Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 7
2.1. Использование полимеров в качестве компонентов лекарственных препаратов 7
2.1.1. Синтетические полимеры как наполнители и материалы для создания препаратов пролонгированного действия 8
2.1.1.1. Иммобилизация лекарств на полимерных носителях 8
2.1.1.2. Получение полиэлектролитных нанокапсул 10
2.1.1.3. Полимерные липосомы 11
2.1.2. Полимеры в конструкциях для направленной доставки лекарств. 14
2.1.3. Полимерные конструкции для направленной доставки доксорубицина. 17
2.1.4. Избирательность, достигаемая введением между лекарством и носителем лабильной развязки, чувствительной к действию определенных протеаз 21
2.1.5. Полимеры как биологически активные вещества. Влияние полимеров на клеточные функции 22
2.1.5.1. Противоопухолевая активность сополимеров на основе малеинового ангидрида 22
2.1.5.2. Блок-сополимеры алкиленоксидов как вещества, влияющие на проницаемость биологических мембран 23
2.2. Взаимодействие полиэлектролитов с противоположно заряженными соединениями 24
2.2.1. Комплексы полиэлектролит-ПАВ. 24
2.2.1.1. Движущие силы комплексообразования полиэлектролитов и ПАВ 25
2.2.1.2. Растворимость комплексов полиэлектролит-ПАВ 26
2.2.1.3. Ассоциация молекул ПАВ на полимерной матрице 27
2.2.1.4. Образование комплексов полиэлектролит - ПАВ в присутствии низкомолекулярного электролита 29
2.2.1.5. Влияние гидрофобности полимера на устойчивость комплексов полиэлектролит-ПАВ 30
2.2.2. Комплексы полиэлектролитов с противоположно заряженными красителями. 32
2.3. Влияние полимеров на структуру и проницаемость мембран 36
2.3.1. Проницаемость биологических мембран 36
2.3.2. Факторы, влияющие па проницаемость липидного бислоя 38
2.3.3. Взаимодействие полианиопов с липосомальными мембранами. 40
2.3.4. Взаимодействие поликатионов с отрицательно заряженными липосомами 43
2.3.4.1. Изменение температуры фазового перехода 43
2.3.4.2. Встраивание поликатионов в липидный бислой 44
2.3.4.3. Изменение проницаемости липидного бислоя 46
2.3.4.4. Латеральная сегрегация в липидном бислое 47
2.3.4.5. Индуцированный поликатионом флип-флоп 48
2.3.4.6. Агрегация липосом 49
2.3.4.7. Слияние липосом 49
2.3.4.8. Разрушение липосом 50
3. Постановка задачи 52
4. Экспериментальная часть 54
4.1. Материалы 54
4.2. Методы 55
4.2.1. Спектральные методы 55
4.2.2. Определение концентрации Доке в растворе 55
4.2.3. Определение концентрации ПАК в растворе 55
4.2.4. Определение степени ионизации ПАК в зависимости отрН. 56
4.2.5. Изучение комплексообразования Доке и ПАК методом центрифугирования 57
4.2.6. Комплексообразование Доке с полиакриловой кислотой в присутствии низкомолекулярной соли. 57
4.2.7. Определение количества связанного с ПАК Доке в зависимости отрН раствора. 58
4.2.8. Определение количества несвязанных компонентов комплекса ПАК-Докс методом ультрафильтрации. 58
4.2.9. Получение малых моноламеллярных липосом 59
4.2.9.1. Получение малых безградиентных липосом 59
4.2.9.2. Получение малых градиентных липосом 59
4.2.10. Метод резонансного переноса энергии 60
4.2.11. Изучение взаимодействия комплексов ПАК-Докс с липосомальной мембраной методом ультрафильтрации. 60
4.2.12. Исследование кинетики проникновения доксорубицина через липосомалъную мембрану. 61
4.2.13. Модификация полиакриловой кислоты алифатическими спиртами 61
4.2.14. Определение критической концентрации мицеллообразования растворов этерифицированных полиакриловых кислот 63
4.2.15. Определение степени модификации ПАК алифатическими спиртами. 63
4.2.16. Электрофорез в полиакриламидном геле 63
4.2.17. Получение больших моноламеллярных липосом 64
5. Влияние полианионов на скорость транспорта доксорубицина через липидную мембрану 65
5.1. Комплексообразование полиакриловой кислоты с доксорубщином 65
5.1.1.1. Условия формирования комплексов 65
5.1.1.2. Определение состава комплекса 71
5.1.1.3. Устойчивость комплексов ПАК-Докс 75
5.1.1.4. Модификация полиакриловой кислоты алифатическими спиртами 78
5.1.2. Взаимодействие комплексов ПАК-Докс с малыми электронейтральными липосомами 81
5.1.2.1. Образование тройных комплексов «ПАК-Докс-Мембрана» 81
5.1.2.2. Изменение структуры комплексов при их взаимодействии с мембранами малых липосом 83
5.1.2.3. Влияние комплексов на проницаемость липосомальных мембран по отношению к малым ионам 87
5.1.2.4. Изменение состава комплексов ПАК-Докс при их взаимодействии с рН-градиентными липосомами 89
5.1.2.5. Исследование скорости мембранного транспорта доксорубицина, включенного в состав комплексов с гидрофобными полианионами 98
5.1.2.6. Комплексообразования ПАК-Докс в присутствии БСА 100
5.1.2.7. Взаимодействие комплексов ПАК-Докс с отрицательно заряэюенными рН- градиентными липосомами при физиологической ионной силе и в присутствии белка 103
5.2. Влияние поликатионов на проникновение доксорубицина через липидный бислой 105
5.2.1. Влияние полилизина на проницаемость мембран больших отрицательно заряженных липосом 106
Выводы 111
- Взаимодействие полиэлектролитов с противоположно заряженными соединениями
- Взаимодействие поликатионов с отрицательно заряженными липосомами
- Комплексообразование Доке с полиакриловой кислотой в присутствии низкомолекулярной соли.
- Влияние поликатионов на проникновение доксорубицина через липидный бислой
Введение к работе
Контролируемая доставка лекарственных препаратов в пораженные клетки является одной из ключевых проблем современной фармакологии. Известно, что эффективное использование в фармакологической практике накопленного к настоящему времени арсенала лекарственных соединений в значительной мере ограничивается побочными эффектами, вызываемыми лекарственными соединениями в организме [1-2]. Использование подходов контролируемой доставки позволяет снижать неблагоприятные эффекты химиотерапевтических средств и увеличивать их биодоступность, благодаря чему усиливается фармакологическое действие лекарств [3].
В течение последних 30 лет появилось множество работ, посвященных использованию синтетических и природных полиэлектролитов в качестве средств, способствующих контролируемой доставке биологически активных соединений. Показано, что комплексообразование лекарств с полиэлектролитами позволяет существенно улучшать их фармакологическое действие и увеличить время их циркуляции в кровотоке.
Доксорубицин (синоним - адриамицин) является одним из наиболее широко используемым противоопухолевым антибиотиком, относящимся к классу антрациклинов [4]. Его противоопухолевый эффект обусловлен встраиванием в двойную спираль ДНК, что приводит к образованию двухцепочечных разрывов в молекулах ДНК и гибели клетки. Доксорубицин представляет собой катионную молекулу, которая, помимо ДНК, способна взаимодействовать с другими компонентами клетки. Поэтому изменение проницаемости липидной мембраны по отношению к доксорубицину представляет собой важную с практической точки зрения задачу. Для решения этой задачи предложено использовать синтетические полимеры, способные возмущать биологические мембраны, увеличивая их проницаемость по отношению к доксорубицину [4-5].
С другой стороны, доксорубицин способен накапливаться не только в пораженных клетках, но и в других клетках организма, поэтому значительные усилия направлены на разработку подходов, позволяющих увеличить избирательность действия антибиотика и увеличить время его циркуляции в кровотоке (биодоступность). Один из таких подходов состоит в получении электростатических комплексов доксорубицина с полианионами. [6]
Несмотря на значительные успехи в этой области, ряд вопросов остается неисследованным. В частности неизвестно, способны ли комплексы полианионов с доксорубицином взаимодействовать с липидными мембранами? Неисследованным также остается вопрос о влиянии размеров липидных везикул на характер их взаимодествия с полиэлектролитами.
В настоящей работе мы исследовали влияние полиэлектролитов на способность доксорубицина проникать через мембраны липидных бислойных везикул (липосом). В первой части работы было исследовано влияние полианионов на скорость проникновения доксорубицина через липосомальные мембраны, и изучены перестройки в составе комплексов, происходящие при их взаимодействии с липосомами. Во второй части работы было исследовано влияние катионного полипептида полилизина на проникновение доксорубицина через липосомальные мембраны.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Взаимодействие полиэлектролитов с противоположно заряженными соединениями
В последнее время все возрастающее число исследований направлено на изучение систем, содержащих полимеры и противоположно заряженные органические вещества. Это связано с тем, что такие системы находят применение в биологии и областях, связанных с защитой окружающей среды. Наибольшее внимание в литературе уделяется комплексам полимеров с амфифильными молекулами. Такие комплексы могут быть стабилизированы не только взаимодействием полимера с низкомолекулярным соединением, но и взаимодействием малых молекул между собой. Полиэлектролитные комплексы (ПЭК) полимеров и ПАВ могут быть как стехиометричными, так и нестехиометричными. В случае стехиометричных полиэлектролитных комплексов на каждый заряд полиэлектролита приходится один заряд молекулы ПАВ, при этом все заряды полииона образуют ионные связи с ПАВ. В случае нестехиометричных полиэлектролитных комплексов (НПЭК) не все ионные связи полимера задействованы в образовании комплекса [84]. Движущей силой комплексообразования полиэлектролитов и ПАВ является ряд взаимодействий [84]: 1. Гидрофобные взаимодействия между полимером и молекулами ПАВ (такие взаимодействия особенно важны для блок-сополимеров с гидрофобными сегментами или гидрофобно модифицированных полимеров) 2. Гидрофобные взаимодействия между молекулами ПАВ 3. Гидрофобные взаимодействия между молекулами полимера 4. Электростатические взаимодействия между молекулами полимера 5. Электростатические взаимодействия между полимером и молекулами ПАВ 6. Электростатические взаимодействия между молекулами ПАВ Отталкивание заряженных частей молекул ПАВ является крайне неблагоприятным фактором для мицеллообразования, однако взаимодействие ПАВ с зарядами полииона (нейтрализация) нивелирует эффект электростатического отталкивания и способствует самоагрегации молекул ПАВ. Взаимодействие полиэлектролитов с противоположно заряженными ПАВ носит ярко выраженный кооперативный характер. Кооперативность выражается в том, что изотерма связывания ПАВ имеет S-образный вид: при повышении концентрации ПАВ вплоть до критической концентрации ассоциации (ЮСА) комплексов не образуется, а при повышении концентрации ПАВ в растворе выше ККА ПАВ количественно связывается с полимером. Резкое усиление связывания ионогенного ПАВ с противоположно заряженным полиэлектролитом объясняется стабилизацией комплексов за счет взаимодействия молекул ПАВ друг с другом. Вследствие кооперативного связывания молекул ПАВ с полиэлектролитом концентрация свободного ПАВ в растворе очень мала, поэтому изучение таких систем с помощью большинства обычных методов становится недоступным. Развитие методов, связанных с использованием ПАВ-чувствительных электродов в подавляющем большинстве случаев решает эту проблему.
С помощью этого метода Kwak с сотрудниками систематически исследовали большое количество систем, содержащих катионные ПАВ и анионные полимеры синтетического и природного происхождения. Очень часто связывание катионного ПАВ с полианионом наступает при концентрации меньшей, чем критическая концентрация мицелообразования (ККМ) в растворе, не содержащем полимер. Это связано с тем, что агрегация ПАВ в таких системах является кооперативной, что указывает на вклад гидрофобных взаимодействий молекул ПАВ, адсорбированных на полимере, и образование мицеллоподобных кластеров. Основной же причиной кооперативного связывания является электростатическая стабилизация мицелл ПАВ [85]. 2.2.1.2. Растворимость комплексов полиэлектролит-ПАВ Способность ПЭК растворяться в воде определяется соотношением ионогенных групп Z ПАВ и полиэлектролита. Если Z=l , то при доведении степени превращения до значения, близкого к единице, в системе образуются стехиометричные комплексы полимера и ПАВ нерастворимые в воде. Водорастворимые ПЭК могут быть получены из большинства полиэлектролитов и ПАВ, но при соблюдении определенных условий. Например, если Z=l, то растворимость может быть достигнута при степени превращения меньшей единицы, т.е. для продуктов незавершенной реакции. При этом свободные звенья полиэлектролита, не вступившие в реакцию, выполняют функцию лиофилизирующих (гидрофильных) фрагментов, способствуя удержанию частиц ПЭК в растворе. При степени превращения близкой к единице ПЭК растворимы в воде, если молярное соотношение звеньев ПАВ и полиэлектролита Z 1. частиц таких НПЭК можно рассматривать как своеобразные блок-сополимеры, содержащие гидрофильные сегменты полимера и гидрофобные участки связанного с полиэлектролитом ПАВ. Критическое значение Z определяет предельную степень заселенности цепей полиэлектролита молекулами ПАВ, выше которой гидрофильность сегментов цепи не связанных с ПАВ уже недостаточна для удержания частицы НПЭК в растворе [85]. 2.2.1.3. Ассоциация молекул ПАВ на полимерной матрице Характер взаимодействия полиэлектролита и ПАВ зависит от природы поверхностно-активного вещества. Известно, что ПАВ, содержащие менее 10 атомов углерода в алкильной цепи, не образуют агрегатов с полиэлектролитом. Это связано с недостаточно сильными гидрофобными взаимодействиями алкильных радикалов, что приводит к уменьшению кооперативного эффекта и недостаточному увеличению энтропии системы за счет высвобождения противоионов.
На примере гомологичных рядов алкилтриметиламмонийгалогенидов было показано, что ККА уменьшается с ростом длины алкильного радикала. \ogKKA = А- BnCHi =А- B AAGmpemca (4) Такой характер зависимости ККА от количества СНг-групп ПАВ свидетельствует о том, что именно гидрофобные взаимодействия между молекулами ПАВ играют ключевую роль в их взаимодействии с полимером [86]. В пользу этого свидетельствует также прямая пропорциональность между величинами ККМ и ККА: чем ярче выражена способность ПАВ к мицеллообразованию, тем прочнее его комплексы с противоположно заряженными полиэлектролитами [86]. Значительно меньше внимания в литературе было уделено влиянию природы противоиона ПАВ на образование ПЭК. В работе [87] было показано, что существует зависимость ККМ и ККА от радиуса противоиона ПАВ. Для этого авторы [87] использовали в качестве ПАВ децилтримеиламмонийгалогениды, а в качестве полианиона - сополимер малеинового ангидрида и бутилвинилового эфира.. Было обнаружено, что ККМ такого ПАВ была наибольшей в случае, когда в качестве противоиона выступал хлорид-ион. В то же время, ККА увеличивалась в ряду С1- Вг- 1-. Можно предположить, что такой характер влияния природы противоиона на взаимодействие ПАВ с полимером объясняется прочностью взаимодействия противоиона с заряженной группой ПАВ. За счет малых размеров и высокой степени гидратации хлорид-иона в водном растворе, его взаимодействие с аммониевой группой ПАВ затруднено, по сравнению с более крупными бромид- и йодид-анионами. Этим же можно объяснить более прочное взаимодействие хлоридов алкилтриметиламмония по сравнению с соответствующими бромидами и йодидами. Весьма важным фактором комплексообразования полимеров и ПАВ является природа полиэлектролита. Существенным параметром, влияющим на способность полимера связываться с ПАВ, является линейная плотность заряда, которая определяется средним расстоянием между зарядами полимерной цепи [88]. Линейную плотность заряда можно изменять различными способами: варьированием степени ионизации полиэлектролита за счет рН раствора, ковалентной модификацией ионогенных групп полииона и взаимодействием полимера с противоположно заряженными органическими соединениями [85, 89]. Исследования показывают, что ККА уменьшается с ростом плотности заряда [85, 89]. По всей видимости, это объясняется тем, что при росте линейной плотности заряда на полимере увеличивается кооперативность его взаимодействия с ПАВ, как за счет усиления электростатических взаимодействий, так и за счет сближения связанных с полимером молекул низкомолекулярного вещества.
Взаимодействие поликатионов с отрицательно заряженными липосомами
Адсорбция поликатионов на поверхности отрицательно заряженных липосом может сопровождаться изменением температуры фазового перехода липидного бислоя, встраиванием макромолекулы в липидную мембрану, увеличением ее проницаемости, появлением асимметрии в распределении липидов в пределах каждого монослоя и между слоями, а также агрегацией, слиянием и даже разрушением липосом. Ниже мы подробно остановимся на каждом из этих эффектов. 2.3.4.1. Изменение температуры фазового перехода Взаимодействие поликатионов с отрицательно заряженными липосомами приводит к значительному (иногда на 15-20С) возрастанию температуры фазового перехода липидного бислоя. Подобный эффект наблюдался, например, при адсорбции полилизина на поверхности липосом, приготовленных из фосфатидилглицерола [113-116] или фосфатидной кислоты [117-120]. Причина этого, скорее всего, заключается в том, что адсорбированные молекулы полилизина нейтрализуют (экранируют) заряд, создаваемый отрицательно заряженными липидами [121]. Известно, что энтальпия фазового перехода в липидном бислое определяется главным образом теплотой плавления гидрофобной области бислоя, образуемой алкильными хвостами липидных молекул [122]. Существенно, что энтальпия плавления бислоя с адсорбированным поликатионом практически равна таковой для свободного бислоя [116]. Это означает, что полилизин располагается на поверхности липосомальной мембраны и не заглубляется в ее гидрофобную часть. Если молекулы адсорбированного полилизина приобретают конформацию Р-структуры, они могут взаимодействовать с мембранами соседних липосом. При этом комплекс липосома-полилизин формирует "сэндвичевую" структуру, в которой молекулы полилизина оказываются помещенными между двумя липидными бислоями. Развитие этого процесса может приводить к появлению мультиламеллярных структур [116, 123]. Важно, что водородные связи между формирующими Р-структуру полипептидами не разрываются [123]. 2.3.4.2. Встраивание поликатионов в липидный бислой Добавление полилизина к отрицательно заряженному липидному монослою приводит к быстрому росту поверхностного давления в пленке, что свидетельствует о взаимодействии поликатиона с липидными молекулами. Состав межфазного комплекса поликатион-липид решающим образом определяется конформацией адсорбированного полипептида.
Последнее, в свою очередь, зависит от химического строения макромолекулы [124]. Если адсорбированный полипептид принимает конформацию Р-структуры, его молекулы располагаются преимущественно на границе раздела липид-вода. Это справедливо, например, для длинных молекул полилизина со степенью полимеризации в несколько сотен, которые, связываясь с отрицательно заряженными липосомами, образуют Р-структуру даже при высоких температурах [119]. Если же адсорбированный полипептид находится в виде а-спирали, процесс может сопровождаться встраиванием макромолекул в гидрофобную часть монослоя. При возрастании начального давления в липидной пленке встраивание полилизина ухудшается [125]. Увеличение концентрации добавляемого полилизина, наоборот, усиливает гидрофобные взаимодействия. Это приводит к возрастанию доли встроившихся в бислой макромолекул [ИЗ]. Следует отметить, что конформация адсорбированных поликатионов в значительной степени определяется фазовым состоянием липосомальной мембраны. Адсорбированный поликатион способен менять свою конформацию при изменении фазового состояния бислоя [126]. В работах [114, 127] показано, что высокая ионная сила препятствует связыванию полилизина с отрицательно заряженными липосомами, но не может разорвать уже сформированные комплексы. Этот результат подтверждает участие гидрофобных взаимодействий в стабилизации комплекса полилизина с липидной мембраной. При адсорбции гетерополипептидов на поверхности липосом гидрофобные а-спиральные участки полимеров ориентируются параллельно гидрофобным липосомным хвостам в бислое. Гидрофильные остатки полипептидов располагаются на поверхности мембраны вблизи гидрофильных липидных головок [128]. Полистиролсульфокислота также может встраиваться в гидрофобную область, сформированную липидными молекулами. Процесс сопровождается уменьшением подвижности метальных групп в алкильных радикалах липидных молекул [129]. При исследовании взаимодействия поликатионов с антибактериальной активностью, полиакрилатов и полиметакрилатов с боковыми бигуанидовыми цепями, было показано [140], что боковые гидрофобные гексаметиленовые группы поликатионов играют роль своеобразных клиньев, которые встраиваются в гидрофобную часть мембраны и тем самым увеличивают расстояние между молекулами липидов. Аналогичные наблюдения сделаны в работе [131]. Поли-И-изопропилакриламид, адсорбированный на липосомальной мембране при температуре выше фазового перехода, заглубляется в липидный бислой и заполняет образующиеся в нем пустоты. В работах [132-133] показано, что боковые цетильные радикалы, ковалентно связанные с основной цепью поликатиона, могут включаться в гидрофобную область липосомальной мембраны и повышать прочность комплекса поликатион-липосома. Модификация липосом амфифильными полимерами, несущими длинные алкильные группы, стабилизирует липидный бислой [134].
Гидрофобизация поликатиона боковыми алкильными фрагментами была использована для повышения аффинности ДНК к биологическим мембранам. Оказалось, что ДНК в комплексе с кватернизованным производным поли-4-винилпиридина, содержащим всего 4 мол.% боковых цетильных групп, способна взаимодействовать с отрицательно заряженными липосомами [135-137]. 2.3.4.3. Изменение проницаемости липидного бислоя Адсорбция полигистидина на поверхности отрицательно заряженных липосом влияет на плотность упаковки липидных молекул в бислое, что приводит к увеличению его проницаемости [138]. Аналогичный эффект вызывает адсорбция полилизина [139], а также полиаллиламина и разветвленного полиэтиленимина [140]. В двух последних случаях максимальное увеличение проницаемости наблюдалось при соотношении зарядов [поликатион]/[отрицательно заряженный липид] равном 1. Напротив, адсорбция предельно кватернизованных производных поли-4-винилпиридина на поверхности отрицательно заряженных липосом никак не сказывалась на проницаемости липидного бислоя [133,141]. В последние годы довольно большое внимание уделяется так называемым рН- чувствительным липосомам, которые рассматриваются как перспективные носители для направленного транспорта лекарственных веществ в орган-мишень. Для решения этой задачи в липосомальную мембрану обычно включают липиды, меняющие свою структуру и, соответственно, проницаемость липидного бислоя при небольшом изменении рН среды [142]. Показано, что добавление синтетического поликатиона к таким липосомам может приводить к дополнительному и довольно сильному изменению их проницаемости, причем в зависимости от состава липосом ПЭ способен либо увеличивать либо уменьшать их проницаемость [143]. Другой способ увеличения проницаемости липосом заключается в модификации мембраны отрицательно заряженным компонентом нелипидной природы. Взаимодействие поликатиона с такой мембраной, как правило, сопровождается увеличением проницаемости бислоя [141].
Адсорбция поликатионов на поверхности смешанных отрицательно заряженных жидких липосом обычно сопровождается латеральной сегрегацией в липидном бислое. В простейшем случае двухкомпонентных липосом с исходным равномерным распределением молекул обоих компонентов это приводит к формированию в бислое двух или более микрофаз (доменов) с различным содержанием нейтрального и отрицательно заряженного липидов. Такая реорганизация бислоя отмечалась при адсорбции полипептидов - полигистидина [138] и полилизина [120], а также синтетических поликатионов - полиаллиламина, полиэтиленимина [135] и поли-Ы-этил-4-винилпиридиний бромида [144]. Более того, к такому же эффекту приводила адсорбция пятизарядного катиона - полимиксина [145].
Комплексообразование Доке с полиакриловой кислотой в присутствии низкомолекулярной соли.
Готовили ряд растворов полиакриловой кислоты различной концентрации в 20 мМ HEPES (концентрацию ПАК варьировали от 0.25 мМ до 5 мМ). К этим растворам добавляли Доке до конечной концентрации 0.5 мМ, после чего их быстро перемешивали и термостатировали в течение 1 часа при 25С в термостате "Eppendorf (США). В течение часа во всех образцах выпадали красные осадки. Затем образцы центрифугировали в течение 5 мин при 14000 об/мин на центрифуге 5415 "Eppendorf (США) и определяли концентрацию Доке в супернатанте.
Влияние ионной силы на образование комплекса ПАК с Доке изучали с помощью флуоресцентной спектроскопии, измеряя тушение флуоресценции доксорубицина полиакриловой кислотой в присутствии NaCl. В кювету помещали, раствор полиакриловой кислоты в 20 мМ HEPES, рН=7.0 с конечной концентрацией 0.15 мМ и необходимое количество 4 М раствора NaCl. Конечная концентрация NaCl варьировалась в пределах от 0 до 0,8М. Затем добавляли Доке до конечной концентрации 50 цМ и измеряли интенсивность флуоресценции Доке. Растворы термостатировались при температуре 25С. Влияние рН на образование комплекса ПАК с Доке изучали с помощью флуоресцентной спектроскопии, измеряя тушение флуоресценции Доке полиакриловой кислотой. К раствору 20 мМ HEPES добавляли ПАК и Доке до конечной концентрации 0.15 мМ и 50 цМ соответственно. Измеряли рН раствора и интенсивность флуоресценции. рН раствора регулировали добавлением небольших количеств Трис. Раствор термостатировался при температуре 25С. 4.2.8. Определение количества несвязанных компонентов комплекса ПАК-Докс методом ультрафильтрации. Для отделения частиц комплекса от компонентов реакционной смеси использовался метод фильтрования комплексов через ПТМК фильтры для микроцентрифуги с диаметром пор 5 нм ("Millipore", США). Через фильтры с диаметром пор 5 нм могут свободно проникать несвязанные в комплекс Доке и ПАК, при этом частицы комплекса не проникают через поры фильтра. Для того, чтобы избежать неспецифического связывания Доке с материалом фильтров, последние были подвергнуты предварительному блокированию: 50 iM раствор Доке пропускали через фильтры до тех пор, пока концентрация Доке в фильтрате не становилась равной концентрации Доке исходного раствора. Аналогичным образом материал фильтров блокировался 50 цМ раствором ПАК. Малые моноламеллярные липосомы (80 нм в диаметре) были приготовлены из фосфатидилхолина по методике, предложенной Ярославовым А.А [149].
Аналогично были получены липосомы, содержащие 0.5% N-дансилфосфатидилэтаноламина. При получении липосом, содержащих встроенную в мембрану флуоресцентную метку, ее раствор в хлороформе добавляли к спиртовому раствору ФХ перед удалением органического растворителя. Из раствора фосфатидилхолина в этаноле с концентрацией 100 мг/мл удаляли органический растворитель на роторном испарителе "Rotavapor" фирмы "Buchi" (Швейцария) при 40 С. Образующуюся пленку липидов диспергировали в 1 мл 20 мМ HEPES, доведенноого Трис до рН 7.0. После этого суспензию обрабатывали ультразвуком частоты 22 кГц в течение 400 с (2 х 200 с) в непрерывном режиме при охлаждении водой на ультразвуковом диспергаторе 4710 "Cole-Parmer Instrument" (США). Полученные липосомы отделяли от титановой пыли на центрифуге "Beckman" в течение 6 мин при 11000 об/мин. 4.2.9.2. Получение малых градиентных липосом. Нейтральные рН-градиентные моноламеллярные липосомы из фосфатидилхолина и липосомы, содержащие 10% кардиолипина, с рН внешнего буфера 7.0 и внутреннего -4.0, были приготовлены по методике, описанной ранее в [149]. Из раствора фосфатидилхолина в этаноле с концентрацией 100 мг/мл удаляли органический растворитель на роторном испарителе "Rotavapor" фирмы "Buchi" (Швейцария) при 400 С. Образующуюся пленку липидов диспергировали в 1 мл 0,3 М цитратного буфера, доведенного Трис до рН 4. После этого суспензию обрабатывали ультразвуком частоты 22 кГц в течение 400 с (2 х 200 с) в непрерывном режиме при охлаждении водой на ультразвуковом диспергаторе 4710 "Cole-Parmer Instrument" (США). Полученные липосомы отделяли от титановой пыли на центрифуге "Beckman" в течение 6 мин при 11000 об/мин. Для смены внешнего буфера использовали гель-проникающую хроматографию на сефарозе CL-4B, используя в качестве элюента нейтральный буферный раствор (20 мМ HEPES, 0,45 М сахароза, рН 7). Разбавляли полученный раствор липосом внешним буфером до концентрации 1 мг/мл. 4.2.10. Метод резонансного переноса энергии. Метод резонансного переноса энергии использовали для изучения взаимодействия комплексов ПАК-Докс с липосомальной мембраной.
Для этого были получены липосомы, содержащие 0.5% N-дансилфосфатидилэтаноламина. N-дансилфосфатидилэтаноламин, включенный в состав мембраны, использовался в качестве донора энергии, а Доке - акцептора. N-дансилфосфатидилэтаноламин при длине волны возбуждения 350 нм имеет широкий спектр флуоресценции с максимумом 520 нм, который перекрывается со спектром поглощения Доке с максимумом 490 нм. К суспензии, содержащей 1 мг/мл дансил-меченых липосом, небольшими порциями добавляли Доке и раствор комплексов ПАК-Докс ([ПАК]/[Докс]=3) до конечной концентрации Доке 27.4 нМ и снимали спектр флуоресценции при длине волны возбуждения 350 нм. По изменению интенсивности флуоресценции на длинах волн 520 нм и 555 нм судили о степени взаимодействия свободного Доке и комплексов ПАК-Докс с липосомальной мембраной. 4.2.11. Изучение взаимодействия комплексов ПАК-Докс с липосомальной мембраной методом ультрафильтрации. Готовили серию образцов с одинаковой концентрацией частиц комплекса ПАК-Докс, к которым добавляли различное количество малых безградиентных липосом так, чтобы конечная концентрация ПАК и Доке была равной 150 цМ и 50 цМ соответственно. После достижения равновесия в системе образцы были пропущены через ПТМК фильтры диаметром пор 200 нм ("Millipore", США), после чего была определена концентрация Доке в фильтрате. 4.2.12. Исследование кинетики проникновения доксорубицина через липосомальную мембрану. В начальный момент времени к раствору, содержащему 50 цМ Доке и полимеров различной концентрации, добавляли раствор липосом до конечной концентрации 1 мг/мл и следили за изменением интенсивности флуоресценции Доке (А,„озб=490 нм, ХфЛ=555 нм) во времени. Температура образца в кюветном отделении составляла 25С [160]. 4.2.13. Модификация полиакриловой кислоты алифатическими спиртами. Для получения гидрофобно модифицированных ПАК 4,5 г полиакриловой кислоты (Мг=5000) растворяли в 180 мл абсолютного диоксана при 80С. Раствор разделили на порции, содержащие по 500 мг (6,94 ммоль звеньев). К растворам добавляли 900 мг (8,82 ммоль) гексанола, 1,3 г (6,99 ммоль) додеканола, 1 г (3,7 ммоль) октадеканола. Гексанол и додеканол растворялись в диоксане при комнатной температуре, а октадеканол - растворялся при нагревании. После растворения спиртов к растворам добавили Н Г-дициклогексилкарбодиимид, количество моль которого по отношению к звеньям соответствовало бы необходимой степени этерификации полиакриловой кислоты. Реакцию проводили при 80С в течение 7 суток.
Влияние поликатионов на проникновение доксорубицина через липидный бислой
В предыдущей части мы показали, что полианионы замедляют скорость проникновения доксорубицина через липидный бислой за счет формирования полиэлектролитных комплексов. А какое влияние на проницаемость мембран по отношению к доксорубицина оказывают катионные полимеры, не образующие комплексов с доксорубицином, но способные взаимодействовть с отрицательно заряженными липидными мембранами? Ранее было показано [163-180], что добавление синтетических поликатионов к малым отрицательно заряженным липосомам ускоряет рН-индуцированный транспорт доксорубицина. Эффект ускорения достигает максимума в точке нейтрализации зарядов на внешней поверхности липосом (Z± =1). Как следует из обзора литературы, добавление поликатионов к противоположно заряженным липидным мембранам вызывает латеральную сегрегацию отрицательно заряженного липида [118, 120, 135, 138, 144-146]. Имеющиеся в литературе данные [181] позволяют также предположить, что на границе таких кластеров в липидной мембране образуются дефекты, которые могут облегчать транспорт доксорубицина внутрь липосом. Как было показано, эти дефекты не являются сквозными, т.е. они непроницаемы для низкомолекулярных ионов, однако их наличие способствует увеличению подвижности липидных молекул, вследствие чего повышается проницаемость мембраны по отношению к соединениям, пспособным проникать по механизму растворения-диффузии. До настоящего времени все исследования влияния поликатионов на проницаемость липидных мембран проводились на малых везикулах. В то же время известно, что характер взаимодействия полимеров с липосомами, свойства которых существенно отличаются от свойств клеточных мембран. В частности, одним из важных параметров, определяющих способность мембран реагировать на воздействие полимеров, является кривизна поверхности мембраны. Ранее было показано, что увеличение размера липосом приводит к качественным изменениям в характере их взаимодействия с полилизином. В то время, как адсорбция полилизина на малых липосомах является полностью обратимой, его связывание с большими липосомами в значительной мере необратимо [163], т.е., по всей видимости, сопровождается заглублением полимера мембрану. Можно предполагать, что изменение кривизны поверхности липосом будет также отражаться и на вызываемом полилизином изменении их проницаемости.
Поэтому в следующей части работы мы сопоставили влияние полилизина на проницаемость мембран малых (размер около 50 нм) и больших (размер около 600 нм) липосом. 5.2.1. Влияние полилизина на проницаемость мембран больших отрицательно заряженных липосом Влияние полилизина на транспорт доксорубицина мы исследовали на больших липосомах со средним размером около 600 нм. Липосомы получали из смеси ФХ/КЛ 7:3, и были заполнены кислым буферным раствором. Внешний раствор имел рН 7,0 и, помимо компонентов буфера, содержал сахарозу, добавляемую для компенсации разницы в осмотическом давлении между внутренней и внешней полостью липосом. Оказалось, что добавление к таким липосомам полилизина приводило к необратимой агрегации липосом, сопровождавшейся выпадением осадка. Поэтому для того, чтобы избежать выпадения липосом в осадок в присутствии полилизина, мы получили липосомы, содержащие, помимо фосфатидилхолина и кардиолипина, 5% фосфатидилэтаноамина, модифицированного полиэтиленгликолем ФЭА-ПЭГ. Известно, что присоединение полиэтиленоксида к поверхности липидный везикул существенно ослабляет их способность к агрегации [180,182]. Оказалось, что введение 5 % ФЭА-ПЭГ в состав липосом резко ослабило их агрегацию в присутствии поликатиона. Данный результат хорошо согласуется с данными работы [183], в которой было показано, что введение в липосомальные мембраны поверхностно-активных соединений, содержащих протяженные цепи полиэтиленоксида, значительно препятствовало агрегации везикул в присутствии поликатионов. В то же время в этой работе было показано, что введение нейтраьного полимера на поверхность мембран практически не влияло на полноту адсорбции полилизина на таких мембранах. Таким образом, введение полиэтоксилированного липида в состав больших везикул дало возможность исследовать влияние полилизина на проникновение доксорубицина через мембрану таких везикул. Оказалось, что при добавлении полилизина к большим отрицательно заряженным липосомам, содержащим 5% ФЭА-ПЭГ, скорость мембранного транспорта докосрубицина увеличивала и росла по мере увеличения концентрации полилизина. При введении в раствор полилизина в концентрации эквивиалентнои количеству анионных зарядов на поверхности липосом кскорость транспорта переставала увелчиваться. (рис. 40). При этом максимальный эффект, отвечающий полному насыщению отрицательных зарядов на поверхности везикул полилизином, соответствовал трехкратному ускорению транспорта докосрубицина. Таким образом, мы показали, что адсорбция полилизина на отрицательно заряженной липидной мембране приводит к существенной дестабилизации бислоя и увеличивает его проницаемость. Можно предполагать, что этот эффект во многом будет определяться и свойствами самой мембраны, в том числе, - ее эластичностью. Для того, чтобы оценить, насколько изменение размера липосом повлияло на изменение скорости транспорта Доке, необходимо сравнить полученные данные с данными для малых липосом. Для этого мы получили малые липосомы размером 100 нм, содержащие 70% ФХ, 25% КЛ, 5% ФЭА-ПЭГ, и изучили скорость проникновения Доке под действием полилизина в тех же условиях, что и с большими липосомами.
Полученные данные представлены на рис. 41. Видно, что взаимодействие полилизина с малыми липосомами, поверхность которых покрыта гидрофильным полиэтиленоксидом, приводит к ускорению транспорта доксорубицина всего на 30% (рис. 41). Сопоставление данных, полученных в настоящей работе, с ранее опубликованными результати показывает, что эффект, оказываемый полимером на транспорт доксорубицина в малые везикулы, состоящие из смеси ФХ/КЛ 7:3, почти втрое больше (около 100%), чем аналогичный эффект на транспорт докосорубицина в липосомы, содержащие 5% полиэтоксилированного липида [163]. Этот эффект вызывается, по всей видимости, влиянием нейтрального полимера, покрывающего значительную часть поверхности везикул, на процессы латеральной сегрегации во внешнем монослое мембраны. Цепи полиэтиленоксида, присоединенные к поверхности липосомы, могут препятствовать образованию крупных доменов отрицательно заряженного липида в пределах внешнего монослоя. В то же время присоединение полилизина к большим липосомам такого же состава приводит к существенно большему ускорению транспорта доксорубицина через бислой (рис. 40). Можно предполагать, что в результате увеличения размеров липидных везикул растет латеральная подвижность липидов в мембране, в результате чего воздействие полимера на транспорт доксорубицина усиливается. Таким образом, данный результат показал, что увеличение размеров липосом приводит к значительному увеличению их чувствительности к действию поликатионов. Можно предположить, что это является следствием увеличения подвижности компонентов липидной мембраны при уменьшении кривизны ее поверхности. В пользу этого предположения свидетельствует целый ряд работ, посвященных исследованию влияния размера липидных везикул на их способность взаимодействовать с низкомолекулярными соединениями, поверхностно-активными соединениями и ферментами. Так, например, известно, что проницаемость липосомальных мембран, оцениваемая по скоростивыхода карбоксифлуоресцеина из липосом при их взаимодействии с человеческой плазмой существенно возрастает при переоде от малых липосом к большим [184]. Фосфолипаза А2 практически не способна встраиваться и гидролизовать липиды, входящие в состав малых везикул (25 нм), но при повышении размера липосом до 100-200 нм ее активность резко возрастает [185]. Короткоцепочечные пептиды, способные проникать в клетки, практически не проникают не только в малые, но и в большие липосомы, но легко проходят внутрь гигантских везикул, размер которых превышав 1 микрон [186]. Все эти факты указывают на то, что размер липидных везикул оказывает существенное влияние на свойства липидных мембран, связанные с подвижностью мембранных липидов.
