Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время синтетические полиэлектролиты находят все большее применение в различных областях медицины и биологии. Это заставляет обратиться к исследованию их поведения в биологическом окружении и, в первую очередь, к изучению механизмов их взаимодействия с клетками и модельными системами, среди которых широкое распространение получили бислойные липидные мембраны (БЛМ). Известно, что клетки несут суммарный отрицательный поверхностный заряд. Поэтому наибольший интерес вызывает исследование взаимодействия отрицательно заряженных БЛМ с поликатионами.
Показано (Galla and Sackmann, 1975, Biochimica et Biophysica Acta, 401, 509-529; Hartrnann and Galla, 1978, Biochimica et Biophysica Acta, 509, 474-490; Carrier et al., 1935, Biochimica et Biophysica Acta, 820, 131-139), что адсорбция синтетических поликатионов на отрицательно заряженных БЛМ может сопровождаться увеличением температуры фазового перехода липидного бислоя, латеральной сегрегацией и трансбислойной миграцией липидов, а также увеличением проницаемости мембраны по отношению к неорганическим ионам. Полученные результаты представляют интерес с точки зрения прогнозирования возможных последствий контакта поликатионов с клеточной поверхностью.
Вместе с тем известно, что клеточная мембрана наряду с липидами содержит большее количество (до 60 вес.%) разнообразных по составу и свойствам белков. Адсорбция поликатионов на поверхности клеток может влиять на функционирование мембранных белков и, в частности, тех, которые ответственны за ионный транспорт. Ионные каналы играют существенную роль в жизнедеятельности клеток. Функционирование ионных каналов лежит в основе выполнения клетками важнейших биологических функций, таких как проведение нервного возбуждения, мышечное сокращение, зрительная рецепция, гормональная регуляция. Несмотря на очевидную важность этого вопроса, к настоящему времени известно ограниченное число работ, посвященных исследованию влияния поликатионов на свойства ионных каналов. Имеющаяся информация носит описательный и отрывочный характер, что не позволяет сделать выводы о механизме воздействия поликатионов на функционирование ионных каналов.
Цель работы состояла в изучении влияния катионного полипептида поли-L-лизина на функционирование встроенных в БЛМ природных каналообразующих пептидов грамицидинового ряда. В работе исследованы:
влияние полилиэина на интегральную проводимость БЛМ, индуцированную нейтральным грамицидином D (rpD) и отрицательно заряженным О-пиромеллитилграмицидином(Пгр);
влияние полилизина на кинетику фотоинактивации Пгр каналов в БЛМ;
реакции конкурентного взаимодействия, протекающие в тройной системе полилизин — грамицидин — БЛМ.
Научная новизна. Исследовано взаимодействие катионного полипептида поли-L-лизина с БЛМ, содержащими встроенные молекулы нейтрального rpD или отрицательно заряженного Пгр. Показано, что полилизин не влияет на кинетику фотоинактивации rpD, но оказывает существенное влияние на кинетику фотоинактивации Пгр: добавление возрастающих концентраций полилизина приводит вначале к росту, а потом уменьшению характерного времени фотоинактивации (ХВФ) Пгр. Уменьшение эффективности электростатического взаимодействия полилизина с молекулами Пгр, например, в результате увеличения ионной силы раствора, введения отрицательно заряженных липидов в мембрану и проч., уменьшают эффективность взаимодействия полилизина с молекулами Пгр и понижают влияние лолилизина на кинетику фотоинактивации Пгр каналов. Предложен механизм взаимодействия полилизина с Пгр-содержащей БЛМ. Адсорбция полилизина на БЛМ сопровождается фазовым разделением в мембране и образованием Пгр доменов. Резкое ограничение подвижности молекул Пгр в доменах является причиной стабилизации проводящего состояния Пгр при низких и промежуточных концентрациях полилизина. Дальнейшая адсорбция полилизина приводит к изменению конформации адсорбированных макромолекул, разрыхлению доменов и уменьшению ХВФ.
При низких и высоких концентрациях полилизина кинетика фотоинактивации Пгр адекватно описывается моноэкспоненциальной зависимостью. При промежуточных концентрациях полилизина кинетика фотоинактивации описывается суммой двух экспонент. Быстрая кинетика соответствует инактивации мономерной формы Пгр, медленная — инактивации доменной формы Пгр.
Практическая значимость работы. Полученные результаты имеют принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия синтетических поликатионов и биологически активных веществ на их основе с клеточной мембраной, а также могут служить основой создания биосенсоров и датчиков для определения биологически активных веществ.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на 42 Ежегодном Съезде Американского Биофизического Общества, Канзас-Сити, США, 1998, Международной Конференции Студентов и Аспирантов "Ломоносов-98", Москва, 1998, 15 Европейской Конференции по химии поверхности Иерусалим, Израиль, 1998, II Всероссийском Биофизическом Съезде, Москва, 1999, XIII Международном биофизическом Конгрессе, Нью-Дели, Индия, 1999 и международной конференции "Lipid and Surfactant Dispersed Systems", Москва, 1999.
Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на iXi страницах машинописного текста и включает Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Обсуждение результатов, Выводы и Список цитируемой литературы из 45^ ссылок. В работе содержится рисунков.