Содержание к диссертации
Введение
2 Литературный обзор 18
2.1 Методы исследования: атомно-силовая микроскопия, силовая спектроскопия и молекулярная динамика 18
2.1.1 Атомно-силовая микроскопия 18
2.1.2 Силовая спектроскопия 21
2.1.3 Молекулярная динамика 35
2.2 Объекты исследования: амилоид (3 пептид и лизоцим. Их структура, и свойства 37
2.2.1 Амилоид /3 пептид 37
2.2.2 Лизоцим 41
2.3 Влияние поверхности на конформацию молекулы. Влияние химической сорбции на конформацию молекулы 46
2.3.1 Влияние поверхности на конформацию молекул амилоид /3 пептида и их агрегацию 46
2.3.2 Влияние поверхности на конформацию молекул СМА и их агрегацию 51
2.3.3 Влияние химической сорбции на конформацию молекулы 56
2.4 Взаимодействие молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой и их агрегация 57
2.4.1 Исследование взаимодействия двух молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой 57
2.4.2 Переход молекул полимеров из нативной конформа-ции в состояние с неправильной укладкой приводит к последующей агрегации 58
2.5 Заключение 63
3 Экспериментальная часть 64
3.1 Атомно-силовая спектроскопия копформационно-зависимых внутрибелковых взаимодействий 64
3.1.1 Постановка задачи 64
3.1.2 Литературные данные 65
3.1.3 Подготовка образцов 67
3.1.4 Методика проведения экспериментов 71
3.1.5 Результаты основных экспериментов по исследованию межмолекулярного взаимодействия 75
3.1.6 Контрольные эксперименты 80
3.1.7 Эксперименты с длинным полиэтиленгликолевым линкером 81
3.1.8 Исследование адгезии 84
3.1.9 Выводы 86
3.2 Образование фибрилл в биополимерной системе на твердой подложке 87
3.2.1 Постановка задачи 87
3.2.2 Литературные данные 88
3.2.3 Подготовка образцов 91
3.2.4 Измерение поверхностного натяжения пленки лизоцима на поверхности кантилевера 94
3.2.5 Исследование агрегации лизоцима, химически сорбированного на золотую поверхность 95
3.2.6 Исследование агрегации лизоцима, химически сорбированного на поверхность слюды 98
3.2.7 Исследование агрегации лизоцима, физически сорбированного на различные поверхности при комнатной температуре 99
3.2.8 Исследование агрегации лизоцима, физически сорбированного на различные поверхности при температуре 50 С 101
3.2.9 Выводы 104
4 Полученные результаты и их обсуждение 107
Выводы 112
Список литературы 115
Приложения 127
- Влияние поверхности на конформацию молекул амилоид /3 пептида и их агрегацию
- Переход молекул полимеров из нативной конформа-ции в состояние с неправильной укладкой приводит к последующей агрегации
- Результаты основных экспериментов по исследованию межмолекулярного взаимодействия
- Исследование агрегации лизоцима, физически сорбированного на различные поверхности при температуре 50 С
Введение к работе
Цель и задачи исследования
Определить причины (изменение температуры, рН, вида поверхности и типа сорбции) и следствия (возникновение сильного межмолекулярного взаимодействия, образование фибрилл и других типов агрегатов) изменения структурных свойств амилоид (3 пептида и лизоцима: конформационного перехода молекул из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой.
Изучить конформационные переходы в биомакромолекулах с помощью атомно-силовой микроскопии и силовой спектроскопии.
На атомно-силовом микроскопе и на Атомных весах изучить межмолекулярное взаимодействие полимеров, находящихся в нативном состоянии и состоянии с неправильной укладкой на примере амилоид Р пептида и лизоцима.
Определить факторы (температуры, рН, вид поверхности и тип сорбции), которые влияют на конформацию молекул.
Изучить последствия изменения молекулами коиформации на взаимодействие молекул между собой на примере амилоид j3 пептида лизоцима.
Исследовать аргегацию молекул лизоцима на различных поверхностях (слюда, золото, графит) и при различных типах сорбции (физическая или химическая).
Исследовать вляиние вида поверхности и типа сорбции на температуру конформационного перехода в лизоциме.
Научная новизна диссертации
Методами силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии определены условия, при которых происходит переход молекул полимеров амилоид /3 пептида и лизоцима из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой.
Впервые при помощи силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии изучено межмолекулярное взаимодействие полимеров амилоид /3 пептида и лизоцима, находящихся в состоянии с неправильной укладкой.
Обнаружено влияние близости поверхности и химической прививки на конформацию молекулы.
Обнаружено, что оба эти фактора могут приводить к изменению кон-формации молекулы.
Обнаружено что молекулы полимеров, привитые к поверхности, могут агрегировать и образовывать фибриллы.
Обнаружено, что химическая прививка молекул лизоцима к поверхности золота и физическая собрция молекул лизоцима на поверхность графита приводит к понижению температуры конформационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до комнатной температуры (при рН 3 буферного раствора, в котором находится белок).
Практическая значимость работы
Одна из актуальных на сегодняшний день проблем, стоящая перед физиками, заключается в том, что неизвестен механизм взаимодействия молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой. Эту проблему нужно решать, т.к. больше половины нервных заболеваний связано с неправильным складыванием белковых молекул.
Физическая и химическая прививка молекул к поверхности является важным фактором, определяющим конформацию молекул. Поэтому важно знать, как будут меняться свойства макромолекулярного полимерного комплекса при его закреплении на поверхности. Изменение свойств полимеров при физической сорбции и ковалентной иммобилизации пока еще не достаточно изучено. Большинство процессов в организме человека происходят на различных поверхностях, например мембранах клеток, поэтому очень важно знать, как различаются свойства молекул в объеме и на поверхности.
На защиту выносятся следующие результаты и положения
Определены условия (температура, рН, вид поверхности и тип сорбции), при которых амилоид (3 пептид и лизоцим переходят из на-тивной конформации в состояние с неправильной укладкой.
Обнаружено, что амилоид /3 пептид, химически сорбированный на поверхность слюды, изменяет свою конформацию при повышении кислотности среды с рН5.б до рН3.7 при комнатной температуре.
Обнаружено, что лизоцим, физически сорбированный на графит, химически сорбированный на слюду или золото, изменяет свою конформацию при повышении кислотности среды с рН4.5 до рНЗ.О при комнатной температуре.
Обнаружено, что лизоцим, физически сорбированный на слюду и слюду, обработанную 3-аминопропилсилатраном, изменяет свою конформацию (при рНЗ.О) при повышении температуры до 50 С.
Этот конформационный переход происходит под действием различных факторов, таких как понижение рН, повышение температуры,
близость поверхности из-за физической сорбции и химической прививки.
Вследствии этого конформационного перехода происходит резкое увеличение вероятности взаимодействия двух молекул между собой по сравнению с нативной конформацией (в которой молекулы между собой почти не взаимодействуют), например, сила взаимодействия двух молекул равна F ~ 40 пН для амилоид (5 пептида и F ~ ПО пН для лизоцима.
Меж молекулярное взаимодействие молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой, приводит к агрегации амилоид/? пептида и лизоцима. При этом могут образовываться линейные фибриллы и порообразные агрегаты.
Обнаружено формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе.
Обнаружено формирование фибрилл лизоцима, химически привитого к поверхности золота и отсутствие агрегации лизоцима, физически сорбированного на поверхность золота.
Обнаружено, что химическая прививка молекул лизоцима к поверхности золота и физическая собрция молекул лизоцима на поверхность графита приводит к понижению температуры конформационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до комнатной температуры.
Обнаружено, что физическая собрция молекул лизоцима на поверхность слюды и слюды со слоем 3-аминопропилсилатрана приводит
к понижению температуры конформационного перехода из натив-ного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до 50 С.
Личный вклад автора
Все экспериментальные измерения поверхностей образцов на атомно-силовом микроскопе и сил взаимодействия методом силовой спектроскопии выполнены автором лично. Автор принимал участие в измерении сил взаимодействия на Атомных весах. Все образцы приготовлены автором (кроме некоторых этапов, таких как напыление золота и синтез веществ). Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты представлены на двух международных конференциях и российской конференции. Публикации
Е.В. Украинцев, Г.А. Киселев, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский, Формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе // Высокомолекулярные соединения, серия Б, — 2007, — том 49, — N.1, - с.125-129. Принята к печати 24.08.2006 г.
Украинцев Е.В., Киселев Г.А., Багров Д.В., Горелкин П.В., Кудринский А.А., Лисичкин Г.В., Яминский И.В, Атомные весы: новые возможности исследования взаимодействия молекул // Датчики и системы, — 2007, —N.1, — с. 18-21. Номер подписан в печать 22.10.2006 г.
3. Y.L. Lyubchenko, A. Kransnoslobodtsev, L.S. Shlyakhtenko, E. Ukraintsev, Т.О. Zaikova and J.F.W. Keana, Nanomedicine and protein misfolding diseases // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, — 2005, — v.l, — pp.300-305.
Тезисы докладов
19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (США, 2005). Conformation-dependent interprotein interaction studied by AFM force spectroscopy. E.V. Ukraintsev, Т.О. Zaikova, J.F.W. Keana and Y.L. Lyubchenko;
19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (США, 2005). Study of DNA-Sfi I complex stability using AFM force spectroscopy. A.V. Krasnoslobodtsev, L.S. Shlyakhtenko, E.V. Ukraintsev and Y.L. Lyubchenko;
International Conference on Nanoscience and Technology (Швейцария, 2006). Atomic balance observation of protein aggregation on a cantilever surface. G. Kiselev, A.Kudrinskii, E.Ukraintsev, I. Yaminsky, G.Lisichkin;
Третья Всероссийская конференция (с международным участием), Химия поверхности и нанотехнология (Россия, 2006). Изучение агрегации лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота и слюды, с помощью кантилевера для атомно-силовой микроскопии. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселев, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский.
2 Литературный обзор
Влияние поверхности на конформацию молекул амилоид /3 пептида и их агрегацию
По зависимости отклонения кантилевера от времени определяется зависимость силы взаимодействия между кантилевером и образцом от расстояния между ними. Расстояние между кантилевером и образцом может определяться или непосредственно в эксперименте, или вычисляться на основе данных об изгибе кантилевера и расстоянии между чипом и образцом. По этой зависимости определяется зависимость силы, которую потребовалось приложить к молекуле, от расстояния, па которое эта молекула была растянута [7, 8, 11, 12, 13, 14, а также сила, которую нужно приложить к каптилеверу, чтобы разорвать связь между молекулой полимера, закрепленной па острие и молекулой, закрепленной на поверхности 15j. Эта сила (и в случае растягивания одной молекулы [8], и в случае растягивания двух взаимодействующих молекул [15]) зависит от скорости отвода кантилевера от поверхности, более подробно см. стр. 26. Во многих случаях зависимость силы от расстояния (силовая кривая, force distance curve) приближается различными физическими моделями. Одна из самых употребительных — это персистентиая (червеобразная) модель (WLC, worm-like chain model [16]). Она применяется для анализа растяжения одной молекулы, которая закреплена одним концом на поверхности, другим — на острие. Из анализа таких силовых кривых определяется персистентиая длина растягиваемой молекулы (I), которая характеризует гибкость молекулы, и ее контурная длина (L), которая равна расстоянию между точками закрепления на поверхности и на острие для полностью распрямленной молекулы [16] где / — сила, кв — постоянная Больцмана, Т — температура, z - - расстояние между поверхностью и острием.
Персистентиая длина молекул ДНК, исследованных различными методами, составляет 1.5-3 им для ssDNA [17] (метод резонансного переноса энергии флуоресценции, FRET, см. рис. 4 Г [17]). При помощи магнитного пинцета (magnetic tweezers, см. рис. 4 Б [18]) обнаружено более сложное, чем персистептное поведение, у ssDNA [19]. Персистентиая длина у А-бактериофага ДНК, определенная при помощи лазерного пинцета (laser (optical) tweezers, см. рис. 4 А [18]), составляет 50-100 нм [20, 21]. Методом силовой спектроскопии (force spectroscopy, см. рис. 4 В [18]) была определена персистентиая длина dsDNA, которая составила 30-50 нм [22].
Персистентиая длина для небольших молекул часто бывает меньше 1 нм. Например, персистентиая длина молекулы титина, определенная методом силовой спектроскопии, равна 0.4 нм [23], величина сегмента Куна (которая в случае свободно-сочлененной цепи равна удвоенной величине персистентной длины) для молекулы полиэтилепгликоля равна 0.7 нм [24]. Персистентная длина имеет то же значение (0.38 нм) и для фибрилл амилоид (5 пептида [25]. Эта величина является важной характеристикой конформации молекулы: персистентная длина молекулы титина, находящейся в нативном состоянии (rigid folded, native molecule), определенная методом динамического светорассеяния, равна 15 нм [26, 27], при этом она уменьшается в 10 раз (1.6 нм, эта величина определена методом лазерного пинцета) при переходе молекулы в развернутую конформацию (flexible unfolded) [26, 28, 29].
Обычно исследуют растяжение одной молекулы, не сопровождающееся какими-либо внутренними изменениями конформации до момента полного разворачивания. Более подробно исследование растяжения одной молекулы лизоцима описано на стр. 43.
Было исследовано взаимодействие разных частей одной молекулы: комплементарных частей двухцепочечной молекулы ДНК при растяжении ее за 5 -концы, см.рис. 5 А [8]. Комплементарные одноцепочеч-ные ДНК были закреплены на силанизированных поверхностях образца и острия через 30-ти нм полиэтиленгликолевые линкеры. Эти линкеры помогают разделить адгезионное и специфическое взаимодействия, см. стр 31 и 81. При подводе острия к образцу и последующем отводе наблюдаются силовые кривые, изображенные на рис. 5 Б. Зависимость силы, при которой происходит разрыв связи между комплементарными частями двухцепочечной молекулы ДНК, от скорости отвода острия от поверхности в зависимости от длины ДНК изображена на рис. 5 В. Из анализа этих данных видно, что сила отрыва пропорциональна логарифму скорости отвода. Это можно интерпретировать как наличие одного энергетического барьера при растяжении молекулы. Логарифм скорости диссоциации (thermal dissociation rate) пропорционален числу пар оснований п двойной спирали ДНК 8.
Рис. 5. (А) Растяжение молекулы ДНК за 5 -концы комплементарных частей методом силовой спектроскопии. (Б) Типичный вид силовой кривой при разрыве связи между двумя комплементарными частями одной молекулы ДНК. (В) Зависимость силы, при которой происходит разрыв связи между комплементарными частями двухцепочсчпой молекулы ДНК, от скорости отвода острия от поверхности в зависимости от длины ДНК [8].
Но в некоторых случаях эти конформационные переходы происходят. В молекуле ДНК при ее растягивании до полного разворачивания молекулы происходит конфирмационный переход, называемый B-переходом, см. рис. 6 А [7, 11, 12]. Этот переход происходит при прикладывании силы в 70 пН к разным концам одной молекулы двухцепочечной ДНК. При этом происходит конформационный переход из нативного в растянутое состояние (overstretched conformation, S-DNA). Также наблюдается разрыв связи между отдельными парами оснований: разрыв связи между G и С основаниями происходит при приложении силы в 20± 3 иН, а разрыв связи между А и Т основаниями происходит при приложении силы в 9 ± 3 пН [7].
Переход молекул полимеров из нативной конформа-ции в состояние с неправильной укладкой приводит к последующей агрегации
Важным моментом в этих экспериментах является то, что амилоид (5 пептид находится в буферном растворе с рН 7.0-7.5 [50, 51, 52]. При этой кислотности среды в растворе за несколько дней образуются фибриллы [49]. В этих условиях методом силовой спектроскопии не удается заметить изменение конформации, т.к. время взаимодействия молекул, находящихся на разных поверхностях, очень мало. Только при дополнительном повышении кислотности до рН 5.6 и увеличении времени взаимодействия молекул до 10 секунд наблюдаются редкие моменты (3 из 1000), в которых молекулы успевают провзаимодействовать между собой. В моих экспериментах с лизоцимом [53] ситуация принципиально другая: лизоцим не агрегирует в растворе при рНЗ и комнатной температуре, но при этих же условиях этот белок агрегирует и при физической сорбции на поверхность графита, и при химической сорбции на поверхность золота.
Лизоцим — полимер с молекулярной массой 15 кДа. pi = 11. Есть несколько различных типов лизоцима: лизоцим из белка куриных яиц (hen egg white lysozyme) [54], лизоцим человека (human lysozyme) [55], T4 лизоцим [31], каждый из которых также имеет несколько производных белков, характеризующихся заменой каких-либо аминокислот и обладающих разными свойствами. Например, изменение треонина-56 на изолей-цин (Ile56Thr) или гистидина-67 (Asp67His) на аспарагиновую кислоту в лизоциме человека может приводить к амилоидозу (синдрому Остерта-га, non-neuropathic systemic amyloidosis, Ostertagype) [56]. На рис. 13 А изображены две молекулы лизоцима, различающиеся всего на одну аминокислоту [55]. Замена гистидина-67 (Asp67His) на аспарагиновую кислоту приводит к тому, что связывание /? домена и а домена, которое требуется для того, чтобы лизоцим находился в нативной конформации, не происходит. И конформация молекулы очень сильно изменяется. При этом происходит агрегация лизоцима, предполагаемый механизм которой изображен на рис. 13 Б [55].
Молекулы лизоцима, находящиеся в состоянии расплавленной глобулы, взаимодействуют между собой и организуются в протофибриллы, которые потом объединяются в фибриллы. Для того, чтобы изучить, какие именно силы вызывают организацию молекул лизоцима, были проведены исследования разворачивания молекул лизоцима, находящихся в комплексе, состоящем из нескольких молекул, при помощи силовой спектроскопии на примере лизоцима Т4 (bacteriophage Т4 lysozyme) [31].
В этих экспериментах был синтезирован полимер, состоящий из нескольких мономеров лизоцима Т4. Для этого лизоцим Т4 был получен в твердом состоянии (solid state). После этого был синтезирован другой иоли Asp67His (черный) структруры лизоцима. Явно видны большие изменения в 3 домене Asp67His лизоцима. Дисульфидные мостики изображены при помощи пунктирных линий. (Б) Предполагаемый механизм агрегации лизопима. Молекулы, находящиеся в состоянии расплавленной глобулы (partially-folded, molten globule-like form, II), отличающееся от на-тивного (native, I) и денатурированного (denatured. III) состояния, объединяются через 3 домены (IV) с образованием фибрилл. В последствии происходит дальнейшее развитие стабильной, в основном состоящей из 3 листов, структуры фибриллы (V) [55]. Мер, в котором все остатки амнокислот, которые касались друг друга в кристаллической решетке лизоцима Т4, были заменены на цистеин, а все остальные цистеины были заменены на структурно нейтральные остатки, такие как аланин. Полученная молекула называется CC-mutant, в котором изменены следующие основания: Т21С/С54Т/С97А/К124С [31].
После этого эти молекулы исследовались методом силовой спектроскопии. При отводе кантилевера от поверхности наблюдалось последовательное растягивание молекулы, сопровождающееся разрывами связи между 21 и 124 остатком каждого мономера. Каждое индивидуальное событие происходило при растяжении молекулы на 64 ± 16 пН (среднее ± дисперсия) (рис. 14 А) и приводило приводило к удлинению молекулы на 36 ± 5 нм (рис. 14 Б), что соответствует растяжению молекулы на 103 основания (32 нм). Персистентная длина растягиваемой молекулы при этом составила 0.65 ± 0.25 нм.
При возвращении острия обратно к поверхности и последующем отводе наблюдалось растяжение одной и той же молекулы в течение нескольких циклов, см. рис. 14 С, где цифрами справа указаны номера циклов при растяжении одной конкретной молекулы. Эти данные свидетельствуют о том, что процесс разрыва связи между 21 и 124 основанием обратим и между этими основаниями восстанавливается дисульфидная связь при снятии нагрузки [31].
Происходящие при последовательном растягивании одной молекулы процессы более подробно изображены на рис. 3. Первый этап — отрыв острия от поверхности, сопровождающийся разрывом адгезионного взаимодействия. Второй этап — распрямление всей молекулы без разрыва связи, связывающей ее отдельные частями.
Результаты основных экспериментов по исследованию межмолекулярного взаимодействия
В последнее время появилось много экспериментальных результатов, связанных с изучением изменения молекулами белков своих конформации и их последующей агрегации. Сейчас считается, что, возможно, свойство белков агрегировать является их внутренним свойством, связанным с общим строем основной цепи, но не связаным со специфической последовательностью остатков аминокислот [62]. Большое число работ подтверждает, что большинство белков способны агрегировать при помещении их в определенные дестабилизирующие условия. Т.о. получается, что агрегация является альтернативой правильному сворачиванию белков. В этом случае большую роль играют межмолекулярные взаимодействия по сравнению с внутримолекулярными [62].
Классической моделью агрегации белков является модель Люмри-Эйринга (Lumry-Eyring) [40]. Эта модель предполагает, что существует всего три возможных конформации (или состояния), в которых могут находиться молекулы белка: N — нативное состояние (native state), А — не нативное состояние (non-native state) и Agg — агрегаты из нескольких молекул белка. При этом непрерывно происходит два процесса: необратимая агрегация и обратимое изменение конформации из нативной в не нативную и обратно: N - А — Адд.
При этом кинетика и положение равновесия в этом процессе зависит от таких параметров, как температура, рН и ионная сила раствора, концентрация белка, а также наличие в растворе добавок.
Например, повышение температуры раствора, содержащего 100 //М амилоид j3 пептида (1-42) с 4 С до 37 С приводит к значительному увеличению скорости фибриллообразования и к изменению характера образующихся агрегатов [48], а понижение рН раствора приводит к более быстрой агрегации амилоид (3 пептида (1-40) [49] и амилоид (3 пептида (1-42) [48]. Увеличение ионной силы раствора приводит к изменению формы агрегатов амилоид J3 пептида (1-42) [48]. Увеличение концентрации амилоид (3 пептида (1-42) 25 цМ. до 100 цМ приводит к формированию фибрилл вместо протофибрилл и олигомеров [48]. Наличие в растворе амилоид (3 пептида (1-40) солей металлов, таких как АІСІз и АЦгЮз ЭНгО приводит к изменению конформации молекул и ее вторичной структуры [63] и агрегации белка [64]. Наличие в растворе гуанидинон-аминовалериановой кислоты, гуаии-динаили сложного эфира гуанидинон-аминовалериановой кислоты (ArgEE) предотвращает агрегацию лизоцима из белка куриных яиц. Скорее всего это происходит из-за связывания этилированных карбоксильных групп ArgEE и лизоцима, что приводит к эффективному предотвращению межмолекулярных взаимодействий между молекулами белка [40].
Наличие в растворе амилоид (3 пептида окислительных метаболитов, см. рис. 21 А [65] (abnormal oxidative metabolites, including cholesterol-derived aldehydes) приводит к значительному ускорению формирования сферических агрегатов [66]. Этот процесс называется metabolite-initiated protein misfolding. Он состоит из двух шагов. На первом шаге метаболиты изменяют молекулу амилоид /3 пептида (1-40), формируя шиффово основание (Schiff base formation), см.рис. 21 Б [65]. Такие молекулы формируют сферические агрегаты, причем этот процесс уже не требует стадии образования зародышей, значительно ускоряя процесс агрегации амилоид (3 пептида, см. рис. 21 В [GQ]. Второй этап, формирование фибриллярных агрегатов, также ускоряется из-за наличия холестерольных метаболитов (cholesterol metabolites). Важным эффектом добавления метаболитов является снижение критической концентрации агрегации до наномолярных концентраций. Т.о. наличие метаболитов позволяет обясиить агрегацию амилоид Р пептида при физиологических наномолярных концентрациях [бб].
Реальный процесс фибриллообразования более сложный, чем упрощенная классическая модель N - А — Адд. Более корректная схема, описывающая не только фибриллообразование, но и образование неупорядоченных агрегатов, димеров и тетрамеров, олигомеров и кристаллов [67, 68], изображена на рис. 22 [62]. Из этой схемы следует, что молекулы, находящиеся в нативном состоянии, могут объединяться в ди-меры, олигомеры или переходить в ненативное состояние (denatured or partially folded ensemble). При изменении среды, в которой находятся молекулы полимера, или модификации структуры белка, или химической модификации, уменьшающей конформационную стабильность белка могут усиливаться межбелковые взаимодействия, приводящие к увеличению количества димеров или формированию кристалла. При дестабилизации этих условий равновесие 1 может быть сдвинуто влево, т.о. может происходить увеличение количества молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой. При нормальных условиях эти молекулы или возвращаются в нативное состояние при помощи молекулярных шаперонов (molecular chaperones) или уничтожаются протеазами (ubiquitin-proteasome machinery) [62].
Если оба механизма не справляются с возрастащим количеством не нативных молекул, то происходит увеличение количества неупорядоченных агрегатов или начинается образование фибрилл. Равновесие 2 сдвигается вправо при увеличении общей гидрофобности молекулы, или увеличении предрасположенности к формированию /3 структур, или уменьшении общего заряда молекулы. При смещении равновесия 3 вправо происходит увеличение количества токсичных торообразпых агрегатов (роге), которые впоследствии огранизуются в нетоксичные фибриллы [62].
Исследование агрегации лизоцима, физически сорбированного на различные поверхности при температуре 50 С
Четвертый этап подготовки образцов состоял в химической сорбции SH групп амилоид j3 пептида к малеимидным группам MAC, см. рис. 25. Слюда и кантилевер с малеимидными группами на поверхности помещались в 1.13 цМ раствор амилоид [3 пептида (в 10 мМ HEPES, рН7.5) с активированными SH группами на 1 час. Единственная SH группа в молекуле химически взаимодействовала с малеимидпои группой на поверхности. Таким образом отдельные молекулы амилоид/? пептида химически сорбировались на поверхность слюды и острия кантилсвера. При этом достигалась определенность в положении молекулы на поверхности. После этого образцы промывались водой.
Пятый этап подготовки образцов заключался в блокировке непро-реагировавших малеимидных групп при помощи обработки образцов 10 мМ раствором /?-меркаптоэтанола в течение 10 минут. После этого образцы промывались водой. Шестой этап подготовки образцов заключался в хранении образцов в течение 15-18 часов в буферном растворе (NaaCCb-NaHCOa, рН9.8) для разрушения всех агрегатов. После этого образцы промывались водой, высушивались струей аргона и помещались в жидкостную ячейку АСМ для исследования межмолекуляриого взаимодействия методом силовой спектроскопии.
Таким образом к поверхностям слюды и Si3N4 острия за N концы химически сорбировались одиночные молекулы амилоид (5 пептида. Эксперименты по исследованию сил межмолекулярного взаимодействия были проведены на ACM Nanoscope Ilia с: контроллером Picoforce (Veeco Metrology Inc., Santa Barbara, CA) и на ACM Molecular Force Probe 3D (MFP 3D, Asylum Research Inc., Santa Barbara, CA). Контроллер Picoforce позволяет с прецензионной точностью ашицйошровать образец относительно кантилевера и проводить эксперименты по исследованию сил взаимодействия между образцом и острием ккантилевера.
После химической сорбции одиночных молекул амилоид/? пептида к образцам слюда и кантилевер помещались в жидкостную ячейку АСМ, схематически изображенную на рис. 26. После этого ячейка заполнялась буферным раствором и каптилепер приближался к поверпости на расстояние в 0.3 микрона. Лось в него с силой 50 пН и отводилось от поверхности на 0.3 микрона. Этот процесс повторялся с частотой 0.281 Гц в нескольких точках поверхности (100-200 точек), расположенных в узлах сетки с размером ячейки в 50 микрон. Таким образом каждое последующее измерение проводилось в ранее неисследованной точке поверхности слюды.
После этого буферный раствор заменялся в зависимости от цели каждого конкретного эксперимента либо на такой же буферный раствор (эта замена связана с тем, что буфер испаряется за время такого эксперимента на 10-20 %), либо на буферный раствор с другим значением рН, либо производилась замена кантилевера (с аналогичной модификацией), связанная с тем, что амилоид /3 пептид отваливался от острия. Через 10 минут, которые требовались для достижения равновесия в системе, проводился следующий эксперимент.
При используемой в моих экспериментах концентрации амилоид (3 пептида (1.13 /ІМ) примерно через 100-300 циклов подвода и отвода кантилевера амилоид (3 пептид отваливался от острия. Это было видно по силовым кривым, которые через несколько сотен циклов становились одинаковыми: на них было видно только адгезионное неснецифицсскос взаимодействие, но не было видно характерных силовых кривых, наблюдаемых в начале эксперимента и связаных с межмолекулярным взаимодействием.
После этого силовые кривые, полученные на ACM Nanoscope Ша обрабатывались написанной мной программой, которая находила характерные пики, связанные с межмолекулярным взаимодействием, вычисляла для них силу, которую потребовалось приложить с острию, чтобы разорвать связь между двумя молекулами амилоид /3 пептида, закрепленными на слюде и острие соответственно. В каждом отдельном эксперименте получалось примерно 10 силовых кривых, содержащих характерные пики.
Результаты, изображенные на рисунке 27 А, получены в результате 10 одинаковых экспериментов, проведенных в течение одного месяца. Было получено около 5000 силовых кривых, но только на нескольких десятков из них содержался пик, соответствующий взаимодействию двух молекул. На основе этих данных построена общая гистограмма сил.
Силовые кривые приведены в координатах „Сила" — „Расстояние между острием и образцом". Сила F определяется из закона Гука F = kd, где к — жесткость кантилевера, d — отклонения кантилевера, измеряемое при помощи лазерного луча. Расстояние s между образцом и канти-левером полагается равным s = d — Z, где Z — положение пьезосканера. В этих координатах шумовой сигнал имеет специфический (наклонный) вид [69].
Аналогичные эксперименты (с видоизмененным способом снятия защиты с SH групп амилоид /3 пептида и значительно большей концентрацией амилоид (3 пептида на острие) были выполнены Алексеем Крас-нослободцевым и Людмилой Сергеевной Шляхтенко на ACM Molecular Force Probe 3D. Этот прибор обладает рядом недостатков, таких как неудобный способ замены буферного раствора и невозможность проводить измерения в разных точках поверхности с неизменными параметрами эксперимента, но обработка результатов экспериментов значительно проще и ее можно проводить при помощи специального программного обеспечения, см. рис. 27 Б.
