Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших задач современной химии медико-биологических полимеров является создание систем, селективно воздействующих на одно или достаточно узкий круг соединений >в сложных биологических системах. Решение этой проблемы открывает перспективы для создания полимеров, моделирующих функции клеток живых организмов. Одним из немногих путей решения указанной проблемы является использование аффинной хроматографии. Однако, этот метод обеспечивает только- одну операцию - обратимое и'специфическое взаимодействие белков, полипептидов и других биологически активных соедвпений с определенным лигандом, иммобилизованным на полимерном носителе.
Принципиальным вопросом является расширение функциональных операций с сорбированным веществом, то есть осуществление на полимерном носителе последовательно нескольких реакций. Решение этой задачи видится, например, в совместной иммобилизации нескольких физиологически-активных ведеств (ФАВ). В этом случае необходимо осуществить благоприятное расположение ФАВ в объеме полимерного > носителя, обеспечивающего возможность последовательного протекания ряда химических реакций. Это может быть достигнуто путем формирования полимерной матрицы одновременно с иммобилизацией предварительно подготовленных ассоциатов физиологически активных веществ, и наиболее перспективным представляется использование для этих целей реакции сополимеризаиии ненасыщенных производных ФАВ с гидрофильным мономером и сшивающим агентом.
В связи с этик целью настоящей работы является изучение возможности создания полимерных систем на оснс-^е нескольких ФАВ, в которых один из иммобилизованных компонентов сорбирует вещество из сложной смеси, а другой Сили другие) трансформируют это вещество до требуекых продуктоз Сприменительно к гекосорбции - до нетоксичных ведеств). Эти продукты должны обладать меньшим сродством к иммобилизованному пиганду и поэтому могут удаляться с зорбента, освобождая лиганд для следующих молекул сорбируемого вещества. Такое одновременное взедение специфического лиганда [как низкомолекулярной, так и полимерной природы) и неспэцифлчес-*ого фермента позволило бы существенно повысить селективность
- 2 -действия последкегс и осуществить, применительно к гемосорбции, превращение токсина в нетоксичное соединение, т.е. смоделировать дэтоксикационную функцию гепатоцита.
В качестве модельного токсина в работе был использован билирубин, являющийся продуктом метаболизма гемоглобина. В качестве ФАВ выбраны: сывороточный альбумин человека, образующий прочные комплексы с билирубином, и ферменты класса оксидоредуктаз Спероксидаза хрена, алкогольоксидаза, глюкозоксидаза), позволяющие окислять широкий спектр органических соединений.
Научная новизна. Впервые обнаружена способность пероксндазы хрена катализировать реакцию окисления связанного в комплекс с альбумином билкрубина кислородом воздуха и перекисью водорода. Установлено, что кинетика окисления билирубина кислородом и перекисью водорода подчиняется уравнению Михаэлиса - Ментен, причем при совпадении К», V»»x перекисного окисления приблизительно в 1С раз больше кислородного.
Методами флуоресцентной к ЭПР спектроскопии показано, что механизм обеих реакций включает в себя образование промежуточного комплекса ОгСНЮг) - пероксидаза - альбумин - билирубин.
Показано, что при неглубоких степенях превращения и соблюдении рН-контроля, ацилирование алкогольоксидазы и пероксидазы хлоран-гидридом акриловой кислоты не влияет на каталитическую активность ферментов в окислении комплекса альбумин - билирубин.
Впервые в результате радикальной сополимеризацик ассоциато; макромономеров ФАВ с акриламидом в присутствии сшивателя получені сильконабухающие системы с соиммобилизсванными альбумином Сли^ ганд), пероксидазой и алкогольоксидазой Скаталитическая система) обладающие высокой активностью в. окислении комплексносвязанноп билирубина из растворов. Показано, что в отсутствии альбумина а также при иммобилизации всех немодифпцированных ФАБ на активиро ванные полимерные матрицы активность полимерных производных ФА существенно снижается.
Результаты биохимического испытания полученных многскомпонент ных систем на плазме крови с повышенным содержанием билирубин свидетельствуют о том, что содержание билирубина являете единственным параметром плазмы, изменяющимся в процессе экспери мента
выполненного исследования открывают возможность воздействия на определенный компонент биологической смеси при подборе соответствующей систеша лиганд - катализатор - полимерная матрица. Синтезированные в данной работе сшитые сополимеры на основе альбумина и ферментов класса оксидоредуктаз могут представлять интерес как гемосорбенты для удаления билируоина. Автор защищает :
- обнаруженное явление катализа пероксидазой хрена окисления
билирубина, связанного в комплекс с альбумином, кислородом возду
ха или перекисью водорода, генерируемой по реакции :
С2НдОН + 02 алкогольоксидаза , СНзСНС + ^ .
выеод о механизме указанных реакций, заключающийся в образовании сложных промежуточных комплексов окислителя с пероксидазой и альбумином;
результат сравнительного изучения активностей нативных, аци-лированных хлорангидридом акриловой кислоты и иммобилизованных в полиакриламидный гидрогель пероксидазы хрена и алкогольоксидаэы в окислении комплекса альбумин - билирубин:
подход к созданию гетерогенных систем на основе сополимери-зованных с акриламидом макромономеров алкогольоксидаэы, пероксидазы хрена и сывороточного альбумина для избирательного окисления билирубина;
- результаты биохимических испытаний полученных гемосорбентов.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на
VI Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Каунас, 19803, на VIII Всесоюзном научном симпозиум0 "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Киев, 1989), на II Всесоюзной конференции "Катализ и каталитические процессы химфармпроизводств" (Ташкент, 1989), на конференции молодій: ученых ИНХС им. А В. Топчиева АН СССР (Москва, 1988).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части,- результатов исследования и их обсуждения, еыеодов и списка литературы.