кормлении
сельскохозяйственных животных.
Степень разработанности темы исследований. В настоящее время накоплен обширный научный и практический материал по изучению эффективности пробиотических кормовых добавок в кормлении сельскохозяйственных животных, изучены некоторые механизмы их действия на организм животного, установлены положительные эффекты, выражающиеся в улучшении микробного баланса кишечника, повышении защитных свойств, реализации продуктивных качеств животных. Тем не менее актуальным является дальнейшее изучение и накопление научных и практических материалов по изучению эффективности новых штаммов полезных микроорганизмов, их комбинации, в том числе с пребиотиками, фитобиотиками, другими биологически активными компонентами, установление новых способов их скармливания животным, определение полученных эффектов от скармливания, в том числе экономического характера. В связи с недостаточностью данных в вопросе изучения эффективности использования пробиотических комплексов нового поколения в кормлении крупного рогатого скота и свиней необходимы дополнительные исследования для повышения уровня проникновения сельскохозяйственной биотехнологии в сельскохозяйственное производство.
Цель работы заключается в разработке способов повышения эффективности использования рецептов комбикормов с включением новых кормовых добавок комплексного действия в рационах крупного рогатого скота и свиней. Для достижения этой цели нами решались следующие задачи:
- разработать рецепты комбикормов с включением в их состав изучаемых пробиотических
комплексов на основе Bacillus subtilis;
- установить эффективность влияния пробиотических добавок и добавок комплексного
действия в рационах лактирующих коров, молодняка крупного рогатого скота и свиней на их
продуктивность, затраты кормов на единицу продукции и ее качество;
провести физиологические исследования по изучению переваримости питательных веществ кормов, баланса и использования азота, кальция, фосфора при скармливании животным добавок комплексного действия;
изучить гематологические и другие показатели крови животных, характеризующие интенсивность обменных процессов в организме животных, неспецифическую резистентность организма, состояние здоровья животных;
- установить влияние скармливания пробиотических комплексов на содержание
микроорганизмов в рубцовом содержимом телят и коров, слепой кишке и кале свиней;
определить микробиологический профиль рубцового содержимого телят методом T-RFLP-
анализа;
- провести гистологические исследования некоторых отделов желудочно-кишечного
тракта животных и электронную микроскопию полученных пробиотических добавок;
- проанализировать влияние скармливания изучаемых добавок на качество туш
откармливаемых свиней и молодняка крупного рогатого скота;
- рассчитать экономическую эффективность применения кормовых пробиотических
комплексов в кормлении крупного рогатого скота и свиней;
- дать практические предложения производству по применению пробиотических добавок
на основе Bacillus subtilis в кормлении сельскохозяйственных животных.
Научные исследования выполнены в рамках тематического плана научно-
исследовательских работ отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К. Эрнста» в 2003-2016 гг., тема 18. № 0600-2014-0017.16. РК 01201455116.
Научная новизна. Впервые на лактирующих коровах и молодняке крупного рогатого скота, растущих и откармливаемых свиньях изучено:
- действие комплексных кормовых добавок пробиотического и пребиотического действия
нового поколения, синбиотиков отечественного производства на переваримость и
использование питательных веществ кормов рациона, продуктивность и интенсивность
обменных процессов в организме высокопродуктивных молочных коров, молодняка крупного
рогатого скота и свиней. Установлено положительное влияние изучаемых добавок на мясные
качества откармливаемого молодняка крупного рогатого скота и свиней;
изучена физиологическая и экономическая эффективность скармливания кормовых добавок нового поколения крупному рогатому скоту и свиньям, установлены оптимальные дозы их использования;
разработаны рецепты комбикормов для свиней с введением сухой пивной дробины, обогащенной пробиотиком «Пробиоцел» на основе штамма Bacillus subtilis В-8130;
- впервые изучена эффективность различных модификаций пробиотика на основе штамма
Bacillus subtilis В-8130, в том числе с живыми и инактивированными клетками на молочную
продуктивность и воспроизводительные качества высокопродуктивных коров.
Научная новизна выполненной работы подтверждается наличием 2-х патентов РФ на изобретение: №2284703, приоритет от 10.10.2006 г.; № 2569628, приоритет от 28.08.2015 г.
Теоретическая и практическая ценность. Теоретически обосновано и
экспериментально подтверждено, что обогащение рационов крупного рогатого скота и свиней новыми пробиотическими добавками комплексного действия, способствует нормализации обменных процессов в организме животных, что приводит к повышению продуктивности животных, снижению затрат кормов, себестоимости производства единицы продукции.
Методология и методы исследования. Методологической основой исследований послужил анализ методов, используемых отечественными и зарубежными учеными в области изучения эффективности скармливания препаратов биологически активных веществ широкого спектра действия в составе комбикормов для крупного рогатого скота и свиней. На основе оценки передовых достижений науки и практики в области применения пробиотических комплексов в кормлении сельскохозяйственных животных была сформулирована цель и задачи исследований, разработаны схемы опытов. При постановке и проведении опытов были
использованы зоотехнические, физиологические, биохимические, микробиологические,
гистологические, экономические методы. Объектом исследований служили
высокопродуктивные дойные коровы, молодняк крупного рогатого скота, растущий и откармливаемый молодняк свиней. Полученные результаты исследований были статистически обработаны и проанализированы.
Реализация результатов исследований. Научные разработки внедрены в деятельность
следующих хозяйств: ФГУП «Кленово-Чегодаево» Подольского района Московской области,
ЗАО «Агрофирма «Красная Заря» Ступинского района Московской области, ОАО
«Румянцевское» Д-Константиновского района Нижегородской области, ООО «Спасское»
Новомосковского района Тульской области; в свиноводческих предприятиях: ООО
«Вердазернопродукт» Рязанской области, «Алексеевский» Самарской области, на
свиноводческом комплексе подсобного хозяйства ГНП РКЦ «ЦСКБ-Прогресс» и во многих других хозяйствах РФ.
Публикация результатов исследований. Основное содержание диссертации
опубликовано в 67 научных работах, в том числе 21 - в рецензируемых периодических научных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, Патентов РФ на изобретение – 2.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
результаты скармливания изучаемых кормовых комплексов на основе Bacillus subtilis пробиотического, ферментно-пробиотического и синбиотического действия, способствующие повышению продуктивности крупного рогатого скота и свиней на фоне снижения затрат кормов на единицу продукции;
введение в рацион изучаемых пробиотических добавок кормового назначения приводит к повышению переваримости питательных веществ рационов, улучшению их использования;
пробиотические добавки комплексного действия оказывают положительное влияние на показатели здоровья животных, их иммунитет, гематологические показатели крови;
- изучаемые биологически активные добавки ведут к направленным изменениям
микробиологического пейзажа желудочно-кишечного тракта: стимулируют развитие тех видов
микрофлоры в организме хозяина, которые имеют положительное влияние на процессы
пищеварения;
- использование добавок комплексного действия на основе Bacillus subtilis экономически
целесообразно.
Степень достоверности и апробация результатов работы. Исследования проведены на базе ряда животноводческих и свиноводческих хозяйств РФ, а также в лабораториях ВИЖ им. Л.К. Эрнста на откалиброванном, сертифицированном оборудовании с использованием стандартизированных реактивов и общепринятых методик. Степень достоверности проведенных работ подтверждается правильным подбором методик, биометрической обработкой полученного первичного материала исследований. В каждом научно-хозяйственном опыте рассчитывалась эффективность и была дана экономическая оценка использованию в кормлении крупного рогатого скота и свиней новых кормовых комплексов пробиотического действия. Полученные в испытаниях первичные материалы были биометрически обработаны с использованием t-критерия Стьюдента. Данные считали достоверными при уровне статистической значимости Р < 0,05.
Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на научных конференциях отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов и Ученом совете ВИЖ им. Л.К. Эрнста (Дубровицы, 2004-2016 гг.), III, VIII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2015), V Международном ветеринарном конгрессе (IVC) (Москва, 2015 г.), на научно-практических конференциях (Дубровицы, 2005, 2006; Ярославль, 2009; Курск, 2010; Владикавказ, 2011; Мичуринск, 2013), на международных научно-практических конференциях (Боровск, 2006, 2010; Дубровицы, 2007, 2008; 2015, 2016, Москва, МПА, 2012, пос. Быково, 2014, Самара, 2014, Copenhagen, Denmark, EAAP, 2014, Cairns, Australia, 2014, Ульяновск, 2015,
Гродно, Беларусь, 2015, 2016, Брянск, 2016, Москва, ВДНХ, 2016, Вологда, 2016, Горки, Беларусь, 2016, Барнаул, 2016, Belfast, UK, EAAP, 2016), на выставках («Золотая осень», 2012, 2013 гг., 11-я международная выставка «Молочная и мясная индустрия – 2014») на совещаниях специалистов ФГУП «Кленово-Чегодаево» Московской области, ОАО «Румянцевское» Нижегородской области, ООО «Вердазернопродукт» Рязанской области и других хозяйствах страны (2006-2016 гг.). Научная работа «Инновационная биотехнология повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, птицы, рыб за счет кормового биостимулятора «ПроСтор» отмечена дипломом и серебряной медалью на 14-й Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» (2012 г.). Научная работа «Новые способы оптимизации системы кормления сельскохозяйственных животных и птицы с применением инновационного пробиотического препарата А2» отмечена дипломом и серебряной медалью на 15-й Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» (2013 г.).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 360 страницах компьютерного текста, содержит 173 таблицы, 23 рисунка; структурно включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, выводы, предложения производству, перспективы дальнейшей разработки темы, список литературы, включающий 361 источник, из них 150 на иностранном языке.
Биологически активные вещества в кормлении сельскохозяйственных животных и механизм их действия
Пробиотики – это конечно не лекарство, но свое положительное воздействие на организм они оказывают через различные медиаторы. Это могут быть компоненты клетки микроорганизма или продукты их метаболической активности.
В первую очередь, механизм действия пробиотических препаратов заключается в их конкуренции с патогенными микроорганизмами за местообитание в эпителии пищеварительного тракта, за имеющиеся питательные субстраты. Эпителий кишечника покрыт слоем полезных бактерий, которые создают антагонистический барьер колонизационной резистентности кишечника. Полезные микроорганизмы быстро размножаются, в процессе их жизнедеятельности образуются низкомолекулярные жирные кислоты, стабилизируется рН. В следствие этого угнетается рост и развитие патогенов, оптимизируется микробиальный профиль кишечника. В свою очередь образующиеся органические кислоты усиливают перистальтику и секрецию кишечника, чем способствует перевариванию пищи, повышается резорбция макро-и микроэлементов [5]. Также пробиотические микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности могут повышать проницаемость стенки кишечника, что прямым образом влияет на улучшение всасывания питательных веществ кормов [276; 296].
Постоянное присутствие в кишечнике адгезированных на его стенке резидентных микроорганизмов предотвращает размножение патогенов, их внедрение в энтероциты и прохождение через кишечную стенку. Кишечные бактерии защищают хозяина от патогенов, а также формируют переднюю линию слизистой защиты. Благодаря успешной конкуренции за необходимые питательные вещества или за эпителиальные сайты прикрепления, бактерии кишечника предотвращают кишечную колонизацию патогенными микроорганизмами. Образуя антимикробные соединения, энергозависимые жирные и химически модифицированные желчные кислоты, бактерии кишечника создают локальную окружающую среду, неблагоприятную для развития патогенных микроорганизмов. Резидентная кишечная микрофлора стимулирует восстановление иммунных клеток подслизистого слоя, который образует второй слой защиты. Наиболее важные аспекты взаимодействия пробиотических организмов с микрофлорой кишечника и в целом с организмом - образование антибактериальных веществ, изменение микробного метаболизма (ферментативная активность, ее увеличение или снижение), обеспечение конкуренции за место прикрепления в кишечнике и за питательный субстрат, стимулирование иммунитета. Нормальная деятельность многих систем и органов в значительной степени зависит от видового состава и межвидового соотношения микроорганизмов, заселяющих их с момента рождения По данным ряда исследователей, симбионтная флора благодаря различным ферментационным активностям способна синтезировать целый ряд биологически активных веществ (аминокислоты, органические кислоты, витамины, и другие). Важную функцию симбионтные микроорганизмы играют в белковом питании. Усваивая различные субстраты, они быстро растут, а отмирая, перевариваются организмом хозяина, являясь источником белка [21; 166; 234; R. Walker, M. Buckley, 2006].
Таким образом, можно выделить следующие эффекты воздействия пробиотиков на организм: - синтез питательных веществ и антиоксидантов; - модуляция кишечной иммунной функции, - способствуют развитию полезной кишечной микрофлоры; - улучшают барьерную функцию кишечника; - нейромодуляторные эффекты; - блокирование эффектов патогенных бактерий; - улучшение пищеварения.
Все эти положительные эффекты смогут проявиться только в случае, если микроорганизмы, используемые в качестве основы пробиотиков, будут соответствовать определенным требованиям. Так, необходимо, чтобы они обладали полезным воздействием на макроорганизм, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями; иметь четкую физиолого-биохимическую и генетическую маркировку как для исключения фальсификации, так и для периодического контроля идентичности исходных пробиотических штаммов и производственных культур в процессе их эксплуатации [105; 201].
Выделяют несколько поколений пробиотиков [211]: I поколение - монокомпонентные препараты, содержащие один штамм бактерий; II поколение - самоэлиминирующиеся антагонисты, к которым относятся представители рода Bacillus, главным образом, В. subtilis, B. licheniformis; III поколение - комбинированные препараты, состоящие из нескольких штаммов бактерий (поликомпонентные или симбиотики) или включающие добавки, усиливающие их действие; IV поколение - иммобилизованные на сорбенте (сорбированные) живые бактерии [183]. К прогрессивным формам препаратов нового поколения относятся сорбированные формы пробиотиков, которые содержат бактерии, иммобилизованные на частицах твердого сорбента [183]. Включение сорбента в комлексную добавку может ускорять дезинтоксикацию и восстановление организма. Часто, в качестве сорбентов используют природные источники – уголь, цеолит кремнезем и другие. Они имеют поры различной размерности, сорбционную и ионообменную способность, способность взаимодействовать с различными биологически активными веществами и клетками пробиотика. Повышенная биологическая активность таких комплексных препаратов может быть связана с иммобилизацией полезных микроорганизмов на сорбенте, где они лучше выживают, проходя желудочно-кишечный тракт животного [59; 76; 183; 202].
Повышенная биологическая эффективность сорбированных пробиотиков позволяет использовать меньшие концентрации бактерий. Например, одна доза Бифидумбактерин форте (пробиотик, сорбированный на косточковом активированном угле) содержит не менее 107 КОЕ/г, что сравнимо с содержанием бактерий в кисломолочных продуктах, и на два порядка меньше дозы, рекомендованной для обычных пробиотиков [183]. Так, в пробиотических добавках кормового назначения Целлобактерин и Целлобактерин-Т микроорганизмы адсорбированы на нейтральном фитоноситель. При этом доза добавок составляет всего 1 кг на тонну комбикорма (104 КОЕ пробиотика на 1 т комбикорма или 107 КОЕ в 1 кг добавки [66; 67; 68; 69;131; 141; 170].
Представляет большой интерес исследования по разработке биопрепаратов (пробиотиков), содержащих продуцент лизина. Это позволит синтезировать лизин непосредственно в желудочно-кишечном тракте животного введенным пробиотиком [208].
Очень перспективно применение пробиотиков, изготовленных на основе различных штаммов Bacillus subtilis, содержащих вегетативные клетки и споры этих бактерий: споробактерин, биоспорин, ветом 3, ветоцил, биосептин, ветомгин и их рекомбинантные вариации – ветом 1.1, ноздрин и субалин. Эти препараты подавляют рост и размножение сальмонелл, шигелл, микробов рода протея, стафилококков, грибов рода кандида, кампилобактера и энтеропатогенных кишечных палочек. Сходным действием обладает энтерол (лечебные дрожжи), обладающий антагонистическим действием к клостридиям, некоторым грибам, шигеллам, эширихиям, псевдомонадам. Параллельно проводится коррекция моторной функции кишечника, противовоспалительная терапия, стимулирование реактивности организма [154; 155; 158; 179; 181; 185; 203].
Результаты собственных исследований
Микроорганизмы вида Bacillus subtilis могут вырабатывать антибиотики белковой природы с выраженными противовоспалительными свойствами, являются антагонистами патогенных и условно-патогенных бактерий (стафилококков, стрептококков, сальмонелл), способствуют восстановлению нормофлоры кишечника. Животные и населяющие их микробные сообщества представляют собой сложно организованную систему, в которой симбиотические связи направлены на поддержание целостности всего организма, обеспечение его нормального физиологического состояния и воспроизводства [334]. Несмотря на большой интерес исследователей к роли симбионтов, и изученность данного вопроса, ряд принципиальных моментов остается неясным, в частности, о регулировании межпопуляционного взаимодействия и влияния на функционирование органов и тканей хозяина [19].
В исследованиях нами был использован штамм Bacillus subtilis B-8130, который выделен из кишечника глухаря в зимний период. Пробиотик получали в виде биопленки на фитоносителе при применении твердофазного культивирования штамма на фитосубстрате с получением пробиотика.
Шамм Bacillus subtilis B-8130 обладает следующими характеристиками: это факультативно-анаэробные грамположительные и каталазоположительные палочки, прямые или слегка изогнутые, 0,3-0,5 х 3,0-7,0 мкм, иногда могут образовывать нити и цепочки. Растет в анаэробном агаре, при 7% поваренной соли, в интервале рН 3-9. Спора овальная, субтерминальная. Гидролизуют манниты, арабинозы, ксилозы, крахмал, казеин. Принимают участие в начальных стадиях расщепления различных растительных материалов. Разрушают пектин и другие структурные полисахариды [137; 157]. Продукт расщепления глюкозы – органические кислоты, ацетон, без газа. Рекомендуемая среда для поддержания штамма и получения биомассы – глюкозо-пептонная среда с дрожжевым экстрактом, культивируется 1-2 суток при t=45С. Целлюлазная активность в жидкой среде Ричи – не менее 35 ед./мл [157].
При выяснении механизма биологической активности Bacillus subtilis В-8130 как пробиотика в специальном исследовании была обнаружена его способность выделять иммуноактивные протеины и биологически активные пептиды, в число которых входят не только пептидные антибиотики, но и гормоноподобные вещества. Обнаружено, что некоторые синтетические аналоги гормона соматостатина выступают опосредованными антагонистами по отношению к этому гормону, поскольку вызывают аутоиммунную нейтрализацию эндогенного соматостатина, что снижает его ингибирующее действие на гормон роста, инсулин и гастрин [183], и ведет к ростостимулирующему действию на организм [271; 326].
В ходе работ было показано, что в экстракте дезинтегрированных клеток Bacillus subtilis В-8130 присутствует соматостатин-подобный пептид в количестве 0,060 нг/г сырой биомассы, и в количестве 0,032 нг/г - в лиофильно высушенных неразрушенных клетках бациллы, по-видимому, за счет адсорбции пептида на поверхности клеток при центрифугировании. Также в исследованиях культуральной жидкости Bacillus subtilis были выделены соматостатин-подобные пептиды [241]. Пептид обнаружен и в продукте сбраживания свекловичного жома – 0,185 нг/г.
Полученные результаты свидетельствуют, что штамм Bacillus subtilis В-8130 способен внутриклеточно синтезировать иммуноактивный пептид и выделять его в окружающую среду при ферментации не только свекловичного жома, но и других фитосубстратов: листьев облепихи, семян льна.
Согласно симбиогенетической теории происхождения эвкариот многие сигнальные молекулы, общие для бактерий и эукариот, у первых выполняли синэкологические функции (обеспечение взаимодействия клетки с другими членами прокариотного сообщества), а у вторых стали обеспечивать согласованную работу клеток многоклеточного организма [288]. По-видимому, способность отдельных штаммов Bacillus subtilis к выделению соматостатин-подобного пептида может указывать на тесную эволюционную связь этих штаммов с животными, что может объяснять пробиотические свойства этих бактерий.
Важными обнаруженными компонентами биотрансформированного свекловичного жома являются терпеноиды, которые составили более 30% от всех идентифицированных веществ. Терпеноиды в последнее время привлекают большое внимание как природные заменители антибиотиков, поскольку этим веществам приписывают бактерицидную активность фитонцидов. Терпеноиды широко распространены в природе, главным образом, в растительных, реже – в животных организмах. Они обладают противовоспалительной, антимикробной и антивирусной активностью.
Эти соединения проявляют высокую антиоксидантную активность, влияют на активность ферментов дыхательной цепи и процесс изменения проницаемости внутренней мембраны митохондрий, взаимодействуют с важными ферментами метаболизма, регулируют кальциевый гомеостаз в клетках, имеют выраженное нейропротекторное действие [96; 123]. Наличие этих веществ в комплексном пробиотическом препарате, несомненно, влияет на его биологическую активность и представляет большую ценность.
Таким образом, присутствие в биотрансформированном свекловичном жоме бактерицидных веществ и иммуноактивного соматостатин-подобного пептида в сочетании с биопленкой клеток пробиотика указывает на потенциальное высокоэффективное воздействие полученного комплексного пробиотического продукта в качестве кормовой добавки, что подтвердили опыты на дойных коровах, телятах и поросятах.
Использование пробиотика на основе бактерий Bacillus subtilis В-8130 в кормлении телят
Как ранее было отмечено, кормовая добавка «А2» – это кормовой пробиотик, созданный на основе новых штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, обладающих антагонистической активностью к патогенам, резистентностью к некоторым антибиотикам и сопутствующей ферментативной активностью. Пробиотик «А2» содержит лиофильно высушенную биомассу живых спорообразующих бактерии Bacillus subtilis ВКМ В-2711D – не менее 2х109 КОЕ/грамм и Bacillus lichenifirmis ВКМ-2713D – не менее 2х109 КОЕ/грамм, а также наполнитель – лактозу или сухую молочную сыворотку.
Для изучения зоотехнической и экономической эффективности использования пробиотической кормовой добавки «А2» в рационах молочных коров в экспериментальном хозяйстве ВИЖа «Кленово-Чегодаево» Московской области, ОАО «Румянцевское» Нижегородской области и ООО «Кубанский бекон» Краснодарского края, а также в лабораториях ВИЖа проведены исследования, в задачу которых входило изучить влияние добавки на поедаемость кормов животными, влияние на молочную продуктивность коров и качественные показатели молока в начале лактации, на рубцовое пищеварение коров, микробиологические показатели кала, биохимические показатели крови животных, неспецифическую резистентность организма; определить экономическую эффективность и целесообразность использования в кормлении высокопродуктивных коров изучаемого препарата. Для решения поставленных задач были проведены научно-хозяйственные опыты по схеме, представленной в таблице 26.
В опыте, проводимом в Э/Х «Кленово-Чегодаево», животные контрольной группы получали комбикорм-концентрат (табл. 27). С комбикормом коровы 2-й и 3-й опытных групп получали пробиотик «А2». Коровы 2-й опытной группы за 21 день и 21 день после отела и до 100-го дня лактации получали 0,250 г/кг комбикорма пробиотика «А2», животные 3-й опытной группы за 21 день и 21день после отела до 100-го дня лактации получали 0,375 г/кг комбикорма пробиотика «А2».
В ОАО «Румянцевское» Нижегородской области проведены исследования на молочных коровах. Было сформировано три группы лактирующих коров-аналогов по 6 голов в каждой. Содержание коров привязное. Препарат задавался животным опытных групп в смеси с комбикормом, индивидуально, 1 раз в день (утром), согласно схеме эксперимента. Основной рацион для всех подопытных животных был одинаковым и состоял из сена, сенажа, силоса кукурузного, жома свекловичного, патоки, комбикорма.
Животные 1-й контрольной группы на фоне основного рациона получали комбикорм без пробиотика на протяжении всего опыта. Коровам 2-й опытной группы задавался пробиотический комплекс нового поколения «А2» из расчета 0,250 кг/т комбикорма за 21день до отела и на протяжении раздоя – 60 дней в той же дозировке. Коровам 3-й опытной группы задавался пробиотический комплекс нового поколения «А2» из расчета 0,375 кг/т комбикорма за 21день до отела и далее на протяжении раздоя. Продуктивность подопытных животных отслеживали по результатам контрольных доек, проводимых ежедекадно.
Рацион кормления коров, сбалансированный на продуктивность 26 кг молока в сутки, состоял из комбикорма, сена злаково-бобового, силоса кукурузного, сенажа бобово-злаковых трав, сенажа многолетних трав, свекловичной патоки (табл. 28).
Также в ООО «Кубанский бекон» Краснодарского края проведено производственное испытание пробиотика нового поколения «А2». Было сформировано две группы лактирующих коров симментальской породы 1-й и 2-й лактации методом групп-аналогов 34 головы в контрольной и 33 в опытной группе. Содержание коров беспривязное. Препарат задавали животным опытной группы в смеси с кормосмесью, групповым способом, 1 раз в день (утреннее кормление), согласно схеме эксперимента. Основной рацион для всех подопытных животных был одинаковым и состоял из сена люцернового, соломы ячменной, сенажа люцернового, силоса кукурузного, соломы, патоки, концентратов, микро- и макродобавок. Животные 1-й контрольной группы на фоне основного рациона получали комбикорм без пробиотика на протяжении всего опыта. Коровам 2-й опытной группы скармливался пробиотический комплекс нового поколения «А2» из расчета 2,5 г на голову в сутки (0,250 г/кг концентратов, 1х1010КОЕ). Предварительно препарат смешивался с зерновой частью для равномерного распределения по кормосмеси. Продуктивность подопытных животных отслеживали контрольными измерениями по программе «Аль Про».
С целью выявления влияния изучаемого пробиотика на поедаемость кормов и их затрат на продукции в ходе эксперимента, проводимого в Э/Х «Кленово-Чегодаево» проводился регулярный учет скармливаемых кормов и их остатков. Результаты контрольных кормлений коров, химический состав кормов позволили рассчитать состав и питательность рационов (табл. 29). Установлено, что существенных различий в суточном потреблении кормов коровами подопытных групп не было. Незначительные различия в количестве потребленных кормов отразились аналогичным образом и на содержании в рационах энергии, питательных и минеральных веществ.
Известно, чем выше удои коров, тем больше энергии должно быть в сухом веществе рациона. У коров с удоями выше 20 кг в сутки в 1 кг сухого вещества рациона должно быть 1,0-1,12 ЭКЕ, 100-105 г/ЭКЕ СП. В наших исследованиях эти показатели составили 1,05 ЭКЕ и 105 г/ЭКЕ СП. Подопытные коровы (живая масса коров в среднем 600 кг) потребляли 3,37-3,41 кг сухого вещества на 100 кг живой массы. Оптимальное количество сырой клетчатки в рационах лактирующих коров при удоях от 21 до 30 кг должно составлять 23-19% от сухого вещества. В проведенном нами эксперименте этот показатель колеблется в пределах 19,31-19,41%, то есть был в норме. Значение сахаров в кормлении дойных коров весьма значительно, так как они нормализуют углеводно-жировой обмен. Количество их
103 обычно регулируют сахаро-протеиновым отношением. Это отношение составило 0,83, при том, что в рационах лактирующих коров следует поддерживать сахаро-протеиновое отношение в пределах 0,8-1,2, а отношение крахмала и сахаров – в среднем 1,5, в наших исследованиях – 1,44.
Эффективность использования в кормлении свиней комплексного пробиотического препарата, содержащего ассоциацию бактерий, в том числе, продуцент лизина, а также пребиотики и фитобиотики
Одним из факторов, определяющих рост и развитие организма является состояние микробиоценоза кишечника. Роль нормальной микрофлоры кишечника заключается в поддержании механизмов естественной резистентности за счет конкуренции с патогенами за рецепторы слизистой оболочки кишечника на стадии их первичной адгезии и колонизации. Под влиянием эуфлоры происходит активация системы комплемента и фагоцитоза, усиление выработки IgM и секреторного IgА, что играет важную роль в санации организма от возбудителей кишечной инфекции.
В норме под действием анаэробной индигенной (сахаролитической) микрофлоры кишечника в процессе ферментации углеводов и различных нутриентов образуется целый ряд низкомолекулярных метаболитов – летучих жирных кислот (ЛЖК), выполняющих в организме ряд важных функций, включая стимуляцию жизнедеятельности нормальной микрофлоры.
Для оценки метаболической активности кишечной микрофлоры помимо абсолютных концентраций отдельных ЛЖК используется такой показатель, как их суммарная концентрация – общий уровень метаболитов (ОУМ), отображающий метаболическую активность как просветных, так и пристеночных популяций. При этом низкий общий уровень метаболитов свидетельствует о понижении метаболической активности нормальной микрофлоры, возможном снижении моторики толстой кишки, а также о дефиците пищевых субстратов. Повышение общего уровня метаболитов может отмечаться в случае гиперколонизации толстой кишки отдельными представителями анаэробной микрофлоры, усилении ее метаболической активности, при ферментативной недостаточности, нарушении всасывания.
Определение аэробного индекса позволяет судить об инфраструктуре микробиоценоза, степени анаэробиоза (отношении строгих анаэробов к аэробам и факультативно анаэробным популяциям). Его повышение свидетельствует об угнетении популяций строго анаэробной микрофлоры.
Полученные в ходе анализа данные свидетельствуют о том, что при скармливании пробиотического комплекса «А2» имеет место снижение уровня как отдельных КЖК, так и их суммарного общего уровня.
Короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК), образуемые симбиотическими бактериями нормальной микрофлоры кишечника в процессе их ферментативной активности, имеют важное значение для организма хозяина. В табл. 53, 56 представлены абсолютные концентрации отдельных КЖК в группах животных. Так, концентрации уксусной кислоты в опытных группах при вводе «А2» имеет предпосылку к снижению (недостоверно). Хотя общая доля уксусной кислоты по сравнению с другими кислотами увеличивается с 60% в контроле до 67-72,67% в опытных группах. Следует отметить, что уксусная кислота и ее производные (ацетаты) обеспечивают усиление местного иммунитета участвуют в поставке субстратов липогенеза, вместе с пропионовой и масляной кислотами регулируют моторную активность кишечника.
Особенно выраженные и статистически близкие к достоверным (p0,1) различия между группами получены в показателях пропионовой и масляной кислот. При этом их концентрация у телят опытных групп снижалась по сравнению с контролем, как в отдельности, так и в разрезе процента от суммарного общего уровня. Показатели концентрации пропионовой кислоты, продуцентами которой являются Veilonella, Propiono-bacterium, Bacteroides, Fusobacterium, у телят опытных групп были снижены незначительно. Пропионовая кислота и ее производные (пропинаты) осуществляют антимикробный эффект, подавление адгезии к эпителию, поставку субстратов глюкогенеза. Масляная кислота, как известно, является энергосубстратом для эпителиоцитов толстой кишки, и его показатели характеризуют состояние слизистой оболочки. Концентрация масляной кислоты в кале телят опытных групп была ниже контроля на 7,03-12,41 ммоль/г. Показатели валериановой кислоты, продуцируемой клостридиями, пептококками и пептострептококками, были у телят опытных групп в целом на уровне контроля. Концентрации изокислот: изомасляной и изовалериановой как конечных продуктов микробной ферментации достоверно не различались. Межгрупповые различия в концентрациях изокислот были статистически недостоверными (p 0,05). Капроновая и изокапроновая кислоты обнаружены в минимальном количестве.
Исходя из концентраций отдельных кислот, определялась их суммарная концентрация – общий уровень метаболитов (ОУ), который у всех телят был на уровне 90,12-133,18. И в опытных группах он был на 20,4–32,3% ниже, чем в группе контроля.
Наиболее активная жизнедеятельность бактерий всегда происходит в толстой кишке. Анаэробы здесь развиваются, осуществляя брожения, при которых образуются органические кислоты, преимущественно уксусная, пропионовая и масляная. Содержимое кишечника – благоприятная среда обитания бактерий. Однако здесь действует и ряд неблагоприятных факторов, способствующих адаптации и специализации кишечных микроорганизмов. Так, в толстом кишечнике накапливаются желчные кислоты до концентраций, уже угнетающих рост некоторых бактерий. Масляная и уксусная кислоты также обладают бактерицидными свойствами.
Общее количество микрофлоры кала у телят опытных групп увеличилось на 4,3-5,4% по сравнению с контролем. Анализ показывает, что увеличение общего уровня микрофлоры произошло в основном за счет роста бифидобактерий (рост в опытных группах на 19% выше, чем в контроле) при некотором снижении E.Coli.
В состав кишечной микрофлоры различных животных входит ряд видов бактерий, способных разрушать целлюлозу, гемицеллюлозы, пектины.. Здесь преобладают неспорообразующие анаэробы, в том числе представители рода Bifidobacterium, которым приписывают благоприятное влияние на организм хозяина благодаря образованию витаминов и антибиотиков. Для кишечной микрофлоры животных характерны стрептококки и кишечная палочка.
Бифидобактерии являются наиболее значительными представителями бактерий в организме животных. Большая часть бифидобактерии располагается в толстой кишке, являясь её основной пристеночной и полостной микрофлорой. Бифидобактерии обладают выраженным микробным антагонизмом, сдерживают рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и препятствуют проникновению их во внутреннюю среду организма. Бифидобактерии активно участвуют в пищеварении и всасывании: усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, растворяют клетчатку, стимулируют перистальтику кишечника, а также принимают участие в печеночно-кишечной циркуляции желчных кислот и холестерина.
Особенно большое значение бифидобактерии имеют для организма новорожденных животных. Они участвуют в формировании иммунного статуса. С момента рождения животных, наряду с другими представителями нормальной микрофлоры, они стимулируют лимфоидный аппарат, участвуют в создании общего пула иммуноглобулинов, формируют неспецифическую защиту и иммунорезистентность. Бифидодоминантный состав кишечной микрофлоры связан с рядом положительных эффектов, основным из которых является повышенная резистентность организма к кишечным инфекциям. С этим эффектом может быть связано несколько свойств бифидобактерий. Во-первых, бифидобактерии способны секретировать вещества, ингибирующие рост патогенных микроорганизмов. Кроме того, бифидобактерии создают кислую среду в толстом кишечнике путем продукции ацетата и молочной кислоты. Бифидобактерии выполняют также функцию модуляции механизмов иммунного ответа. Многочисленные исследования с применением пробиотиков показывают, что в результате применения препаратов с добавлением бифидобактерий повышается резистентность животных к инфекционным заболеваниям.