Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 13
Полимерные системы медико-биологического назначения
1.1. Современные раневые покрытия: принципы получения, свойства 13
1.1.1. Раневые покрытия с антимикробным действием 17
1.1.2. Раневые покрытия с иммобилизованными ферментами 34
1.1.3. Раневые покрытия с комбинированным биологическим действием 47
1.2. Полиэлектролитные комплексы с участием белков 53
Глава 2. Материалы и методы 64
Основные результаты и их обсуждение 75
Глава 3. Исследование последовательной иммобилизации ферментов и антимикробных веществ на волокнистых материалах 75
3.1. Комплексообразование ферментов с привитыми сополимерами целлюлозы ионогенного типа 79
3.2. Ковалентная иммобилизация террилитина на волокнистых носителях 109
3.3. Влияние антимикробных веществ на биологическую активность волокнистых материалов, содержащих иммобилизованные протеоли-тические ферменты 127
3.4. Медико-биологические исследования материалов с
ферментативной и антимикробной активностью 137
Глава 4. Совместная иммобилизация ферментов и антимикробных веществ на немодифицированных волокнистых материалах 142
4.1. Получение и свойства интерполимерных комплексов протеолитических ферментов с растворимыми полиэлектролитами 142
4.2. Влияние условий иммобилизации полимерных композиций с ком плексной биологической активностью на структуру и фармакокинетические свойства модифицированных волокнистых материалов 186
Глава 5. Влияние добавок биополимеров и модифицирующих веществ на надмолекулярную структуру и фармакокинетические свойства биологически активных поливинилспиртовых пленок 243
Глава 6. Исследование воздействия ионизирующего облучения на биологическую активность полимерных материалов 288
Выводы 301
Заключение 304
Библиография
- Раневые покрытия с антимикробным действием
- Влияние антимикробных веществ на биологическую активность волокнистых материалов, содержащих иммобилизованные протеоли-тические ферменты
- Влияние условий иммобилизации полимерных композиций с ком плексной биологической активностью на структуру и фармакокинетические свойства модифицированных волокнистых материалов
- Исследование воздействия ионизирующего облучения на биологическую активность полимерных материалов
Введение к работе
Интенсивное развитие химии медико-биологических полимеров обусловлено непрерывно растущим уровнем медицинских технологий и возникающей в связи с этим необходимостью создания изделий и средств на основе синтетических и натуральных полимеров для восстановления и обеспечения нормальной жизнедеятельности организма [1,2].
Актуальность разработки и совершенствования раневых покрытий диктуется задачами современной реконструктивной хирургии и низкой эффективностью традиционных перевязочных средств. Кроме того, развитие концепции процесса ранозаживления предъявляет новые требования к раневым покрытиям, функции которых в настоящее время значительно расширились и заключаются не только в защите раны от внешних воздействий, но и в создании оптимальных условий для заживления [3-5]. К числу перспективных перевязочных средств относятся материалы, обладающие комбинированным лечебным действием, в частности ферментативным и антимикробным. Целесообразность применения покрытий с таким комплексом свойств является патогенетически обоснованной, т.к. в первой фазе раневого процесса необходимо подавление воспаления и очищение раны от некротических масс [3, 6]. Введение в состав материалов протеолитических ферментов с коллагенолитическои активностью позволит применять их и на стадии формирования рубца [6]. Преимущества иммобилизованных форм ферментов над нативными известны, наиболее важные из них — повышение стабильности и уменьшение иммунологической и аллергической реакций организма за счет понижения способности модифицированного фермента стимулировать образование антител и реагировать с ними [7].
Сложность получения лекарственных композиций, содержащих одновременно фермент и антимикробное вещество, заключается в возможной инактивации протеазы. Это связано с высокой реакционной способностью антимикробных веществ по отношению к белкам. Таким образом, становит-
ся очевидным, что фермент должен быть защищен от прямого воздействия на него антимикробного вещества. Для этого есть два пути: первый - получение материала с комбинированным биологическим действием по двухста-дийному способу, когда сначала проводится иммобилизация фермента с целью его стабилизации, а затем - антимикробного вещества. Второй — подбор таких компонентов, которые позволили бы создать кинетически устойчивую систему, содержащую фермент и антимикробное вещество, и затем использовать ее для иммобилизации на материалах различного типа.
Специфика раневых покрытий с биологическим действием состоит в том, что в отличие от других материалов для наружного применения в медицинской практике, например антимикробных тканей, они являются средствами одноразового использования с коротким сроком эксплуатации, поэтому их биологическая активность должна максимально реализовываться при наложении на рану. В связи с этим большой интерес представляет разработка таких методов иммобилизации ферментов и антимикробных веществ, которые позволили бы получать обратимые в физиологических средах соединения, а за счет регулирования состава полимерной системы и характера взаимодействий между ее компонентами направленно изменять свойства раневых покрытий и благодаря этому расширить арсенал имеющихся перевязочных средств.
Цель работы заключается в научном обосновании принципов получения волокнистых и пленочных материалов медицинского назначения, одновременно содержащих иммобилизованные фермент и антимикробное вещество, а также в характеристике особенностей фармакокинетических, физико-химических и медико-биологических свойств разработанных раневых покрытий с пролонгированным комплексным биологическим действием.
В связи с этим были поставлены задачи: 1. Провести сравнительное изучение иммобилизации протеолитических ферментов и антимикробных веществ на модифицированных полимерных
фицированных полимерных носителях, а также специфической активности, стабильности и физико-химических свойств полученных материалов.
Изучить закономерности получения полимерных композиций с комбинированной биологической активностью, их иммобилизации в структуре волокнистых и пленочных материалов и влияния условий получения на специфические свойства.
Изучить микробиологические и медико-биологические свойства материалов с комплексной биологической активностью.
Научная новизна работы. Разработаны принципы совместной иммобилизации ферментов - медицинских субстанций и антимикробных веществ в структуре волокнистых и пленочных материалов, использование которых позволяет получать полимерные раневые покрытия с прогнозируемым уровнем комбинированного биологического действия.
Показана возможность регулирования состава, структуры, активности и стабильности комплексов ферментов с нерастворимыми (модифицирован-ными волокнистыми материалами) и растворимыми полиэлектролитами путем изменения заряда, степени ионизации и количества ионогенных групп полиэлектролита, введения в молекулу полиэлектролита гидрофобных заместителей или образования межмолекулярных химических связей.
Установлена зависимость фармакокинетических свойств волокнистых и пленочных материалов, содержащих одновременно иммобилизованные фермент и антимикробное вещество, от характера химических и нехимических взаимодействий, реализуемых в многокомпонентной полимерной системе и определяющих надмолекулярную структуру полимерных материалов.
Показано, что формирование структуры композиционного соединения на волокнистой основе можно контролировать, изменяя состав полимерной системы, используемой при иммобилизации: содержание полимерных компонентов, химическую природу волокнистой матрицы и антимикробного
вещества, заряд полиэлектролита и степень его ионизации, тип сшивающих реагентов, молекулярную массу антимикробного вещества.
Сформулированы представления о формировании межфазных адсорбционных слоев в многокомпонентной полимерной системе на основе поливинилового спирта, содержащей фермент и антимикробный поликатион, и показана возможность влияния на структурообразование путем изменения степени ионизации поликатиона, введения полимерного противоиона и сшивающего реагента.
Установлено радиопротекторное действие полимера-носителя в отношении иммобилизованного фермента, обусловленное эстафетным механизмом передачи свободного радикала с облученной макромолекулы иммобилизованного белка на полимер-носитель.
На защиту выносятся:
научно-обоснованные принципы получения волокнистых и пленочных материалов с прогнозируемым уровнем ферментативной и антимикробной активности;
совокупность закономерностей и обобщений, расширяющих область знаний о модификации ферментов (трипсина, террилитина, коллитина, про-теазы С, лизоцима) и свойствах их иммобилизованных форм;
разработанные методы совместной иммобилизации ферментов и антимикробных веществ в структуре волокнистых и пленочных материалов.
Практическая значимость диссертационной работы.
Впервые получены полимерные раневые покрытия, содержащие со-иммобилизованные протеолитический фермент и высокомолекулярное антимикробное вещество.
Разработаны научные и технологические основы создания волокнистых и пленочных материалов с ферментативным и антимикробным действием.
Получено разрешение МЗ РФ на промышленное производство волокнистых раневых покрытий, содержащих фермент и хлоргексидина биглюконат или мочевину, разработанных совместно с ВНИИТГП (ВНИИТМ).
Совместно с Московским научно-исследовательским онкологическим институтом им. П.А.Герцена разработано универсальное пленочное покрытие, содержащее лизоцим и хлоргексидина биглюконат, для профилактики воспалительных процессов и лечения обширных ран различной этиологии.
Личный вклад автора заключается в постановке целей и задач исследований, теоретическом и методическом обосновании путей их решения, непосредственном выполнении исследований, обобщении результатов, организации проведения медико-биологических испытаний.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на Третьей Всероссийской Каргинской конференции "По-лимеры-2004" (Москва), II международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003), I-IV международных конференциях "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов " (Москва, 1992, 1995, 1998, 2001), Всероссийских научно-технических конференциях "Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Москва, 1998, 1999, 2001, 2003), Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии" (Москва, 2002), Международных конференциях "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" (Москва-Щелково, 1999, 2001), Международных симпозиумах по химическим волокнам (Калинин 1986, Тверь 2000), Международной конференции "Synergetic of macromolecular hierarchic structures" (Ташкент, 2000), I Всероссийской научной конференции "Физико-химия процессов переработки полимеров" (Иваново, 1999), Международном симпозиуме "Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов" (Минск, 1998), Международной конференции "Некоторые проблемы химии
и физики полисахаридов" (Ташкент, 1997), I Международной научно-технической конференции "Актуальные проблемы химии и химической технологии" (Иваново, 1997), Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов — новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты" (Владивосток, 1991), European symposium on carbohydrate chemistry (Edinburgh, Scotland, 1991), Всесоюзной научной конференции "Проблемы модификации природных и синтетических волокнообразующих полимеров" (Москва, 1991), Республиканской научно-практической конференции "Синтез и применение энтеросорбентов" (Конаково, 1990), VI Всесоюзной конференции по физике и химии целлюлозы (Минск, 1990), Всесоюзной конференции "Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицинской и микробиологической промышленности" (Ташкент, 1989), I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), 2-й Всесоюзной конференции "Интерполимерные комплексы" (Рига, 1989), I Всесоюзной конференции "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов" (Москва, 1989), V и VI Всесоюзных симпозиумах "Инженерная энзимоло-гия" (Олайне, 1985, Вильнюс, 1988), VII Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Минск, 1985), IV Московской конференции по органической химии и технологии (Москва, 1985).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 52 статьи, 43 тезисов докладов, получены 3 авторских свидетельства СССР и 1 патент РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, заключения, библиографии (316 наименований) и приложения, включающего акты об испытаниях. Основной текст диссертации изложен на 328 страницах, включает 120 рисунков и 16 таблиц.
Работа выполнена на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета в рамках совместных исследований с Государственным научным центром ТУНП Антибиотики", Охтинским НПО "Пластполимер", Всероссийским научно-исследовательским институтом полимерных волокон, Институтом элемен-тоорганических соединений РАН, Институтом синтетических полимерных материалов РАН, МГУ им. М.В.Ломоносова (Биофак), Московской медицинской академией им. И.М.Сеченова, НИИ лазерной хирургии, Московским научно-исследовательским онкологическим институтом им. П.А.Герцена в соответствии с программой ОЦ 015, Государственной научно-технической программой "Новейшие методы биоинженерии" по направлению "Инженерная энзимология", Межвузовской научной программой "Университеты России".
Раневые покрытия с антимикробным действием
Одна из функций раневых повязок - защита раны от проникновения патогенной микрофлоры из окружающей среды. Традиционная повязка обеспечивает лишь надежную механическую защиту, но одновременно, поглощая раневое отделяемое, она становится благоприятной средой для развития болезнетворной микрофлоры. Поскольку любая рана, нанесенная без соблюдения правил асептики, считается бактериально загрязненной, то развитие инфекционного процесса под индифферентной повязкой приводит к распространению микрофлоры в подлежащие ткани и воспалению. Для профилактики гнойно-воспалительных осложнений целесообразно использование повязок с антимикробным действием [3, 6].
Для придания полимерам антимикробной активности, как природным, так и синтетическим, используют методы химического модифицирования матрицы с последующим присоединением к ней лекарственных веществ или их включения в структуру полимерного материала, которые подробно освещены в работах [14-18]. В отличие от антимикробных материалов иного назначения раневые покрытия - это одноразовые средства и выделение из них лекарственных веществ в раневую среду должно начинаться с момента соприкосновения с раной. Очевидно, что это может быть достигнуто за счет лабильных связей, разрушаемых in vivo. Поэтому в данной главе будут рассмотрены методы получения только раневых покрытий с антимикробным действием. Как отмечалось выше, целлюлоза и ее производные являются объектами многих исследований, направленных на улучшение их физико-химических свойств и придание биологической активности.
Следует отметить, что в ряде случаев целлюлоза после химической модификации приобретает собственную физиологическую активность, что позволяет ее использовать в качестве лечебной формы без присоединения лекарственных веществ. Интересным является использование вискозного волокна, частично гидролизованного с помощью целлюлаз [19]. После ферментативного гидролиза сорбция материалом стафилококка увеличивается на 90% по сравнению с 2% исходного волокна, что способствует снижению контаминации раны. Карбоксиметилцеллюлоза, содержащая функциональные группы кислотного типа, способна связывать в раневой среде пептиды, в частности эластазу, и таким образом подавлять ее активность [20]. Хорошо известно применение монокарбоксилцеллюлозы в качестве кровоостанавливающей марли [21].
В то же время названные производные целлюлозы являются потенциальными матрицами для физической или химической иммобилизации биологически активных веществ. Так, растворимая монокарбоксилцеллюлоза используется для получения раневых покрытий, содержащих антибиотики. Путем сорбции линкомицина основания окисленной целлюлозой с последующей многократной пропиткой материала получены так называемые пленки с линкомицином [22 с.66-67]. Количество сорбированного линкомицина определяется условиями реакции: строением матрицы и соотношением компонентов. Содержание карбоксильных групп незначительно влияет на количество связанного антибиотика, хотя отмечается тенденция его симбат-ного изменения с ростом степени окисления. Использование растворов, содержащих 0,79-0,89 г линкомицина на 1 г окисленной целлюлозы, позволяет получать препараты, содержащие более 40% антибиотика. Материал разрешен к применению и предназначен для профилактики и лечения гнойно 19 воспалительных процессов различной локализации и происхождения, особенно при наличии диффузной кровоточивости тканей [22 с. 66-67 ].
Способы введения лекарственного вещества в состав производных целлюлозы могут быть различны [14-17] и обусловлены характером медико-биологической задачи, а также возможностями переработки полимера в конечный продукт. Большой интерес представляют водорастворимые производные. Из смеси ацетилцеллюлозы с лекарственными веществами формуют волокна [21]. Этилцеллюлозу в качестве пленкообразующего компонента вводят в бактерицидные жидкости, которые содержат левомицетин или фу-рацилин. При нанесении такого состава на кожу (при лечении порезов и других небольших дефектов) образуется пленка, не смывающаяся в течение двух суток и оказывающая антибактериальное действие [21].
Наиболее часто в работах используют готовые физические формы целлюлозы, особенно волокнистые. Химическое модифицирование целлюлозных волокнистых материалов в виде марли, тканого, трикотажного и нетканого полотен и последующее их использование в качестве носителей лекарственных веществ является наиболее технологичным, т.к. позволяет проводить процесс на действующем оборудовании текстильной промышленности. Карбоксиметилированному целлюлозному трикотажному полотну антимикробные свойства придавали путем импрегнирования раствором фура-гина или хлоргексидина биглюконата и дополнительной обработки спиртовым раствором ментола для придания обезболивающего действия [23]. Окисленную медицинскую марлю - диальдегидцеллюлозу (ДАЦ) со степенью окисления 1,5% использовали для ковалентного связывания бактерио-литического препарата лизоцима [24]. Однако следует отметить большую продолжительность процесса получения данного материала: окисление целлюлозы - примерно 6 ч и иммобилизация - 10-22 ч.
Влияние антимикробных веществ на биологическую активность волокнистых материалов, содержащих иммобилизованные протеоли-тические ферменты
Это подтверждается результатами исследования рН-профиля действия фермента. рН-Оптимум действия террилитина, иммобилизованного путем сшивки на целлюлозном материале, не отличается от нативного, но профиль расширяется в щелочную область, что является результатом модифицирования аминогрупп белка (рис. 28). Существенно меняется рН-профиль действия фермента, иммобилизованного на поликапроамидном материале, причем при низком содержании глутарового альдегида - только расширяется в щелочную область при сохранении оптимума действия, а при высоком — существенно (на 2 ед.) смещается в щелочную область и оптимум. Объяснением этого может быть различное строение модифицированной формы террилитина. При иммобилизации на поликапроамидном материале, вероятно, происходят существенные конформационные изменения, кроме того, при высокой концентрации глутарового альдегида значительная часть аминогрупп белка оказывается ковалентно связанной, это изменяет заряд глобулы и приводит к сдвигу оптимума в щелочную область. Аналогичный факт отмечен в работе [186]. В то же время в работе [273] было показано, что в результате сшивки уреазы, иммобилизованной на карбоксилсодержащем носителе с помощью глутарового альдегида, ее рН-оптимум сдвигался в кислую область при увеличении концентрации сшивающего агента. Это может быть обусловлено особенностями модифицирования макромолекулы уреазы, при котором для ионизации функциональных групп активного центра необходимо подавление депротонирования полимерной матрицы, что достигается при снижении рН.
Сравнительный анализ процесса иммобилизации террилитина путем ионного и ковалентного связывания позволяет отметить преимущества и недостатки рассмотренных методов. Использование для иммобилизации низкомолекулярного сшивающего реагента исключает необходимость предварительной модификации полимерного носителя, при этом можно довольно широко варьировать содержание фермента, фиксированного на волокнистом носителе, и его активность. Кроме того, реакцию можно проводить вблизи рН-оптимума действия фермента, где его макромолекулы обладают высокой конформационной устойчивостью, а доступность функциональных групп для модифицирования достигается за счет низкой молекулярной массы сшивающего реагента. Однако существенной стабилизации по сравнению с натив-ным террилитином не происходит.
При связывании фермента с функциональными группами, находящимися в основной цепи полимера (альдегидными) или в привитых цепях, эффективная константа инактивации фермента в некоторых случаях снижается на порядок. При этом по физико-химическим свойствам (температурный и рН-профиль действия), активности иммобилизованного фермента и степени связывания белка значительные преимущества имеет террилитин, иммобилизованный на привитом сополимере целлюлозы и полиакриловой кислоты.
Различные способы иммобилизации ферментов на волокнистых материалах привели к термостабилизации ферментов. Это позволяет высказать предположение о возможности повышения их устойчивости и к действию других денатурирующих факторов, к которым можно отнести и действие антимикробных веществ: хлоргексидина биглюконата, гентамицина сульфата, фурагина, а также биологически активного вещества другого типа - мочевины. Мочевина известна как сильный денатурирующий агент для белков [257], поэтому ее применяют при лечении гнойных ран в качестве средствах кератолитическим действием [38]. Было исследовано влияние различного по продолжительности воздействия 30%-ного раствора мочевины (модуль 20, комнатная температура) на активность террилитина, иммобилизованного на различных носителях (целлюлоза, диальдегидцеллюлоза, привитой сополимер целлюлозы и полиакриловой кислоты) за счет образования различных связей (ковалентных и ионных). Согласно полученным данным (табл. 18), иммобилизация приводит к существенному повышению устойчивости фермента к действию денатурирующего реагента, уровень которой зависит от способа иммобилизации.
При действии на протеазы денатурирующих реагентов типа мочевины или гуанидина гидрохлорида причиной быстрой инактивации является ускорение автолиза, что обусловлено увеличением денатурированной формы фермента, которая быстро гидролизуется нативным ферментом [257]. Инак-тивирующее действие мочевины на террилитин, химически связанный с модифицированной целлюлозной матрицей, менее выражено, чем на сшитый глутаровым альдегидом на модифицированных волокнистых материалах. Причем в последнем случае террилитин, иммобилизованный на целлюлозном носителе, после обработки мочевиной проявляет активность в 2 раза большую, чем на поликапроамидном. Этот факт, а также довольно высокий уровень стабильности к действию мочевины террилитина, связанного с модифицированными целлюлозными носителями, позволяет сделать вывод о защитном действии целлюлозной матрицы. По-видимому, в образовании водородных связей с мочевиной участвуют в основном макромолекулы целлюлозы.
Полученные данные удовлетворительно коррелирует с результатами по термостабильности: эффективная константа инактивации террилитина, иммобилизованного на привитом сополимере целлюлозы и полиакриловой кислоты или на диальдегидцеллюлозе, уменьшается примерно в 5 раз, в то время как террилитина, иммобилизованного на целлюлозном и поликапроамидном волокнистых носителях с использованием сшивающего реагента, — остается на уровне значения нативного фермента (табл. 8, 14, 17).
Влияние условий иммобилизации полимерных композиций с ком плексной биологической активностью на структуру и фармакокинетические свойства модифицированных волокнистых материалов
Причиной активации трипсина и коллитина, связанного с поликатионом, может быть снижения сил электростатического отталкивания одноименно заряженных макромолекул субстрата (казеина), способствующее образованию фермент-субстратного комплекса.
Отсутствие стабилизирующего действия для трипсина при использовании в композиции ПЭИ, возможно, обусловлено проведением реакции в области рН (9,2), соответствующей границе конформационной устойчивости нативного фермента (рН 9) [257]. Остаточная активность и стабильность повышаются по сравнению с нативным трипсином лишь в случае очень низкой концентрации поликатиона. Увеличение содержания ПЭИ приводит с уменьшению количества стабильной формы фермента, что связано с усилением степени модифицирования белковой макромолекулы.
Сравнительная оценка свойств трипсина и коллитина, сходных по физико-химическим свойствам, в полимерных композициях разного состава показывает, что комплексообразование с одними и теми же полиэлектролитами по-разному сказывается на их активности и стабильности. Так, увеличение содержания альгината натрия в композиции приводит к симбатному изменению активности трипсина и снижению активности коллитина; стабильность трипсина при этом мало изменяется, а коллитина — возрастает. В целом, по стабилизирующему воздействию полисахариды располагаются примерно в один ряд, в котором полиамфолит является невыгодным партнером в ком-плексообразовании. Положительный эффект стабилизации достигается в композициях трипсина и коллитина с поликатионными антимикробными веществами, поскольку в этом случае в реакции с основными группами полиэлектролита участвуют -СООН группы фермента, расположенные на поверхности белковой глобулы, что мало изменяет нативную конформацию, но одновременно стабилизирует ее [249].
Таким образом, анализ свойств ферментов в композициях с полиэлектролитами различной химической природы позволяет определить наиболее выгодных партнеров для получения полимерных систем, характеризующихся высоким уровнем ферментативной стабильности. Наибольший интерес среди исследуемых ферментов представляет комплексная протеаза С, которая сохраняет высокие показатели в композициях с полианионами, поликатионами и полиамфолитами. Для других протеаз (коллитина, трипсина, террилитина) целесообразным является использование одноименно заряженных полиэлектролитов. Очевидно, что в таком случае в наибольшей степени сохраняется нативная конформация, которая закрепляется наложением небольшого числа солевых связей.
В различной степени удачным комплексообразующим компонентом для всех протеаз можно считать соли ПГМГ. Возможно, в данном случае имеет значение наличие гуанидиновых группировок в макромолекуле поликатиона. Хотя известно, что гуанидин в высокой концентрации (порядка 6 М) является инактивирующим агентом для ферментов вследствие активации процесса автолиза протеаз, в то же время гуанидирование лизиновых остатков в белковой молекуле происходит без потери ферментативной активности [246]. Можно полагать, что макромолекула соли ПГМГ, благодаря своему химическому строению, образует с белковой глобулой систему химических и водородных связей, дополнительно стабилизирующих нативную конформа-цию белка. Естественно, что с отрицательно заряженными белковыми молекулами достигается больший эффект стабилизации (для террилитина k . = 20-104), а с положительно заряженными - меньший (для трипсина к = 4,3-40). Полученный результат представляет большой интерес для получения ПЭК с комбинированной биологической активностью, поскольку соли ПГМГ, как указывалось выше, являются полимерами с собственной физиологической активностью.
Одним из важных и перспективных направлений применения полимерные композиций, изученных в гл. 4.1, является их иммобилизация в структуре волокнистых материалов, предназначенных для использования в медицине. Однако в этом случае в реакционную систему включается нерастворимый полимер, структура и свойства которого могут влиять на специфические свойства иммобилизованного фермента. При иммобилизации биологически активных композиций на волокнистых материалах путем импрегнирования раствором полимерной композиции, содержащей ПВС, глобулярный белок, полиэлектролит и модифицирующие добавки, играющие роль сшивающих реагентов, и последующего высушивания, происходит не только концентрирование полимерных компонентов, но и образование ковалентных связей между компонентами системы. Это позволяет говорить о конечном продукте как о псевдо-взаимопроникающей полимерной сетке, структура которой определяется уровнем межмолекулярных взаимодействий и конформацией макромолекулярных компонентов [292].
Исследование воздействия ионизирующего облучения на биологическую активность полимерных материалов
В настоящее время пленочные материалы рассматриваются как наиболее перспективная альтернатива перевязочным средствам на текстильной основе. Среди пленкообразующих полимеров огромные преимущества имеет ПВС - нетоксичный, биодеградируемый синтетический полимер [281], В гл.4 было показано, что ПВС благодаря образованию водородных связей дополнительно стабилизирует макромолекулы ферментов, что создает благоприятные предпосылки для его использования в качестве матрицы для иммобилизации ферментов и антимикробных веществ.
Введение биологически активных и модифицирующих компонентов с различной молекулярной массой и термодинамической совместимостью позволит регулировать структуру формовочного раствора и свойства получаемой из него пленки. Однако при этом важно, чтобы при происходящих изменениях структурно-механических свойств формовочный раствор был кинетически устойчивым (по меньшей мере в течение суток) при температуре 25±5 С и не инактивировал биологически активные компоненты, содержащиеся в дозах, близких к терапевтически необходимым.
Одной из трудностей при реализации технологического процесса получения ПВС пленочных материалов является структурирование формовочных растворов полимера, что объясняется несколькими причинами: - сравнительно высокой концентрацией раствора ПВС (примерно 10%), необходимой для получения пленки с удовлетворительными физико-механическими характеристиками; - невысоким термодинамическим сродством растворителя (воды) к ПВС; - сильным межмолекулярным взаимодействием, обусловленным наличием часто расположенных по цепи макромолекулы полярных групп (примерно 40% масс). Возможное участие макромолекул ПВС в образовании как химических, так и нехимических связей при введении в раствор ПВС добавок различного типа (белков, полимерных антимикробных веществ и др.) делает крайне важным изучение структурно-механических свойств формовочных композиций.
Как известно, совместимость полимеров зависит от многих факторов: химической природы растворителя, его сродства к полимерам в смеси, сродства полимеров друг к другу, добавок других веществ, молекулярной массы, молекулярно-массового распределения полимеров и соотношения полимеров [302, 303].
В исследуемых системах ПВС, белок, ПГМЦХ) и альгинат натрия обладают высоким сродством друг к другу благодаря наличию высокополярных функциональных групп, а вода является хорошим растворителем для всех компонентов, за исключением ПВС. При комнатной температуре водно-спиртовой раствор ПВС хорошо совмещается с водными растворами названных полимеров. В некоторых случаях визуально системы однофазны (растворы прозрачны). Однако, поскольку исследуемые полимеры не являются взаимно растворимыми, то такие системы рассматриваются как микрогетерогенные [302]. Формовочные растворы, содержащие ПГМГ(Ф), представляют собой двухфазные термодинамически устойчивые системы. ПГМГ(Ф) по сравнению с ПГМГ(Х) обладает меньшим сродством к компонентам системы, что обусловлено компактной структурой его неионизованных макромолекул.
Как видно из данных, представленных в табл. 58, 59, введение в водно-спиртовой раствор ПВС добавок террилитина или протеазы С приводит к снижению начальной вязкости и энергии активации Еа вязкого течения, что свидетельствует об изменении структуры раствора (вязкостью водных растворов полимерных добавок можно пренебречь). Введение соли ПГМГ в отсутствие фермента или одновременно фермента и полимерного антимикробного вещества в количестве 0,1% приводит к тому же результату.
Следует отметить, что при введении в систему наряду с ферментом ПГМГ(Ф) начальная вязкость снижается в большей степени, чем в растворах, содержащих ПГМГ(Х), что можно объяснить конформационными отличиями макромолекул антимикробных веществ, влияющими на структуру образуемых граничных слоев. Соли ПГМГ с ММ 10 кДа, по всей вероятности, находятся в дисперсионной среде. Обладая поверхностно-активными свойствами, они снижают межфазное поверхностное натяжение и влияют на формирование толщины межфазного адсорбционного слоя [302]. Для макромолекул ПГМГ(Х) характерна более высокая степень асимметрии, чем для слабо ионизованных макромолекул ПГМГ(Ф). Поэтому регулярное расположение в цепи ПГМГ(Х) полярных функциональных групп приводит к увеличению числа контактов сегментов и образованию протяженных граничных слоев. Увеличение количества ПГМГ(Х) до 0,5% повышает начальную вязкость раствора по сравнению с не содержащим добавок (табл. 58). Это объясняется дальнейшим увеличением концентрации полимера в дисперсионной среде, сегментальной растворимости и уменьшением свободного объема. В то же время энергия межмолекулярного взаимодействия не превышает таковую в исходном растворе ПВС, поскольку энергия активации вязкого течения при этом не увеличивается.
Аналогичный эффект антипластификации [304] при получения формовочного раствора на основе ПВС при введении альбумина наблюдали авторы [305]: при содержании альбумина в растворе не более 5% происходило снижение начальной вязкости по сравнению с исходной полимерной композицией, а при введении в нее 10% белка - повышение.