Введение к работе
з .
Актуальность проблемы. Развитие биоаналитических методов определения белковых молекул, низкомолекулярных веществ (гаптенов), нуклеиновых кислот является одной из актуальных проблем медицины, иммунологии, биотехнологии. В последние годы в этой области все более широко используются полимерные дисперсии, частицы которых нашли применение в качестве носителей биологических лигандов при создании реагентов для биохимических исследований. Основные требования, которым они должны удовлетворять - это заданный диаметр полимерных частиц, их узкое распределение по размерам, биологическая и коллоидно-химическая устойчивость в физиологических растворах, возможность образования ковалентной связи белков и других биолигандов с функциональными группами полимера, расположенными на поверхности частиц, возможность введения различных добавок (хромофорных, флуорофорных, функциональных и т. д.). В связи с этим весьма актуальным является получение таких полимерных частиц для различного вида биохимических исследований.
Цель данной работы состояла в синтезе полимерных микросфер, содержащих специальные метки (флуоресцентные, хромофорные, дипггонин) для детекции нуклеиновых кислот, гербицида (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) и холестерина при биоаналитических исследованиях.
Научная новизна.
Установлено, что диаметр полиакролеиновых частиц, распределение частиц по размерам, их коллоидно-химическая устойчивость существенно зависят от природы ксантеновых красителей, поверхностно-активных веществ и других добавок, влияющих на межмолекулярное взаимодействие полимерных цепей, например, водного раствора аммиака.
Показано, что при полимеризации стирола с использованием дигитонина в качестве стабилизатора при определенной концентрации мономера и инициатора формируются полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам.
Найдено, что добавление водного раствора аммиака при получении полиакролеиновых суспрнзии увеличивает степень ассоциации олигомеров акролеина и снижает их содержание в водной фазе. Использование таких суспензий повышает чувствительность реакции ингибирования латексной агглютинации с визуальной детекцией результатов на примере определения гаптена 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4-D).
Разработан метод нерадиоактивной детекции нуклеиновых кислот путем
гибридизационного анализа на мембране, в котором в качестве маркера использовали
сенсибилизированные стрептавидином полиакролеиновые микросферы, содержаи
флуоресцентный краситель.
Впервые специфическое взаимодействие полистирольных частиц, стабилизировав
дигитонином, с холестерином плазматических мембран клеток эндотелия и липиді
монослоев подтверждено методом электронной сканирующей микроскопии и метог
Ленгмюра-Блоджетт.
Практическая значимость работы. Созданы биореагенты на осн флуоресцентных полиакролеиновых микросфер, применение которых в гибридизациош анализе нуклеиновых кислот дает возможность значительно упростить проведи нерадиоактивных методов определения ДНК. Получены биоаналитические реагенты основе окрашенных полиакролеиновых микросфер, которые позволяют использовать , определения гербицидов простой, чувствительный, не требующий специальн оборудования метод ингибирования латексной агглютинации в нммунохимичесі планшете. Выявлены оптимальные концентрации биореагентов для определения 2,4-1 реакции ингибирования латексной агглютинации с турбидиметрической регистрац результатов. Разработан способ получения специфического латекса-маркера количественного определения холестерина в плазматической мембране клеток.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано работ и получено 1 авторское свидетельство. Результаты работы докладывались Российских и международных конференциях.
Автор защищает:
исследование влияния различных добавок на устойчивость полиакролеиновых диспер в процессах полимеризации и сополимеризации, диаметр частиц, распределение их размерам, а также коллоидно-химическую устойчивость;
способ получения полистирольных частиц с узким распределением по размерам
использовании дигитонина в качестве стабилизатора;
- данные по детекции ДНК в дот-анализе с использованием флуоресценті
полиакролеиновых микросфер, сенсибилизированных стрептавидином;
- цетод определения гербицида 2,4-D с участием окрашенных полиакролеиної
микросфер, сенсибилизированных моноклональными антителами к 2,4-D, в реак ингибирования латексной агглютинации, проводимой в иммунохимическом планшете
- данные по использованию сополимерных микросфер для исследования реак
латексной агглютинации методом турбидиметрии при определении гербицида 2.4-D;
5 - исследование взаимодействия латекс-маркера, содержащего дигитонин, и холестерина
плазматических мембран и липидных монослоев методом электронной сканирующей
микроскопии и с помощью мономолекулярных пленок, полученных на весах Ленгмюра.
Струїсгура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения,
литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и
списка литературы, включающего /
42 рисунка и 12 таблиц.
Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована ее цель.
