Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1 Функциональные полимерные микросферы в биотехнологии. Основные подходы к синтезу 11
1.1.1. Полимерные суспензии с альдегидными группами на поверхности частиц 12
1.1.2. Полимерные суспензии с хлорметильными группами на поверхности частиц 1.1.3.Полимерные суспензии с эпоксидными группами на поверхности частиц 15
1.1.4.Полимерные суспензии с карбоксильными группами на поверхности частиц 18
1.1.5. Полимерные суспензии с амидными группами на поверхности Частиц 19
1.1.6. Полимерные суспензии с аминогруппами на поверхности частиц 20
1.2. Активация функциональных групп на поверхности частиц полимерной суспензии 21
1.3 Принципы модификации полимерных микросфер полупроводниковыми флуоресцентными нанокристаллами 30
Глава 2. Экспериментальная часть 45
2.1 Исходные реагенты 45
2.2 Методы исследования 46
2.2.1. Измерение межфазного натяжения на границе раздела фаз методом Вильгельми 46
2.2.2 Дилатометрический метод исследования кинетики полимеризации 47
2.2.3 Определение размеров частиц полимерных суспензий методом электронной сканирующей микроскопии 48
2.2.4 Определение размеров частиц и дзета-потенциала методом фотонной корреляционной спектроскопии
2.2.5 Определение молекулярных масс полимеров методом вискозиметрии 50
2.2.6 Определение сухого остатка полимерных суспензий 51
2.2.7 Определение концентрации аминогрупп на поверхности частиц 51
2.2.8 Определение концентрации карбоксильных групп на поверхности полимерных частиц 52
2.2.9 Определение концентрации эпоксидных групп на поверхности полимерных частиц 53
2.2.10 Определение агрегативной устойчивости полимерных частиц 54
2.2.11 Определение краевого угла смачивания 55
2.2.12 Постановка реакции пассивной геммаглютинации (РПГА) и реакции пассивной латексной агглютинации 55
Глава 3. Результаты и их обсуждение 58
3.1 Полимеризация стирола в присутствии функциональных кремнийорганических ПАВ 58
3.2.Дисперсионная полимеризация 81
3.2.1 Дисперсионная полимеризация стирола 81
3.2.1.1Влияние объёмного соотношения мономер/растворитель наконечный диаметр полистирольных частиц 83
3.2.1.2. Влияние температурного профиля на процесс полимеризации и свойства конечной дисперсии 87
3.2.2. Дисперсионная полимеризация глицидилметакрилата 94
3.3..Затравочная полимеризация 102
3.3.1. Затравочная полимеризация глицидилметакрилата 102
3.3.2. Анализ наличия функциональных групп
3.4. Затравочная полимеризация стирола 109
3.5. Модификация поверхности полимерных микросфер флуоресцентными нанокристаллами (КТ) 112
3.6. Выбор полистирольных микросфер для разработки диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации 116
3.7. Разработка нового типа частиц - носителей с развитой поверхностью 125
Выводы 133
Список литературы
- Полимерные суспензии с хлорметильными группами на поверхности частиц
- Дилатометрический метод исследования кинетики полимеризации
- Дисперсионная полимеризация стирола
- Выбор полистирольных микросфер для разработки диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации
Полимерные суспензии с хлорметильными группами на поверхности частиц
Полимеризацию проводят в водном растворе в темноте при комнатной температуре обычно при концентрации акролеина 10%об. В качестве стабилизатора частиц применяют полиэтиленоксид. Этим способом были получены полиакролеиновые микросферы с диаметрами от 0,01 до 0,2 мкм и коэффициентом вариации менее 10 %. [63] При у - инициированой радикальной полимеризация акролеина процесс проводили в водном растворе смеси ионогенного (лаурилсульфата натрия) и неионного (полиэтиленоксид) ПАВ при дозе обучение 0,4 Мрад и комнатной температуре в течение 4 часов. Были получены полиакролеиновые микросферы широкого спектра размеров: от 0,01-0,02 до 5 мкм. Однако стабильные и монодисперсные микросферы удалось получить лишь при концентрации мономера не выше 15% масс[64]. Полиакролеиновые суспензии с размерами частиц от 0,04 до 8 микрон и коэффициентом вариации менее 10% авторам [56] удалось получить осадительной гомополимеризацией акролеина в щелочной среде (рН 11) при постепенном введении раствора щелочи в водный раствор акролеина только в присутствии специально синтезированного эмульгатора - продукта взаимодействия олигомеров полиглутарового альдегида с бисульфитом натрия.
Было установлено что размер, РЧР, концентрация альдегидных групп на поверхности и т.д. существенно зависят от условий полимеризации, вследствие чего процесс является плохо воспроизводимым. О плохой воспроизводимости процессов осадительной полимеризация акролеина также сообщается в работах [61]. Кроме того, отмечается, что в частицах полиакролеиновых суспензий всегда содержится некоторое количество олигомерного продукта, наличие которого обусловлено особенностями механизма осадительной полимеризации. Вследствие этого, с течением времени такие олигомерные продукты могут диффундировать из объема частиц на их поверхность, что приводит к заметному изменению свойств микросфер в процессе хранения. Эти недостатки были устранены при синтезе полиакролеиновых суспензии в щелочной среде в присутствии радикальных инициаторов[65-69] в результате дополнительного сшивания олигомеров акролеина радикальным инициатором.
Более высокой стабильностью чем полиакролеиновые суспензии, обладали полистирол-акролеиновые и полиметилметакрилат-акролеиновыесуспензии, полученные безэмульгаторной сополимеризацией акролеина с этими мономерами, инициированной персульфатом калия при температуре 55оС в атмосфере азота. Устойчивые полистирольные и полиметилметакрилатметакриловые частицы одинакового размера были синтезированы методом пострадиационной привитой полимеризации акролеина из газовой фазы [64].
В качестве ПАВ применяли оксиэтилированный полипропиленгликоль (F-68), растворимый в воде, и ди-п-толил-о-карбалкоксифенилкарбинол (ДТК), растворимый в мономерной фазе. Инициирование процесса полимеризации во всех случаях осуществляли персульфатом калия (ПК). Полимеризацию мономеров проводили до полной конверсии, время полимеризации составляло 24 часа. Частицы полимерных суспензий были устойчивы при хранении и физиологическом растворе, имели узкое распределение по размерам и диаметры 0,2 и 0,45 мкм соответственно [64].
Анализ ИК-спектров показал, что Количество свободных и связанных -СНО групп в полиакролеине определяется условиями его синтеза.Так, для микросфер полученных ионной полимеризацией акролеина, содержание альдегидных групп в полимере составляет 2,9 ммоль альдегида/г микросфер, в то время как для микросфер, полученных радикальной полимеризацией акролеина, например, под действием радикальный окислительно-восстановительной системы, содержание альдегидных групп равно 12,0ммоль/г микросфер.
Полимерные суспензии с альдегидными группами на поверхности получают методом дисперсионной полимеризации глутарового альдегида [38,61,62] и формилстирола в водно-этанольной среде с использованием в качестве инициатора ДАК [71,73] и стабилизатора - поливинилбензойной кислоты. Полимеризацию проводят в течение 24 часов при температуре 70С. Полученные частицы, в зависимости от концентрации мономера имели диаметр 0,5 - 2,0 мкм, коэффициент вариации 8-10% и концентрацию альдегидных групп на поверхности частиц 0,1-0,2 мкмоль/г.
Получают такие полимерные суспензии осадительной и затравочной полимеризацией является является их высокая токсичность. Наиболее удобным способом синтеза полимерных суспензий с хлорметильными группами на поверхности оказалась затравочная сополимеризация хлорметил стирола со стиролом. Затравочные полистирольные частицы с диаметром около 2мкм обычно получают дисперсионной полимеризацией стирола инициированной ДАК (1 моль/л) в водно-этанольной среде при объемном соотношении равном 1:4 соответственно, в присутствии полиакриловой кислоты в качестве стабилизатора. Затем набухали частицы затравочной суспензии мономерами и проводили полимеризацию в течение 24 часов при 70С. В процессе хранения полихлорметильных суспензий имел место частичный гидролиз реакционноспособных хлорметильных групп, что приводило к изменению свойств полимерной суспензии. В работе [55]приведены данные по использованию стирол-хлорметильных сополимерных суспензий в иммуноанализе.хлорметилстирола и хлорметилакрилата. Общим серьезным недостатком этих мономеров
Синтез полимерных суспензий с эпоксидными группами на поверхности частиц Полимерные суспензии, частицы которых содержат на поверхности эпоксидные группы, получают, в основном, безэмульгаторной сополимеризацией стирола с глицидилметакрилатом [44-48]. В процессе синтеза стирол глицидилметакрилатных сополимерных суспензий часть эпоксидных групп на поверхности частиц теряется вследствие гидролиза. Однако, несмотря на это, их концентрация на поверхности частиц остается достаточной для ковалентного связывания с биолигандами и обеспечения их необходимой концентрации. Эпоксидные группы часто подвергают дальнейшей модификации как с целью получения более стабильных групп на поверхности частиц, так и для введения дополнительной спейсерной группировки.
Вследствие высокой реакционой способности эпоксидных групп они способны принимать участие в различных реакциях полимераналогичных превращений [40]. Так, подвергая гидролизу эпоксидные группы на поверхности частиц суспензии при рН=2 и температуре 50С, получают частицы с гликолевыми группами, которые затем легко превращаются в альдегидные под действием йодной кислоты:
Дилатометрический метод исследования кинетики полимеризации
В целях обеспечения эффективного использования КТ для детектирования иммунологических реакций во внутреннем обьеме живых клеток авторами [120] предложена конструкция композиционных субмикронных частиц на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 100-400 кДа. Использование гидрофильного полимера в качестве носителя КТ, позволяет избежать потери агрегативной устойчивости полимерной частицы, с одной стороны, с другой стороны, минимизировать иммунологический ответ живой клетки на проникающий в ее внутренний обьем постороннего обьекта . Содействовать внутриклеточному транспорту КТ способны и липидные липосомы, но в этом случае не удается избежать цитотоксические проблемы, вызванные появлением свободных ионов тяжелых металлов, образующихся при выщелачивании КТ и повышение вероятности образования свободных радикалов, катализируемого КТ. Все эти процессы оказывают негативное воздействие на функционирование живых клеток. Использование ПЭГ в качестве полимерного носителя позволяет повысить биосовместимость используемых композиционных частиц путем химической и физической модификации их поверхности при иммобилизации на ней биолигандов (липидов, полиуглеводов). Использование в качестве биолигандов закрепленных на поверхности макроглобулы ПЭГ иммуноглобулинов позволяет осуществить специфическое связывание созданных полимерных частиц с раковыми клетками.
В работе [121] предложен оригинальный способ иммобилизации КТ в субмикронных частицах. Этот метод основан на высокой гелеобразующей способности олигомерных пептидов, например, состава L-Phe-L-Phe. Проводя синтез дисперсных гелевых частиц по методу замены растворителя возможно получить гелевые частицы содержащие КТ и характеризующиеся высокой биосовместимостью. При этом, высокая концентрация функциональных групп аминокислотных звеньев в обьеме частице, препятствует выщелациванию из них ионов тяжелых металлов.
Использование КТ , имеющих высокую локальную концентрацию при их иммобилизации в обьеме полимерных частиц, позволяет простыми оптическими методами обнаруживать места локализации в организме поврежденных болезнью областей, рис 1.3.6. Безусловно, это становится возможным при использование полимерных микросфер с закрепленным на их поверхности иммуноглобулинами.
В работе [122] создаваемая полимерная частица на основе полилактидов рассматривается в качестве платформы для иммобилизации КТ, выполняющих различные функции: иммобилизация на поверхности иммуноглобулинов специфических для рассматриваемого типа повреждений (характеризующих переход здоровой ткани в поврежденную) структуры клетки, биоразлагаемый контейнер для адресной доставки в клетку нанодисперсных гидрофобных или водорастворимых лекарственных препаратов (доксорубицина и фолиевой кислоты); иммобилизацию супермагнитных наночастиц оксида железа (III), обеспечивающих управление движением полимерной частицы в организме благодаря наложенному внешнему магнитному полю; иммобилизация полупроводниковых наночастиц, выполняющих роль контрастных агентов, например, CdSe/ZnS в целях обеспечения контроля за движением и локализацией полимерных частиц. Только благодаря применению полимерной матрицы возможно создание субмикронного обьекта, выполняющего этот комплекс функций, рис. 1.3.7. Такой подход к использованию полимерных частиц открывает возможность развития методов терапии социально значимых заболеваний таких, как, например, раковых заболеваний.
В работе [123] систематизированы возможности по использованию субмикронных полимерных микросфер в качестве носителей нанодисперсных материалов, выполняющих диагностические и терапевтические функции в процессе терапии раковых заболеваний на клеточном уровне, рис Немалое внимание в разработке таких композиционных полимерных частиц уделяется вопросам токсичности полученного обьекта. Безусловно, это относится к выбору материала полимерной платформы (матрицы), но также рассматривается возможность ингибирования процесса высвобождения ионов тяжелых металлов из наночастиц в присутствие полимерного материала. Рис. 1.3.8. Схема возможного набора функций, выполняемого полимерными субмикронными частицами, являющихся носителем различных нанодисперсных материалов.
Таким образом, проведенный анализ литературных данных показал, что вопрос использования полимерных микросфер в качестве носителя КТ является актуальным развитием современных методов диагностики и клеточной терапии большого числа заболеваний человека и животных, включая различные формы раковых патологий. Иммобилизация КТ в полимерной матрице возможно осуществить различными способами. Эти способы, прежде всего, различаются последовательностью выполнения реакций синтеза КТ и полимера. Наименее перспективным способом получения композиционного полимерного материала является процесс синтеза КТ в среде мономера или в растворе полимера. Такое замечание связано с тем, что для получения высокоэффективных КТ нужно обеспечить выполнение строгих требований, предъявляемых к растворителю (среде) в котором проводится синтез КТ. По мнению большинства исследователей, для выполнения поставленной задачи целесообразно использовать КТ, синтезированные в стандартных условиях. С точки зрения получения полимерного материала, возможен широкий выбор вариантов. Во-первых, КТ можно вводить в мономерную фазу, а затем, проводить процесс полимеризации. Во-вторых, можно брать раствор готового полимера или олигомера, с последующим формированием дисперсной системы, например, методом замены растворителя. В-третьих, получая в стандартных условиях полимерные частицы микронного или субмикронного размера иммобилизировать на их поверхности КТ, полученные, так же, в стандартных условиях.
Рассмотрев все возможные пути синтеза композиционных полимерных частиц, содержащих КТ, выбор был остановлен на последнем способе. Использование стандартых высокоэффективных методов синтеза КТ и полимерных частиц с заданными характеристиками (размер, устойчивость и химический состав) в значительной мере облегчает выполнение задачи по получению модифицированных полимерных микросфер целевого назначения, например, для визуализации результатов иммунологических реакций. Исходя из этого, был сделан выбор полимерного носителя - полистирольные микросферы, КТ - сульфид кадмия, метод иммобилизации КТ на поверхности полимерных частиц - модифицированный метод затравочной полимеризации.
Дисперсионная полимеризация стирола
Снижение температуры полимеризации приводит к увеличению диаметров полистирольных микросфер от 0,5 мкм (при 80С) до 0,65 мкм (при 60С). Энергия активации Еа составила 25,6 ккал/моль. Микрофотографии частиц и гистограммы распределения их по размерам приведены на рис. 3.1.15. lOO so n Э40 s20 о і 3
Микрофотографии полистирольных частиц и гистограммы распределения их по размерам, полученные в присутствии КС(СООН) при различных температурах синтеза: 1) 60С, 2) 70С, 3) 80С. По результатам, полученным в данной работе и литературным данным, приведенным выше, был предложен следующий механизм протекания полимеризации. В начальный момент исходная система состоит из раствора кремнийорганического ПАВ в мономере и водной фазы, содержащей растворенный в ней инициатор. Образование эмульсии происходит при диспергировании углеводородной фазы в водной при одновременном инициировании полимеризации. При этом образуется высоко дисперсная система, микрокапли которой становятся основным источником ПМЧ. Так как все элементарные реакции полимеризации протекают в зоне адсорбционных слоев ПМЧ, то естественно предположить, что распределение образующегося полимера неоднородно по объему, и большая его часть в начальный момент времени сосредоточена вблизи поверхности ПМЧ. Образование полимера приводит к вытеснению молекул кремнийорганического ПАВ из объема к поверхности раздела ПМЧ/водная фаза и образованию ПМЧ со структурой ядро-оболочка.
На межфазной границе кремнийорганический ПАВ формирует жидкокристаллическую пленку, лиофилизирующую границу раздела фаз и обладающую реологическими свойствами, необходимыми для реализации структурно-механического барьера по Ребиндеру.
Полученные результаты позволили разработать рецептуру синтеза функциональных полимерных микросфер с диаметрами в интервале от 0,4 до 1,1мкм. 3.2. Дисперсионная полимеризация мономеров.
Дисперсионную полимеризацию стирола и глицидилметакрилата (ГМА) проводили в спиртовой среде с использованием ДАК в качестве инициатора, диоктилсульфосукцината натрия (АОТ) и поли-М-винилпирролидона (40000КДа) в качестве стабилизаторов. На рисунке 3.2.1.1. приведена общая схема проведения полимеризации.
После растворения мономера температура поднимается до 67оС согласно температурному профилю со скоростью и удерживается при этом значении 1 час. При этом необходимо тщательно следить за моментом и температурой нуклеации. При нуклеации прозрачная гомогенная реакционная смесь начинает опалесцировать и со временем становится молочно-белой вследствие образования полимерной фазы. С момента нуклеации, течение полимеризации зависит от температурного профиля проведения процесса. Варьируя количество стационарных температурных точек, можно в значительной степени влиять на дисперсный состав конечной дисперсии.
Исследования были начаты с изучения молекулярной массы образующегося полимера. Полученные данные приведены на рисунке 3.2.1.2. Зависимость молекулярной массы полученного полимера от природы растворителя
Из графика, представленного выше, отчётливо видно, что наибольшего значения молекулярная масса образующегося полимера достигает в среде трет бутилового спирта, в то время как для ряда метанол-этанол наблюдается монотонная зависимость. Это объясняется тем, что трет-бутанол, по сравнению с метанолом, этанолом и изопропанолом, является плохим передатчиком цепи.
Исследования проводились в пределах концентраций мономера от 20 до 40% (объёмных). Вне данного диапазона проведение полимеризации нецелесообразно по нескольким причинам: При концентрации мономера 20% A) При проведении полимеризации мономеров в метаноле и этаноле, образующиеся частицы имели недостаточный размер даже при проведении процесса до глубоких степеней конверсии. Б) При проведении полимеризации в изопропаноле и трет-бутаноле значения показателя полидисперсности полученных дисперсий не удовлетворяли требованиям, предъявляемым к микросферам для дальнейшего их использования. B) Проведение полимеризации мономеров при низком содержании мономера нецелесообразно и по экономическим причинам, т.к. существует необходимость в высоком выходе продукта. При концентрации мономера 40% А) При проведении полимеризации мономеров в метаноле и этаноле наблюдалось значительное увеличение полидисперсности. Б) При проведении полимеризации мономеров в изопропаноле и трет-бутаноле при превышении 40% концентрации мономера наблюдалась вторичная нуклеация частиц на поздних стадиях процесса. Это приводило к бимодальному распределению частиц по размерам. На рис. 3.2.1.1.1 - 3.2.1.1.4. представлены зависимости среднего диаметра полимерной дисперсии от объёмной концентрации мономера в реакционной системе для каждого растворителя, применяемого в исследовании. Рис.3.2.1.1.1.3ависимость среднего диаметра микросфер от объёмной концентрации мономера при проведении полимеризации в среде метанола Таким образом, эффективным диапазоном концентраций мономера является интервал от 20 до 40% объёмных. В этом интервале концентраций мономера были получены полимерные суспензии с диаметрами частиц от 1 до 5мк, использованные в дальнейшем в качестве затравочных при синтезе частиц большего размера.
Выбор полистирольных микросфер для разработки диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации
Для создания диагностических тест-систем были использованы полистирольные суспензии, синтезированные методом затравочной полимеризации в присутствии функциональных кремнийорганических ПАВ, что позволило получить полистирольные микросферы, содержащие в поверхностном слое аминогруппы - АГ (КО) (рис. 3.6.1.), карбоксигруппы - КГ(КО) (рис. 3.6.2.) и эпоксигруппы - ЭГ(КО) (рис. 3.6.3.).
Гистограммы распределения частиц по размерам приведены на рисунках 3.6.1В, 3.6.2.В и 3.6.3В. Видно, что полистирольные микросферы имели средний диаметр 5 мкм и узкое распределение частиц по размерам. При анализе полимерных суспензий в световом микроскопе было обнаружено, что полистирольные микросферы агрегируют в фосфатно-солевом буферном растворе. Анализ углов смачивания, результаты которого приведены на рисунках 18Б, 19Б и 20Б, показал, что поверхность полистирольных микросфер в значительной степени гидрофобна, угол смачивания 90. Характеристики полистирольных суспензий, полученных в присутствии кремнийорганических ПАВ, содержащих амино-, карбокси- и эпоксигруппы, приведены в таблице 3.6.1.
Существенно понизить агрегацию полимерных микросфер удалось путем гидрофилизации их поверхности полимерным ПАВ (поливиниловым спиртом) и увеличением концентрации аминогрупп на поверхности частиц при хлорметилировании и последующем аминировании поверхности полимерных микросфер. Микрофотографии полученных полимерных частиц и гистограммы распределения их по размерам, а также результаты определения углов смачивания и дзета-потенциала приведены на рисунках 3.6.4 и 3.6.5.
Полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации в присутствии кремнийорганического ПАВ, содержащего карбоксильные группы: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал
Полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации в присутствии смеси аминосодержащего кремнийорганического ПАВ и полимерного ПАВ: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал
Видно, что полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации в присутствии аминосодержащего кремнийорганического ПАВ, находятся в агрегированном состоянии. Доля полимерных микросфер, входящих в состав агрегатов, состоящих более, чем из 3 частиц, превышает 75%, а доля полимерных микросфер, находящихся в индивидуальном состоянии, составляет 12,3%. При повышении агрегативной устойчивости частиц, путём гидрофилизации поверхности полимерных микросфер, полученных методом затравочной полимеризации, путём хлорметилирования и аминирования, полимерные суспензии характеризовались отсутствием агрегатов (0,0%) и высокой долей частиц, находящихся в индивидуальном состоянии (82,8%). В таблице 3.6.2. приведены характеристики полученных полистирольных суспензий.
Был предложен принципиально новый подход к созданию частиц полимерного носителя, позволяющий увеличить как удельную поверхность, так и скорость их седиментации. Суть данного подхода заключалась в получении композиционных полимерных частиц путем формирования на поверхности полимерных микросфер большого диаметра оболочку из полимерных частиц малого диаметра за счет ковалентного связывания функциональных групп, содержащихся в их поверхностном слое (рис. 3.7.1.).
Для этого были использованы полимерные частицы двух размеров. Первые - со средним диаметром 5 мкм - были получены методом затравочной полимеризации стирола в присутствии функциональных кремнийорганических ПАВ и содержали в поверхностном слое амино-, карбокси- и эпоксигруппы. Несмотря на это их поверхность была гидрофобна (угол смачивания 120), по-видимому, из-за экранирования функциональных групп в надмолекулярных структурах, образованных ПАВ в поверхностном слое частиц. Полимерные микросферы были устойчивы в воде, но агрегировали в буферных растворах высокой ионной силы.
Вторые частицы - со средним диаметром 0,4 - 0,7 мкм (рис. 3.7.2. - 3.7.4.) - были синтезированы методом гетерофазной полимеризации стирола в присутствии тех же функциональных кремнийорганических ПАВ. В этом случае поверхность частиц была гидрофильной (угол смачивания 50) (таблица 14), что, видимо, объясняется иным механизмом формирования поверхностного слоя и образования надмолекулярных структур ПАВ, в которых функциональные группы не экранированы.