Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о свойствах нанокластеров металлов 8
1.1. Классификация металлических частиц и их основные свойства 8
1.2. Кластеры в водных растворах. Полимер-стабилизированные кластеры 13
1.3. ДНК-стабилизированные кластеры серебра 21
Глава 2. Методы исследования и используемые материалы 44
2.1. Измерение флуоресценции 44
2.2. Нелинейная флуоресцентная спектроскопия насыщения 45
2.3. Микроскопия 47
2.4. Другие методы исследования 52
2.5. Подготовка систем для исследования 55
2.6. Синтез ДНК-стабилизированных кластеров серебра 56
Глава 3. Кластеры серебра, синтезированные на тимусной ДНК 68
3.1. Стационарная люминесценция кластеров 68
3.2. Характеристика систем методами электронной микроскопии 77
3.3. Фотофизические параметры возбужденных состояний ДНК-стабилизированных кластеров 91
3.4. Исследование систем методами спектроскопии поглощения, кругового дихроизма, вискозиметрии и гель-электрофореза. 102
Глава 4. ДНК-полимерная глобула, включающая флуоресцирующие кластеры серебра 111
Заключение 122
Список литературы 124
- Кластеры в водных растворах. Полимер-стабилизированные кластеры
- Нелинейная флуоресцентная спектроскопия насыщения
- Характеристика систем методами электронной микроскопии
- ДНК-полимерная глобула, включающая флуоресцирующие кластеры серебра
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Нанокластеры металлов,
содержащие до нескольких десятков атомов, представляют особый класс
нанообъектов, в электронные свойства которых существенный вклад вносят
квантово-размерные эффекты, благодаря чему их электронно-энергетическая
структура становится подобна молекулярной. Особенный интерес
представляют кластеры благородных металлов (золота, серебра), которые
показывают хорошую способность к люминесценции. Использование таких
структур в качестве люминесцирующих биометок требует создания
устойчивых в водных растворах систем. Для этого были разработаны
методики получения полимер-стабилизированных кластеров с
использованием синтетических и биологических полимеров. Особый интерес
представляют ДНК-стабилизированные люминесцирующие кластеры
серебра. Благодаря высокому сечению поглощения и значительному
квантовому выходу, а также хорошей биосовместимости и фотостабильности,
такие кластеры считаются перспективными для использования в качестве
молекулярных сенсоров и зондов для биомиджинга. Согласно литературным
данным, уникальным свойством ДНК-стабилизированных кластеров является
влияние последовательности ДНК-матрицы, стабилизирующей кластер, на
его спектральные свойства. Наличие долгоживущего возбужденного
темнового состояния и возможность модулирования его заселенности
дополнительной длинноволновой засветкой делает кластеры перспективными
объектами для микроскопии сверхвысокого разрешения и методик
синхронного детектирования. Однако данные о фотофизических параметрах
возбужденных состояний были получены ранее только для кластеров одной
спектральной группы, излучающих в красном диапазоне спектра, хотя
люминесценция подобных структур наблюдалась при разных длинах волн.
Поэтому более подробное изучение люминесцентных свойств кластеров,
синтезированных на различных матрицах, представляется актуальным.
Использование кластеров в качестве флуоресцентных меток для
цитологических исследований подразумевает наличие способов их
эффективной транспортировки через клеточную мембрану, разработка которых также является актуальной задачей. Известно, что комплексы высокомолекулярной ДНК с синтетическими поликатионами являются
широко изученными системами для создания генных векторов. Включение в
такую ДНК-полимерную наночастицу флуоресцирующих структур
представляется перспективным способом упаковки кластеров для
транспортировки внутрь клетки. Решению этих вопросов и посвящена диссертационная работа. Сказанное выше показывает, что выполненные в работе исследования представляют практический интерес и могут быть использованы в био- и нанотехнологических разработках.
Целью работы является создание и изучение свойств
люминесцирующих ДНК-стабилизированных нанокластеров серебра и создание на их основе ДНК-полимерных наночастиц.
В связи с этим в диссертации решаются следующие задачи:
-
Подбор оптимальных условий для синтеза люминесцирующих кластеров серебра, стабилизированных высокомолекулярной ДНК, и изучение их спектральных свойств.
-
Получение ДНК-полимерных наночастиц, включающих кластеры серебра, и изучение их спектральных свойств в растворе и на поверхности графита.
Научная новизна работы заключается в следующем. Впервые продемонстрирована возможность синтеза кластеров на высокомолекулярной природной ДНК. Впервые была предложена и экспериментально проверена возможность включения кластеров в ДНК-полимерные наночастицы. Получены новые данные о фотофизических параметрах возбужденных состояний кластеров, показывающие высокую эффективность перехода ДНК-стабилизированных кластеров в темновое состояние. Метод зондово-усиленной флуоресцентной сканирующей микроскопии был впервые применен для исследования ДНК-полимерных наночастиц, включающих флуоресцирующие кластеры серебра.
Положения, выносимые на защиту:
-
Разработана методика, позволяющая синтезировать люминесцирующие кластеры серебра на тимусной ДНК.
-
Проведена оценка значений сечения поглощения, квантового выхода и времени жизни темнового состояния для кластеров с максимумом возбуждения 532 нм.
-
Показана возможность формирования ДНК-полимерных флуоресцирующих наночастиц, содержащих кластеры серебра.
-
Показано, сформированные в растворе флуоресцирующие наночастицы ДНК-кластер-полимер сохраняют свои флуоресцентные свойства при высаживании на поверхность графита.
-
Методом зондово-усиленной флуоресцентной микроскопии получены спектры высаженных на поверхность графита флуоресцирующих ДНК-полимерных наночастиц с пространственным разрешением, превышающим дифракционный предел.
Практическая значимость работы. Полученные данные
свидетельствуют о возможности создания люминесцирующих
биосовместимых ДНК-полимерных наночастиц. Высокий квантовый выход
темнового состояния ДНК-стабилизированных кластеров, оценка величины
которого выполнена в работе, обеспечивает преимущество при
использовании кластеров для микроскопии сверхразрешения и для их
детектирования методом восстановления синхронно усиленного
флуоресцентного изображения по сравнению с другими флуорофорами.
Достоверность полученных результатов подтверждается
воспроизводимостью экспериментальных результатов, а также
согласованностью данных, полученных различными методами.
Результаты работы докладывались и обсуждались на международных конференциях:
-
Ivan Volkov, Fluorescence Properties of Silver Nanoclusters in DNA solution / Ivan Volkov, Alexey Kononov, Ruslan Ramazanov, Nina Kasyanenko // Quantitative Imaging and Spectroscopy in Neuroscience (QISIN), September 16-19, 2012, Saint-Petersburg, Russia, P. 55–56.
-
Ivan Volkov, Study of the interaction of silver nanoparticles and Ag+ ions with DNA / Ivan Volkov, Mikhail Varshavskii, Alexey Kononov, Valeriy Rolich, Nina Kasyanenko // Biophysical Society 56th Annual Meeting, Can-Diego, California, USA, February 25 – 29, 2012.
По результатам данной работы опубликовано 2 статьи в рецензируемых научных журналах и 2 тезисов докладов.
Личный вклад автора заключается в непосредственном проведении всех экспериментов (кроме исследований образцов методами электронной микроскопии и измерения кинетики люминесценции, которые были выполнены на оборудовании ресурсных центров СПбГУ), в обработке и анализе полученных данных, участии в обсуждении результатов, подготовке публикаций по теме диссертации и написании работы.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и содержит 134 страницы, 76 рисунков и 4 таблицы, список использованных источников включает 131 наименование.
Кластеры в водных растворах. Полимер-стабилизированные кластеры
В отличие от полупроводниковых квантовых точек, имеющих сравнительно большие размеры (десятки нанометров) и потенциально токсичных для живых организмов, люминесцирующие кластеры благородных металлов являются перспективными флуорофорами для использования в качестве меток для биоимиджинга. Они имеют ряд положительных свойств, главные из которых - малый размер (менее нанометра) и хорошие флуоресцентные показатели: большое сечение поглощения и высокий квантовый выход [1]. Однако применение кластеров в качестве флуоресцентных зондов требует получения и сохранения стабильности таких структур в водно-солевых растворах. Для этой цели были предложены различные методы синтеза, предусматривающие инкапсуляцию кластеров в различные стабилизирующие агенты, такие, как дендримеры [19], полимеры, гели. В качестве стабилизирующих агентов могут быть использованы: амфифильный блок сополимер полистирола c полиметакриловой кислотой [20], полиметакриловая кислота [21], сверхразветвленный полиэтиленимин [18]. Характерной особенностью таких полимеров является наличие в их составе атомов кислорода в виде карбоксильной группы или атомов азота. Ввиду сродства серебра к донорам электронов предполагается, что именно эти группы являются местами связывания кластера с полимерной матрицей [1].
Особое место среди полимер-стабилизированных нанокластреров занимают кластеры, стабилизированные биополимерами: пептидами, белками и ДНК. Создание люминесцирующих структур на основе биологических молекул представляется особенно перспективным, так как такие системы потенциально могут иметь хорошую биосовместимость, а также специфичность взаимодействия с биологическими структурами. Синтез, как правило, проводится в водных растворах методом химического либо фотовосстановления серебра на целевых молекулах. Предполагается, что в этом случае возможными местами посадки кластеров благородных металлов являются атомы кислорода, азота и серы [2]. Возможность синтеза нанокластеров серебра и золота была продемонстрирована на бычьем сывороточном альбумине (БСА) [22]. Серебро восстанавливалось с помощью боргидрида натрия. Было показано, что в этом случае кластеры серебра состоят из 2-8 атомов, связанных с атомом серы. Такие кластеры люминесцируют, главным образом, в диапазоне длин волн 600-800 нм, имеют небольшой квантовый выход (1,46%) и время жизни люминесценции порядка 1 нс. Флуоресцентные кластеры могут быть также сформированы на коротких полипептидах. В работе [23] люминесцирующий кластер был синтезирован на полипептидной цепи из 15 аминокислотных остатков KECDKKECDKKECDK. Авторы предполагают, что наличие в последовательности остатков цистеина, лизина, глутаминовой и аспарагиновой кислот создает условия для формирования хелатного комплекса с серебром. Получившиеся серебряные кластеры имели умеренную химическую стабильность при комнатной температуре в фосфатном буфере и деградировали через 3 дня, предположительно, при взаимодействии с ионами хлора и растворенным в воде кислородом. Однако введение в полипептид нескольких гидрофобных аминокислот (HDCHLHLHDCHLHLHCDH или HDCNKDKHDCNKDKHDCN) увеличило время стабильности сформированных кластеров до 5 недель. Такие кластеры проявляли люминесценцию с максимумом испускания 610-630 нм, MALDI-масс-спектрометрия показала наличие комплексов Ag2-5 с молекулой полипептида. Следовательно, физико-химические свойства последовательности полипептидной цепи, являющейся основой для образования кластера, сильно влияют на стабильность синтезируемых кластеров.
Среди прочих полимер-стабилизированных люминесцентных нанокластеров особо стоит выделить кластеры, синтезируемые на ДНК. Такие кластеры имеют малую токсичность [24], хорошую биосовместимость [24], высокий квантовый выход и большое сечение поглощения [24]. Кроме этого, такие кластеры обладают рядом уникальных свойств, благодаря которым в настоящее время они вызывают обширный научный интерес, а именно: существенная зависимость спектральных свойств кластера от первичной структуры ДНК, на которой происходит их синтез. Люминесцентные свойства комплексов серебра с ДНК были замечены Диксоном и др. в 2004 году. В их публикации описываются спектральные свойства люминесцентных структур, полученных восстановлением ионов серебра с помощью NaBH4 на однонитевом фрагменте ДНК из 12 оснований 5-AGGTCGCCGCCC-3 [25].
Переходя к рассмотрению детальных аспектов синтеза и свойств нанокластеров на ДНК, обратимся к известным данным о взаимодействии ионов Ag+ с ДНК, так как образование комплекса ДНК-Ag+ является первым этапом при синтезе кластеров. Связывание низкомолекулярных однозарядных ионов с молекулой ДНК хорошо изучено, достаточно полно этот вопрос освещен в книге Зенгера [26]. Взаимодействие ионов серебра существенно отличается от взаимодействия других однозарядных ионов с ДНК. Причиной этого является особенность химического строения серебра. Ион Ag+ имеет вакантную s-орбиталь, поэтому, как и ионы других переходных металлов, он склонен образовывать координационную связь с атомами азота и кислорода, принимая их неподелённую электронную пару.
Связывание ионов серебра с ДНК и ее компонентами подробно рассматривалось в работах 60-80-х годов 20 в. В них исследовалось взаимодействие Ag+ с тимусной ДНК [27-29], синтетическими полинуклеотидами [27, 28] и с компонентами ДНК (нуклеотидами и нуклеозидами и азотистыми основаниями) [30]. На основании совокупности экспериментальных данных можно сформулировать следующие основные выводы, которые на сегодняшний день считаются общепризнанными в литературе.
Связывание Ag+ с ДНК происходит преимущественно по азотистым основаниям. В пользу это утверждения свидетельствуют данные инфракрасной спектроскопии, исключающие связывание по фосфатным группам [29]; смещение максимума спектра поглощения ДНК (рис. 1.4), отражающее возмущение электронной структуры оснований [27]; связывание ионов серебра с ДНК в растворе высокой ионной силы (0,1М NaCIO4) [27]. Ионы Ag+ имеют большее сродство к денатурированной, нежели к нативной ДНК [27], что можно объяснить большей доступностью для Ag+ в денатурированной ДНК атомов азота, задействованных в нативной ДНК в образовании водородных связей. Связывание Ag+ с двуспиральной ДНК приводит к образованию нескольких типов комплексов, различающихся константой связывания. Пусть отношение молярных концентраций реагентов, находящихся в растворе r = СAg+(М)/СДНК(Мосн.), при этом rb = СAg+ (связ)(М) /СДНК(Мосн.) – отношение молярных концентрация связанного серебра и ДНК. a. Для малых концентраций серебра (0 rb 0,2), согласно работам [27, 28], реализуется сильное связывание с образованием комплекса типа I – с атомами N7 гуанина (и, возможно, аденина). Связывания с цитозином и тимином не происходит. Этот вывод можно считать обоснованным, так как он был в дальнейшем подтверждён методом инфракрасной спектроскопии [29]. b. После заполнения всех возможных мест связывания, характерных для комплекса типа I, реализуется более слабое связывание (комплекс типа II, 0,2 rb 0,5). Согласно работам [27, 28], считается, что в этом случае атом серебра встраивается на место протона в водородной связи между атомами A(N1) и T(N3), а также G(N1) и C(N3), образуя комплекс N–Ag+–N , что сопровождается высвобождением протонов [27, 28].
Нелинейная флуоресцентная спектроскопия насыщения
Пикосекундные импульсные измерения. В качестве источника возбуждения использовался титан-сапфировый 800 нм фемтосекундный лазер (Synergy 20) с усилителем (Pulsar, Amplitude Technologies), дающим на выходе импульсы с длительностью 50 фемтосекунд с частотой следования 10Гц и энергией 10 мДж. Лазерный луч был направлен в оптический параметрический усилитель (TOPAS-C, Light Conversion ), на выходе которого импульсы имели энергию около 100 мкДж на длине волны 530 нм. Длина импульса была увеличена до 1пс чтобы уменьшить плотность потока фотонов, что, в свою очередь, позволило избежать эффекта вынужденного испускания. Размер пучка, падающего на образец, составлял 2,5 мм, что определялось установленной диафрагмой. Флуоресцентный сигнал регистрировался с помощью портативного спектрометра (Ocean Optics) под прямым углом к направлению падающего пучка.
Наносекундные импульсные измерения. Для наносекундных измерений использовали вторую гармонику твердотельного Nd:YAG импульсного лазера с модуляцией добротности (Quantel) со следующими параметрами: длина волны излучения 532 нм, длина импульса 10 нс, частота следования 10 Гц, энергия в импульсе 100 мДж. Пучок, падающий на образец, был ограничен диафрагмой с диаметром 5 мм. Флуоресцентный сигнал регистрировался с помощью портативного спектрометра (Ocean Optics) под прямым углом к направлению падающего пучка.
Измерения с непрерывным лазером. Для непрерывного возбуждения использовали лазер накачки фемтосекундного лазера с мощностью 1,5 Вт (Finesse, Laser Quantum) с длиной волны 532 нм. Выходящий из лазера пучок света был сфокусирован и проходил через диафрагму диаметром 2 мм, установленную перед образцом. Чтобы уменьшить выцветание образца возбуждение производилось в течение коротких промежутков времени 0.3 с. Интегральный флуоресцентный сигнал детектировался фотодиодом, соединенным с цифровым осциллографом (LeCroy).
Во всех случаях образец находился в 1см кварцевой кювете. Интенсивность возбуждения варьировалась с помощью нейтральных фильтров, помещаемых перед образцом, и измерялась с помощью пироэлектрического измерителя мощности (Gentec-EO). Чтобы избежать попадания рассеянного света в приемник, использовали отрезающий фильтр. Раствор постоянно перемешивался во время измерений, и измеряемая интенсивность сигнала была скорректирована на выцветание. Степень выцветания определялась из измерения интенсивности стационарной флуоресценции и составила не более 10% в случае наносекундных измерений, 5% в случае пикосекундных измерений и 2% в случае измерений с непрерывным лазером. Результаты измерений корректировались на степень выцветания. Электронная микроскопия. Образцы исследовались методами просвечивающей (ПЭМ), просвечивающей растровой (ПРЭМ) и растровой (РЭМ) микроскопии на оборудовании междисциплинарного ресурсного центра СПбГУ по направлению «Нанотехнологии» (nano.spbu.ru) сотрудниками ресурсного центра. РЭМ исследования были выполнены на растровом электронном микроскопе Carl Zeiss Merlin. Ускоряющее напряжение составляло 10кВ, изображение образца было получено путем регистрации вторичных электронов. ПРЭМ и ПЭМ исследования были выполнены на просвечивающем электронном микроскопе Carl Zeiss Libra 200FE с ускоряющим напряжением 200кВ. Для всех исследований в качестве подложки образца использовали углеродную пленку, нанесенную на медную сетку (стандартная подложка для просвечивающей микроскопии). Для уменьшения толщины пленки и придания ей гидрофильности подложка была протравлена в кислородной плазме (5% кислорода и 95% аргона). Время обработки было выбрано оптимальным для получения наиболее тонкой подложки (см. главу 3). Образец с компактными ДНК-полимерными глобулами на поверхности был приготовлен следующим образом. Капля раствора, содержащего глобулы ДНК, была нанесена на подготовленную подложку и оставлена на некоторое время до полного испарения растворителя. Для получения образца с ориентированными жгутами ДНК применялся метод, разработанный ранее для фиксации ДНК на поверхность кремния [74]. Капля раствора, содержащего комплексы Ag-ДНК, была нанесена на поверхность образца. Через 1 минуту образец был промыт направленным потоком чистой воды. Этот образец сначала был исследован методом РЭМ, затем необходимый участок образца исследовался ПЭМ. Сканирующая конфокальная флуоресцентная микроскопия. Образец для исследования методами флуоресцентной конфокальной и зондово-усиленной микроскопии был приготовлен следующим образом. Капля раствора, содержащая флуоресцирующие ДНК-полимерные глобулы, была помещена на свежесколотую поверхность высоко ориентированного пиролитического графита (ВОПГ), которая вращалась на лабораторном спинкоатере.
Визуализация одиночных флуоресцирующих частиц была выполнена на комплексе люминесцентной и рамановской микроспектрометрии ИНТЕГРА Спектра (НТ-МДТ, Россия) (Ресурсный центр СПбГУ «Диагностика функциональных материалов для медицины, фармакологии и наноэлектроники», dfm.spbu.ru). Комплекс представляет собой зондовый микроскоп (СТМ, АСМ) комбинированный со сканирующим флуоресцентным конфокальным микроскопом прямой конфигурации (засветка и сбор сигнала сверху). Схема прибора показана на рис. 2.2. В качестве источника возбуждающего света использовали гелий-неоновый лазер с длинной волны 633 нм (Research-Electro-Optics, 35 mW). Падающий на образец свет ослаблялся нейтральным фильтром 2.0 ед. для предотвращения фоторазрушения образца. В используемой конфигурации прибора излучаемый и отраженный от поверхности свет собирается объективом M Plan Apo 100x (Mitutoyo 0.7 NA), находящимся над образцом. Он проходит через дихроичное зеркало, нотч-фильтр и длинноволновый фильтр для подавления рассеянного света. В работе с исследуемым образцом диаметр конфокальной диафрагмы составлял 150 мкм, дифракционная решетка в составе монохроматора имела 150 штрихов/мм. Сигнал, разложенный в спектр, фиксировался с помощью ПЗС матрицы, охлажденной до -60C (AndoriVac DR 324B_FI). Время накопления сигнала (около 0,5 с/пиксель) было выбрано таким образом, чтобы получить удовлетворительное соотношение сигнал/шум. Изображение обрабатывалось в программе Nova Px 2.0, поставляемой изготовителем. В процессе обработки производилось сглаживание (антиалиасинг) изображения по трем пикселям с помощью алгоритма библиотеки DirectX 9, встроенного в видеоадаптер компьютера. Спектры отдельных светящихся ДНК-полимерных глобул сглаживались по 60 точкам (эквивалентно спектральной ширине 18 нм) методом скользящего среднего в программе MagicPlot Pro 2.5 (Magicplot Systems, LLC).
Характеристика систем методами электронной микроскопии
Комплексы ДНК-Ag0, синтезированные в оптимальных условиях, были охарактеризованы методами электронной микроскопии. Целью исследования было выявление возможности прямого наблюдения полученных люминесцирующих кластеров, а также выяснение вопроса о взаимодействии ДНК с наночастицами, которые могут присутствовать в растворе и проявляться в спектрах поглощения в диапазоне 350-500 нм.
Наилучшее пространственное разрешение и наибольший контраст металла дает техника просвечивающей микроскопии. В качестве подложек для образцов использовали углеродную пленку, расположенную на медной сетке (стандартная подложка для просвечивающей микроскопии). Ввиду малого количества атомов серебра, исследуемые структуры дают очень слабый контраст на углеродных подложках. Следовательно, первым этапом стало определение минимального размера серебряного объекта, который можно достоверно визуализировать. Для увеличения контраста была применена методика травления подложки. Эта методика позволяет контролируемо уменьшать ее толщину, тем самым уменьшая уровень фона изображения, что в свою очередь приводит к увеличению контраста от изучаемых объектов. Для исследования был приготовлен образец с нанесённой на подложку и высушенной каплей раствора комплекса ДНК-Ag0. Использовали раствор, приготовленный при оптимальных условиях через сутки после добавления восстановителя. Данный образец затем подвергали обработке в кислородной плазме (5% O2 + 95% Ar) в течение 30, 60, 80 и 110 секунд суммарного времени. После этого его исследовали методом просвечивающей микроскопии. В процессе травления органические (углеродсодержащие) компоненты образца сгорают, в то время как металлические частицы не подвергаются разрушающему воздействию. Наилучшие результаты были получены при обработке в течение 110 секунд. При этом подложка стала максимально тонкой, а в некоторых местах и вовсе разрушилась (рис. 3.7 (а)). Видно, что образец действительно содержит частицы размером от нескольких до нескольких десятков нанометров, присутствие которых в системе может объяснить наблюдаемые спектры поглощения. Анализ изображений показал (рис. 3.7 (б, в)), что уверенно различимые на подложке частицы имеют размер не менее 1 нм. Частицы меньше этого размера, по-видимому, дают слишком слабый контраст и не могут быть различимы, в то время как разрешающая способность данного прибора составляет доли ангстрема.
Наблюдаемые металлические частицы размером (1±0.2) нм, в предположении их сферической формы, содержат несколько десятков атомов, что близко к размерам искомых люминесцирующих объектов. Действительно, согласно различным литературным данным, в состав комплексов олигонуклеотидов с люминесцирующими кластерами входит до 10 [51, 52], а в некоторых случаях до 20 [97] атомов серебра. К сожалению, способ приготовления образцов не позволяет удалить не связанные с ДНК частицы. Таким образом, мы не можем достоверно утверждать, что наблюдаемые на рис. 3.7 серебряные частицы локализованы на ДНК и являются искомыми люминесцирующими кластерами. Как было указано выше, в системе могут присутствовать и так называемые темновые кластеры. Еще раз подчеркнем, что разделить их в рамках наших экспериментов мы не можем.
Как видно из рисунка 3.7, исследуемые образцы содержат и частицы серебра нанометрового диапазона. Для определения их локализации относительно молекулы ДНК был приготовлен следующий образец. Стандартная подложка для электронной микроскопии была предварительно обработана необходимое время в кислородной плазме, что позволило сделать ее максимально тонкой для наилучшего контраста. Из раствора ДНК-Ag на подложку были высажены жгуты ДНК по методике, описанной в работе [98] (см. также стр. 50). Выбранное место образца, приготовленного таким образом, исследовалось поочередно в растровом и просвечивающем микроскопах. Такая комбинация методик была необходима ввиду того, что сама ДНК дает очень слабый контраст в просвечивающем микроскопе («тонкая» органическая молекула на «толстой» органической подложке), однако данный микроскоп позволяет получить наилучший контраст для серебряных частиц. В противоположность этому, растровая микроскопия в режиме регистрации вторичных электронов позволяет получить удовлетворительный контраст от жгутов ДНК, имея при этом худшее разрешение.
Известно, что наночастицы металла, в частности, серебра, могут усиливать (до 101-103 раз), либо ослаблять люминесценцию находящихся на определенном расстоянии от них молекул [81]. Поэтому резонным является вопрос о возможном влиянии присутствующих в растворе наночастиц на люминесценцию кластеров. Нужно учесть, что эффективность усиления люминесценции сильно зависит от взаимного расположения флуорофора и частицы, типичные расстояния для проявления таких эффектов 10 – 100 [81]. Именно поэтому эффекты усиления флуоресценции наблюдаются только на подложках с контролируемой толщиной прослойки между частицами и флуоресцирующими молекулами [81], либо при прикреплении флуорофоров к частицам в растворе на линкере определённой длины [99]. Таким образом, при столь малой плотности наночастиц на ДНК ожидать эффектов усиления люминесценции кластеров и ДНК за счёт присутствия наночастиц не приходится. На рис. 3.9 представлены спектры люминесценции ДНК при возбуждении на длине волны 260 нм. Видно, что спектры люминесценции свободной ДНК, комплекса ДНК-Ag+ и Кластеры, синтезированные на денатурированной ДНК. В литературе содержатся данные о формировании люминесцирующих ДНК-стабилизированных кластеров серебра, синтезированных главным образом на одноцепочечных фрагментах ДНК [24]. Исключение составляют лишь случаи синтеза на специальных конструкциях (квадруплексах), например, на цитозиновом i-мотиве [90, 100] или G-квадруплексе [100]. В работе [51] было рассмотрено использование двухцепочечного олигонуклеотида. В этом случае люминесценция кластеров была в 20 раз слабее, чем на соответствующем одноцепочечном олигонуклеотиде. Авторы объясняли этот результат тем, что формирование водородных связей между основаниями мешает образованию кластеров. В связи с этим интересно сравнить результат синтеза кластеров с использованием нативной тимусной ДНК и ее денатурированной формы. Напомним, что N3 атом цитозина и гетероцикличекие N атомы в пуриновых основаниях гуанина и аденина рассматриваются как наиболее вероятные позиции связывания кластера на одноцепочечных ДНК [42, 101]. Методом EXAFS спектроскопии было показано присутствие Ag-N/O связывания с использованием таких образцов ДНК [102]. Результаты теоретического расчета, полученные в нашей лаборатории, показывают, что карбонильные группы цитозинов также могут быть сайтами связывания люминесцирующих кластеров [70].
В случае двуспиральной тимусной ДНК значительная часть из перечисленных выше позиций задействована в образовании водородных связей. Известно, что при денатурации (плавлении) ДНК N1 атомы пуринов и N3 атомы пиримидинов, а также карбонильные группы цитозина, участвующие в образовании водородных связей в двойной спирали ДНК, становятся доступными для связывания ионов серебра. Был проведен следующий эксперимент. Кластеры синтезировались на денатурированной (расплавленной) и нативной ДНК той же концентрации. На рис. 3.10 представлены спектры испускания двух образцов, записанные через различное время после начала реакции. Очевидно (рис. 3.10), для обоих случаев наблюдаются сходные изменения спектра со временем. Вначале происходит образование кластеров «красной» группы, которые со временем трансформируются в кластеры «желтой» группы. Главное отличие заключается в кинетике изменений спектра. На начальном этапе интенсивность люминесценции быстрее возрастает для денатурированной ДНК. После 3 часов, когда изменения спектра примерно сравнимы, для денатурированной ДНК наблюдается более медленная кинетика, хотя тенденция трансформации кластеров из «красных» в «желтые» в целом сохраняется. Кроме того, для образца с денатурированной ДНК наблюдается бльшая доля коротковолновых кластеров на каждом временном этапе в сравнении с образцом нативной ДНК. Эти коротковолновые кластеры также проявляют себя в спектрах возбуждения в виде полосы либо плеча на 470 нм (рис. 3.11).
ДНК-полимерная глобула, включающая флуоресцирующие кластеры серебра
К уникальным свойствам ДНК следует отнести способность к формированию в растворе наноразмерных структур путем самоорганизации. Например, при взаимодействии молекул ДНК с поликатионами в растворе образуются дискретные ДНК-полимерные глобулы размерами 100-200 нанометров. Такие структуры, имеющие хорошую биосовместимость, используются как генные векторы [39]. Подобная методика компактизации ДНК может быть использована и для создания флуоресцирующих глобул. Первым этапом на пути создания люминесцирующей глобулы, включающей кластеры серебра, является проверка возможности конденсации комплекса кластер-ДНК и исследование свойств получившихся структур. В этом отношении высокомолекулярная тимусная ДНК является подходящим и хорошо изученным объектом для подобного рода исследований [88].
Для формирования ДНК-полимерной глобулы, содержащей люминесцирующие кластеры серебра, использовали комплекс ДНК-Ag, полученный в условиях, разработанных ранее (глава 2). В качестве конденсирующего агента для компактизации ДНК использовали полиаллиламин (М = 15000 Да). Используемые концентрации реагентов были выбраны таким образом, чтобы получить устойчивый во времени раствор полностью сконденсированных частиц. Для оценки изменений третичной структуры ДНК при компактизации системы исследовали методами электронной микроскопии, динамического светорассеяния и гель-электрофореза. Для конденсации использовали ДНК с кластерами, полученными при добавлении KMnO4. Эта методика не приводит к заметным изменениям третичной структуры ДНК. На рис. 4.1 (б) показано распределение по размерам конденсированных ДНК-частиц, содержащих и не содержащих кластеры серебра, полученное методом динамического светорассеяния при угле рассеяния 90о. Эти распределения унимодальны. Гидродинамический радиус частиц совпадает (120 ±50) нм. Таким образом, кластеры не влияют на размер сформировавшейся глобулы ДНК. Для сравнения на рис. 4.1 (а) также приведены распределения по размерам, полученные из корреляционных функций интенсивности, измеренных при 90о для ДНК в 0,005 M NaNO3, комплексов ДНК-Ag+ и ДНК-Ag в тех же условиях. Отсутствие свободной (не сконденсированной) ДНК в растворе, содержащем глобулы, было проверено методом гель-электрофореза. На рис 4.2 показаны фотография геля после миграции ДНК и комплекса ДНК-Ag в свободной и компактной формах (1 и 3 дорожки). Эксперимент также проводили через 2 часа после формирования кластеров с использованием KMnO4 (присутствие кластеров проверялось по наличию флюоресценции). Компактизованная ДНК (дорожки 2 и 4) не видна в геле, как это обычно и наблюдается при формировании генных векторов. То, что ДНК в свободной форме также не наблюдается в геле, согласуется с данными метода ДРС и указывает на то, что все молекулы ДНК находятся в компактной форме.
Сформированные компактные структуры были визуализированы на сканирующем просвечивающем электронном микроскопе. На рис. 4.2 показано изображение ДНК-полимерных глобул с кластерами серебра, размер которых составляет 100+/-40 нм (рис. 4.2 (а), врезка). На рис. 4.2 (б) показан фрагмент образца, центральная область которого была просканирована ранее. Видно, что глобулы частично разрушились под действием электронного пучка и контраст от них существенно уменьшился. Что касается люминесцентных свойств кластеров, «запакованных» в ДНК-полимерные глобулы, они практически не отличаются от свойств кластеров, стабилизированных свободной ДНК. На рис. 4.3 представлены спектры испускания растворов ДНК с кластерами до и после конденсации. Люминесцентный сигнал после конденсации ДНК сохраняется на 60%, форма спектра меняется незначительно. Степень поляризации люминесценции P0,45 говорит о том, что изучаемые «желтые» кластеры по-прежнему связаны с ДНК. Этот комплекс не разрушается при конденсации ДНК, хотя последняя претерпевает достаточно сильные структурные изменения. Это выгодно отличает кластеры от интеркалирующих ДНК-красителей, которые покидают свои места связывания в процессе конденсации ДНК [129]. Информация о локализации кластеров в сформированной конденсированной глобулярной структуре может быть получена из зависимости степени тушения флуоресценции кластеров от концентрации тушителя. Для этой цели использовался метилвиологен, - классический тушитель флуоресценции, механизм действия которого связан с процессом фотоиндуцированного переноса электрона с возбужденной молекулы флуорофора на молекулу метилвиологена. Считается, что метилвиологен взаимодействует с ДНК предпочтительно по малой бороздке [130, 131]. В качестве сравнения тот же эксперимент был проведен с раствором свободной ДНК, содержащей кластеры. На рис. 4.4 (а) представлена зависимость интенсивности люминесценции от концентрации тушителя в растворе.
Исследование флуоресцирующих глобул методами сканирующей флуоресцентной микроскопии. Люминесцирующие глобулы, сформированные на основе ДНК-полимерного комплекса, включающего кластеры серебра, были исследованы методом сканирующей флуоресцентной микроскопии. Данные структуры сохраняют свои спектральные свойства при высаживании на поверхность графита. На рис. 4.6 (а) показано изображение святящихся глобул, полученное на конфокальном сканирующем микроскопе. Возбуждение производилось лазером с длиной волны 633 нм. Изображение показывает пространственное распределение интегральной интенсивности люминесценции в диапазоне длин волн 640 – 720 нм. Можно видеть отдельные святящиеся области размером от 0,5 до 1 мкм, которые, вероятно, представляют собой либо отдельные, либо близко расположенные частицы, которые невозможно разрешить ввиду ограниченной разрешающей способности конфокального микроскопа (около 500 нм). На рис. 4.6 (б) показаны спектры испускания, зарегистрированные из отдельных областей поверхности образца. Отметим, что полученные спектры практически совпадают со спектром испускания глобул в растворе. Последнее говорит о том, что наблюдаемая люминесценция на подложке действительно однозначно соответствуют кластерам, локализованным на компактных структурах.
