Введение к работе
Актуальность темы. Создание медицинских препаратов нового жоления, способішх усиливать защитные функции организма, корректировать ;таболизм и управлять длительностью клеточного цикла, является шоритетным направлением для большинства современных наук и, в частности, ший высокомолекулярных соединений. В настоящее время в качестве таких >епаратов, влияющих на клеточный цикл, используют различного рода стракты из тканей животных, содержащие биорегуляторы белковой природы: :йропептиды, факторы роста, иммуностимуляторы. Использование таких ществ в виде высокоочищенных препаратов при решении медицинских и ронтологических задач не всегда является успешным из-за короткого времени из ни этих белков в плазме крови и цитоплазме.
Как известно, один из способов пролонгирования действия гормона или :гуляторного вещества и его целенаправленного транспорта в организме рстоит в том, что его включают в интерполимерный комплекс (ИПК), при этом іиболее надежными носителями являются линейные полиэлектролиты. С одной ороны, нуклеиновые кислоты (НК) - ДНК и РНК - относятся к группе сильных шейных полиэлектролитов, которые несут постоянный избыточный заряд на эсфатных группах и могут быть использованы в качестве полимера-носителя. С >угой стороны, участие ДНК в ИПК стабилизирует ее структуру, защищает от ісщепления клеточными нуклеазами и обеспечивает транспорт такого >мплекса в цитоплазму и в ядро клетки. Поэтому исследование особенностей (млексообразования ДНК и белков представляет большой теоретический и )актический интерес.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в получении и (учении комплексов ДНК с глобулярными неядерными белками для абилизации макромолекулы ДНК, а также выделения и изучения природных :анеспецифических препаратов, перспективных для перорального применения.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие дачи:
-
Оценить обратимость комплексообразования нативной ДНК с глобулярными белками, отличающимися изоэлектрическими точками и количеством заряженных групп при рН 8.0±0.1 (физиологические условия) в диапазоне ионной силы - 0.1 -s-0.5 н.
-
Определить коэффициенты связывания глобулярных белков с ДНК при разных концентрациях и сравнить полученные закономерности с взаимодействием ДНК с ядерным тканеспсцифическим регулятором пептидной природы, входящим в состав хроматина.
-
Оценить изменение конформации природного полиэлектролита-носителя -ДНК при взаимодействии с белками и сравнить морфологию природных и модельных нуклеопротеиновых комплексов (НПК) с морфологией нативной ДНК.
-
Определить тканеспецифичность природных и модельных комплексов
ДНК с белками.
Научная новизна. Целенаправленные усилия современной биохимии і генетики направлены на поиск селективных центров (сайтов) взаимодействи: ДНК с регуляторними белками, входящих в состав хроматина, а также изучении конформационных изменений ДНК при таких взаимодействиях. Однако, да начала представляемой работы не проводилось физико-химически: исследований закономерностей связывания ПК с глобулярными неядерным] белками. Это и определяет научную новизну представляемой работы. В работе впервые:
-
Разработан метод фракционирования нативной ДНК микрофильтрацией н; трек-мембранных модулях.
-
Изучено связывание ДНК с неядерными глобулярными белками, которые отличаются кислотно-основными характеристиками, исследован; устойчивость полученных комплексов в интервале ионной силы 0.1+0.5 н і построены изотермы связывания ДНК с белками инсулином, цитохромом С пепсином и кортексином при ионной силе раствора 0.3 н.
-
Вискозиметрически определена характеристическая вязкость модельны: НПК при различном заполнении макромолекулы ДНК цитохромом С инсулином, пепсином и кортексином. Показано, что при образованш интерполимерных комплексов наблюдается значительная компактизаци молекулы ДНК, что подтверждено электронно-микроскопическш сравнением морфологии природной ДНК и ее комплексов с цитохромом С ] кортексином.
-
Методом аффинной хроматографии показано, что модельные и природньїі НПК полипептидов мозга обладают повышенной селективность» связывания с сорбентом, содержащим иммобилизованные мембраны клетої коры головного мозга, по
сравнению с другими исследованными белками и их комплексами. Эт« свидетельствует о тканеспецифичности НПК, которая определяется белковь» компонентом
5. Тканеспецифическое действие НПК мозга и печени подтверждено і
органотипической культуре ткани.
Практическая значимость. Значимость выполненной работь определяется тем, что закономерности нековалентного связывания белков с ДШ могут быть использованы для создания новых пролонгированных форі\ лекарственных препаратов. Результаты исследований выполненных в рамка: представляемой работы, были использованы при разработке промышленной регламента и технических условий на выделение органопрепаратов новог< поколения - цитаминов. На их основе в настоящее время выпускаются лечебно профилактические препараты (биологически активные добавки к пище).
Связь с основным планом НИР института. Работа является часть» плановыхисследований по теме X научных исследований ИВС РАН "Экохро» 95-98" - программы по созданию новых полимеров, в том числе для мембранной
їхнологии, решения экологических задач и развития новых хроматогра-ических методов а также касается разработки научных основ создания олимерных систем, обладающих биологически активным направленным гйствием для целей медицины и биолої ии.
Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на аучном семинаре Российского Химического общества им. Д.И. Менделеева по роматографии (март 1999 год), на международной конференции "Фармация в :Х1 веке: инновации и традиции" (С-Петербург, апрель 1999), на 2-й сероссийской конференции с международным участием "Актуальные роблемы экспериментальной и клинической фармакологии" (С-Петербург, юнь, 1999 год), на конкурсе молодых специалистов ИВС РАН (декабрь 1998
ад).
'о теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 научные статьи.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 124 страницах ашинописного текста, включая 31 рисунок и 7 таблиц; состоит из введения, эех глав, выводов и приложения. Библиографический указатель включает 156 сточников (7 отечественных и 78 зарубежных).