Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
1.1 Введение в магнитобиологию 7
1.2 Магнитобиологические эффекты связанные с действием ослабленного ГМП 15
1.2.1 Эффекты связанные с ориентацией 15
1.2.2 Мутационное действие ослабленного ГМП 19
1.2.3 Изменения поведенческих реакций происходящие при ослаблении ГМП 20
1.2.4 Изменения на организменном уровне вызываемые ослаблением ГМП 24
1.2.5 Действие ослабленного МП на клеточном уровне и уровне микроорганизмов 31
1.3 Возможные механизмы и модели действия слабых магнитных полей на биологические системы 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Объекты исследования 44
2.2 Приготовление препаратов 45
2.2.1 Приготовление препаратов нервной системы пиявки 45
2.2.2 Приготовление препаратов нервной системы прудовиков и катушек 45
2.2.3 Приготовление препаратов миелиновых нервных волокон 46
2.3 Методы исследования 46
2.3.1 Способы получения ослабленного магнитного поля 46
2.3.2 Метод экстраклеточной регистрации потенциала действия... 48
2.3.2.1 Описание экспериментальной установки и ее принципа действия 48
2.3.2.2 Методика измерений и обработки результатов 49
2.3.2.3 Магнитные исследования 50
2.3.3 Метод спектроскопии комбинационного рассеяния 49
2.3.3.1 Комбинационное рассеяние (КР). Экспериментальная установка и ее принцип действия 51
2.3.3.2. Методика измерений и обработки результатов 56
2.3.3.3 Магнитные исследования 60
2.3.4 Метод динамической фазовой микроскопии (ДФМ) 60
2.3.4.1 Описание экспериментальной установки и ее принципа действия 60
2.3.4.2 Методика измерений и обработка результатов 66
2.3.4.3 Магнитные исследования 73
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1 Результаты измерений, полученные методом экстраклеточной регистрации потенциала для выделенных нервных волокон 74
3.2 Результаты измерений полученные с помощью метода КР 79
3.3 Результаты измерений полученные с помощью метода ДФМ 85
3.3.1 Результаты полученные в результате магнитных исследований 85
3.3.2 Результаты полученные в лабораторном МП в результате биохимических воздействий 92
Заключение 100
Выводы 102
Список литературы 103
- Изменения поведенческих реакций происходящие при ослаблении ГМП
- Возможные механизмы и модели действия слабых магнитных полей на биологические системы
- Комбинационное рассеяние (КР). Экспериментальная установка и ее принцип действия
- Результаты измерений, полученные методом экстраклеточной регистрации потенциала для выделенных нервных волокон
Введение к работе
Магнитобиология изучает влияние внешних искусственных и естественных магнитных полей на биологические системы (клетка, организм, популяция и т.д.). Одним из основателей направления считается Чижевский А.Л. [1]. Известно, что слабые магнитные поля 10-10" мкТл способны влиять на сложные биологические системы [2-8]. Исследования проводят на биологических объектах, используя различные конфигурации и диапазоны магнитных полей (ослабленное геомагнитное поле, постоянное МП, переменное МП, комбинированные МП). Интерес к воздействию ослабленного геомагнитного поля обусловлен важной ролью геомагнитных полей в жизнедеятельности биосистем, популяций, а так же с коррекцией санитарно-эпидемиологических правил и норм. Известно, что ослабление МП в три-четыре раза вызывает нарушение функции нервной деятельности человека и животных, поэтому существует много работ посвященных этому вопросу [2-8, 12]. Однако систематических исследований действия ослабленного ГМП на разных уровнях организации биологических систем при одной и той же степени воздействия сравнительно не много. Пока еще нельзя сказать, что мы понимаем, как действует МП на клеточном уровне или тем более на уровне организма. Более того, еще не всегда вполне ясно, насколько достоверно экспериментально выявлено влияние МП на те или иные биообъекты и проходящие в них процессы. Исходя из стремления продвинуться в этом направлении, исходя из нашего понимания состояния вопроса, и была сформулирована задача работы.
Для получения полной картины действия ослабленного МП было решено провести системные исследования на молекулярном (каротиноиды), клеточном (нейроны) уровне, на уровне простейшей нервной системы
(окологлоточные кольца улиток-катушек), а также на частях нервной системы - периферической нервной системе (седалищный нерв). Для исследований использовались несколько методов: метод комбинационного рассеяния (КР), метод экстарклеточнои регистрации потенциала и новый метод динамической фазовой микроскопии (ДФМ). Использование нескольких методов было обусловлено тем, что разные методы позволяют исследовать магнитобиологические эффекты по разным характеристикам, кроме того, выбор методов был так же обусловлен используемыми для экспериментов объектами. Кроме того, методы РКР и ДФМ позволяют изучать объекты в нативном состоянии, т.к. являются бесконтактными и не требуют внесения в объект меток. Степени ослабления постоянной составляющей ГМП были 200 и 250 крат.
Актуальность данной темы определяется как фактом выявления зависимости функционирования возбудимых клеток в условиях ослабленного геомагнитного поля, так и перспективами практического применения результатов этих исследований.
Изменения поведенческих реакций происходящие при ослаблении ГМП
Существует множество экспериментов, из которых следует, что изменение ГМП, в частности его ослабление, приводит к изменениям поведенческих реакций животных. Млекопитающие. Эксперименты над взрослыми мышами, находившимися в течение трех месяцев в условиях 200 кратно ОМП, показали снижение двигательной активности [31, 32]. Эксперименты проведенные на крысах, так же показали снижение активности животных [30].
При визуальном наблюдении за поведением кроликов, находившихся в ослабленном в 600 раз ГМП (Н 50-150 нТл), были отмечены вялость, апатия, малоподвижность, что подтвердилось при исследовании общей двигательной активности. Движения контрольных кроликов были равномерными и почти не отличались между собой по амплитуде, то у подопытных животных короткие периоды интенсивных движений перемежались с более длительными периодами почти полной неподвижности [25].
Птицы. С другой стороны исследования роли МП при выработке условного рефлекса у овсянок дало негативные результаты. Птицы находились в клетке с проволочным полом, помещенной в систему модифицированных колец Гельмгольца - два параллельных кольца, отстоящих друг от друга на 1 м. На проволоку подавался раздражающий электрический импульс длительностью ОД сек., заставлявший птицу подпрыгивать. Одновременно изменялось направление искусственного МП на 1 сек. или давался звук от зуммера. Таким образом, у птицы вырабатывался условный рефлекс на изменение МП или звука, причем ответная реакция птицы (подпрыгивание) автоматически записывалась. Опыты показали, что птицы научились избегать электрического удара, сопровождающегося звуковым раздражителем, но не реагировали на кратковременное изменение направления МП [21,22].
Человек. Исследования с участием испытателей [7, 8, 27], пребывающими в экранированной комнате (Н 5 10 Э), были кратковременными. Двое испытуемых в течение пяти дней находились в полностью экранированной комнате и в течение трех суток до и после опыта в неэкранированной комнате. Во время пребывания в экранированной комнате у них изменялась критическая частота световых мельканий, а после их перехода в неэкранированную комнату с обычными геомагнитными условиями снова становилась нормальной.
У людей, находившихся в экранированном подземном бункере, где ГМП было уменьшено в 100 раз (Н 5 10" Э), увеличился период циркадных ритмов. Как известно, организмам свойственны периодически повторяющиеся колебания физиологических процессов - биологические ритмы с различной протяженностью циклов. При помещении организма в постоянные (апериодические) условия у него наблюдаются так называемые циркадные ритмы с периодом, отличающимся от суток (20-28 часов). При обычных же условиях преобладают суточные ритмы. В среднем ритм составил 25,65±1,24 часа, в то время как в неэкранированном пространстве он был 25,00±0,55 часа. При экранировании у испытуемых отмечалась нарушение правильной последовательности ритмики [7].
В эксперименте с испытателями, продолжавшемся 10 дней, было обнаружено, что при компенсации ГМП, как и при экранировании, происходили четкие изменения в ЦНС. Этот опыт был осуществлен следующим образом. Систему больших, модифицированных колец, Гельмгольца с диаметром 8,5 м располагали перпендикулярно друг к другу. Вся система была сопряжена с электрическими часами и магнитометром для определения величины ГМП. В центре указанного объема при компенсации ГМП, Н составляла 5 10"4 Э, а на расстоянии 2,5 м от центра, не более 10" Э.
Возраст испытателей составлял 17-19 лет. Четверо из них находились в камере с компенсированным ГМП, а двое для контроля - в аналогичной по устройству камере, но без компенсации ГМП [7]. Перед началом эксперимента испытуемые находились пять дней в камере с обычными условиями, а затем их перевели в опытную камеру, в которой в течение 10 дней создавалась компенсация ГМП. Когда компенсация ГМП прекращалась, испытуемые оставались в этой же камере еще пять дней в условиях геомагнитного поля. Для оценки влияния изменений ГМП использовались различные физиологические тесты - вес, температура тела, частота дыхания, артериальное давление, изменения электрокардиограммы, анализы крови, психофизиологические тесты, электроэнцефалограммы и ряд других показателей (всего около 30). За время эксперимента все тесты и физиологические показатели у лиц, находившихся в условиях с ОМП, не отличались от таковых в геомагнитных условиях. Однако, как и в опытах с полным экранированием, критическая частота световых мельканий, важная функциональная характеристика, связанная с реакцией ЦНС, снижалась значительно [7].
Помимо прямых данных есть медико-статистические исследования и работы, посвященные подводникам и космонавтам, которые могут косвенно подтвердить влияние ОМП на биологические объекты.
Возможные механизмы и модели действия слабых магнитных полей на биологические системы
Так для человека в зависимости от амплитуды ГМП, от его функционального состояния и от временного фактора могут происходить активационные или тормозные физиологические процессы. Этим объясняются разнонаправленные изменения качества внимания и памяти. Сопоставление полученных результатов о более выраженном ухудшении памяти по сравнению с вниманием, и результатов исследования о влиянии умственного утомления на систему восприятия и переработки информации показывает, что в обеих ситуациях наблюдается нарушение операций повторения и извлечения информации из кратковременной (оперативной) памяти. Неизменными остаются операции сенсорной обработки единичного стимула, т.е. внимания. Внимание и кратковременная память во многом определяют надежность выполнения операторской деятельности, и возмущения ГМП негативно влияют на качество этих психических процессов. При изменении ГМП отмечается смена доминирования полушарий по активности альфа- и бета- ритмов. Происходит сглаживание, как межполушарной асимметрии, так и функциональной асимметрии рук. Функциональная асимметрия отражает неравнозначное отношение больших полушарий мозга человека к восприятию различных видов информации, характеризует формирование адаптивных программ под влиянием разнообразных факторов.
Роль молекул воды. Можно предположить, что основной субстанцией, определяющей действие магнитного поля на живые организмы, являются молекулы воды, входящие в структуру биологических систем, и процессы, совершающиеся в них. Такой вывод можно сделать, основываясь на многолетних работах по изучению химических реакций, протекающих в водной среде. Одна из таких реакций, гидролиз хлорида висмута, непрерывно и тщательно изучается на протяжении 20 лет [57]. Высокая чувствительность молекулы воды к магнитным полям и перестройка ее структуры под их действием также изучаются [67, 68]. Но на сегодня не ясно, что в воде может быть мишенью действия МП, т.к. в биологических системах вода структурирована и комплексирована сложными молекулами и ионами. Поэтому ее свойства при воздействии на клетку могут сильно отличаться.
Роль биологических мембран. Экспериментальные работы выявили механизм восприятия МП живыми организмами, связанный с изменением проницаемости биологических мембран [7, 58]. Биологические мембраны выполняют основную роль в поддержании функционирования и тонкой регуляции всех без исключения органов живого организма. На согласованной работе мембранного механизма проницаемости возможно точное поддержание гомеостаза живого организма и саморегулирующей способности его элементов. МП через изменение проницаемости мембран может оказывать влияние на весь организм в целом, вызывая ряд изменений в организме человека, у животных и растений. Если следовать гипотезе о связи проницаемости мембран с МП, то логично признать возможность прямого действия МП на ЦНС. В настоящее время отмечено непосредственное влияние МП на отдельные нейроны, нервную ткань и высшие отделы головного мозга животных [2-5]. Известно при этом, что проявление активной работы головного мозга идет с помощью различного рода медиаторов и нейрогормонов, проявляющих как передачей отдельных нервных импульсов, так и всей работой ЦНС. Таким образом предполагается, что МП может воздействовать на проницаемость мембран оказывая влияние на весь организм в целом и вызывает цепь событий, прослеживающихся в разнообразных проявлениях нервно-психической деятельности. Возможно, что непосредственное влияние МП на проницаемость мембран идет одновременно с большим числом различных адаптационных, регуляционных реакций в организме, стремящихся поддерживать оптимальный уровень состояния организма в его взаимоотношениях с внешней средой. Возможно, что воздействие МП на проницаемость всех мембран живого организма приводит к изменению его функционально-динамических показателей. Например, для организма с патологией, у которого нарушены гомеостатические реакции, направленные на сохранение динамического равновесия организма со средой, воздействие МП особенно заметно. Это хорошо видно на примере заболеваний сердечно-сосудистой системы, при которых реакции на изменения МП выражены наиболее резко. Согласно современным представлениям в патогенезе заболеваний сердечно-сосудистой системы существенное значение имеют нарушения тонуса и проницаемости сосудистой стопки с последующими ее морфологическими изменениями. Изменения проницаемости клеточных мембран и связанные с этим сдвиги в электролитном балансе, возникающие в ответ на воздействие ослабленного ГМП, могут таким образом рассматриваться как один из компонентов патогенетического механизма при заболеваниях органов кровообращения. В то же время влияние ослабленного МП распространяется и на ЦНС, изменяя при этом мембранную проницаемость и биоэлектрическую активность клеток головного мозга. Таким образом, ослабление ГМП может оказывать влияние на организм непосредственно, действуя на сосудистую систему, а также и опосредованно через ЦНС, и, следовательно, изменяя регуляторную функцию. Так нарушение проницаемости мембран в сердечной мышце в особенности при уже имеющихся патологических изменениях может приводить к нарушениям функции. В частности, это может проявиться в нарушении сердечного ритма.
Биомагнетит. (Магнитосомы). Сущность модели в том, что в многоклеточном и даже одноклеточном организме присутствуют кристаллы ферромагнитного соединения РезС 4 - магнетита [59]. Грань кристалла достигает 42 нм, магнетитовые гранулы образуют цепочки до 20 единиц в каждой бактерии. Такой кристалл в постоянном МП испытывает на много порядков больший вращательный момент, чем в случае диамагнетиков и может оказывать воздействие на соответствующий близкорасположенный рецептор. По-видимому, это решает проблему ориентационного эффекта, но не решает проблему магнитобиологии, т.к. не объясняет эффекты, связанные с организмами, в которых не существует магнетит.
Комбинационное рассеяние (КР). Экспериментальная установка и ее принцип действия
В данном методе в качестве объекта использовался седалищный нерв лягушки. Регистрацию потенциала действия осуществляли с помощью внеклеточного отведения потенциала [80, 81]. Суть метода в том, что один участок нервного ствола возбуждают, подавая электрические импульсы, на другом участке этого же волокна снимают показания. Метод позволяет получить несколько характеристик: амплитуду, пороговое напряжение, скорость передачи импульса вдоль волокна, форму импульса. На рис. 7 представлена схема установки.
Принцип ее действия таков. На электроды Р1 с платы АЦП управляемой с помощью программного обеспечения ПК, подается возбуждающий сигнал, с электродов Р2 сигнал снимается и попадает на усилитель, откуда идет на осциллограф, предназначенный для контроля за измерениями и на плату компьютера, данные записываются на жесткий диск и затем обрабатываются с помощью стандартных пакетов программ Origin, Matlab.
Для контроля были проведены измерения в условиях лабораторного магнитного поля (Н=42,3±0,4 мкТл). Выделенные по описанной выше методике (п. 2.2.1) нервные волокна помещались в раствор (среда-2). И инкубировались 30 мин при температуре +5 С в холодильнике в специальной посуде. Затем нерв извлекался и помещался в специальную камеру (кювету), выполненную из оргстекла, с влажной атмосферой. На ПК запускалась программа, задающая параметры воздействия. Для изучения изменений амплитуды, формы импульса и скорости проведения ПД параметры стимуляции были следующими: электрические прямоугольные импульсы амплитудой 300 мВ для одной группы нервов и 800 мВ для другой соответственно, длительностью 0.3 мс, с частотой 115 Гц. Время, в течение которого осуществляли контроль за работой нервных волокон, составляло 50 мин. Режимов стимуляции было два. Первый режим - непрерывная стимуляция в течении всего времени измерений, второй режим - стимуляция осуществлялась раз в 5 мин, т.е. только в момент регистрации.
Для определения пороговых значений генерации ПД нерв раздражали электрическими прямоугольными импульсами с амплитудами от 100 до 500 мВ (шаг - 10 мВ, время регистрации в точке - 1 сек, пауза между точками 2 сек). Промежуток между измерениями составлял - 8 мин. В промежутках нерв непрерывно раздражали переменным током с частотой 115 Гц и амплитудой 300 мВ для одной группы и 800 мВ для другой соответственно. В другой серии измерений в промежутках воздействий не было. Время измерений составляло 50 мин. Все измерения проходили при комнатной температуре. Для каждого типа измерений использовалось по 10 пар нервных волокон.
В описываемом методе для проведения магнитных измерений использовалась экранирующая камера, описанная в п. 2.2. Экранирование геомагнитного поля осуществляли в 250 раз (Н=0,17±0,02 мкТл), относительно лабораторного значения (Н=42,3±0,4 мкТл). Кювету с волокном, подготовленным тем же способом, что и для контроля (п. 2.2.1), устанавливали в экранирующей камере и проводили измерения. Как правило, один из пары выделенных нервов служил контролем, и на нем проводились измерения в лабораторном МП. Причем, в 5 случаях на одном нерве из пары проходили контрольные измерения при лабораторном поле, затем на втором нерве с компенсацией поля, а в 5 следующих случаях, наоборот, для исключения эффектов связанных с тем, что для пары нервов промежуток между измерениями разный, с момента выделения. Порядок измерений при действии ОМП повторяет описанный в п. 2.3.1.2. Время экспериментов составляло 50 мин. Статистика набиралась на 10 парах волокон для каждого типа экспериментов.При помощи спектроскопии КР (Г.С. Лансберг, Л.И. Мандельштам. 1928) изучают колебательные и вращательные, в редких случаях, электронные состояния молекул [83, 83].
Явление связано с нахождением в спектре рассеянного света полос в диапазоне частот существенно отличающихся от спектра падающего света. Модулированный собственными колебаниями кристалла или молекулы, рассеянный свет оказывается содержащим новые дискретные спектральные линии - спутники, что обусловлено периодическими изменениями в веществе, например, колебания связей и валентных углов, вращения вокруг каких-либо осей. Спутники расположены симметрично относительно возбуждающей линии с частотой со. Каждому спутнику с частотой co-Qj (красный или стоксов спутник) соответствует спутник с частотой со+ф (фиолетовый или антистоксов спутник). Здесь Qj - одна из собственных частот колебаний молекулы. Таким образом, измеряя частоты линий КР, можно определять частоты собственных (или нормальных) колебаний молекулы, проявляющихся в спектре КР. Аналогичные закономерности имеют место и для вращательного спектра КР. В этом случае частоты линий определяются вращательными переходами молекул. В простейшем случае вращательный спектр КР - последовательность почти равноотстоящих симметрично расположенных линий, частоты которых являются комбинациями вращательных частот молекул и частоты возбуждающего света.
Результаты измерений, полученные методом экстраклеточной регистрации потенциала для выделенных нервных волокон
Раствор каротиноидов (см п. 2.1) помещали в кювету. Луч лазера фокусировали на кювете с раствором. В работе использовали синий аргоновый лазер, генерирующий излучение с длиной волны 473 нм, попадающей в спектр поглощения каротиноидов [93]. Мощность лазера устанавливали 17 мВт. Рассеянное излучение собирали системой линз на входную щель монохроматора. Осуществляли регистрацию сигналов и накопление спектров с помощью фотоумножителя и многоканального анализатора импульсов, после чего данные записывались на компьютер. Запись одного спектра составляла 15 мин. В каждом случае снималась серия из 6 последовательных спектров. Таким образом, для каждого пика получался набор значений интенсивности во времени. Полное время каждого измерения составляло 90 мин.
Для окологлоточного нервного кольца и нервного волокна, используемых также в этих измерениях и выделенных по описанной выше методике (п. 2.2.3, 2.2.4), помещенных в кювету с физиологическими растворами (среда-6) и (среда-2) соответственно, последовательность действий по снятию спектров аналогична описанной выше с каротиноидами.
В результате обработки получался набор спектрограмм, каждый пик соответствует определенной молекулярной связи (см. выше). Изменение состояния молекулы можно отследить по сдвигу пиков, по изменению ими формы, а также по изменению отношений пиков интенсивности. В данной работе в качестве критерия было взято отношение пиков интенсивности (которое удобно применять в случаях, когда конформационные изменения незначительны).
Обработка результатов проходила следующим способом. Для каждого из 6 измерений в серии брали отношения значений интенсивности пиков измерений отъюстировать прибор так, чтобы интенсивность рассеивания была такой же, как и предыдущая, затруднительно, набор полученных значений в каждой серии нормировали на первое в серии.
Для магнитных измерений использовались катушки Гельмгольца (п. 2.3.1), которые крепилась к установке КР. С их помощью компенсировали постоянную составляющую МП Земли в 200 раз (Н=0,20±0,03 мкТл), относительно лабораторного поля. Контроль осуществлялся с помощью магнитометра. Кювету с объектом помещали между колец Гельмгольца. Все последующие действия снятия спектров в условиях компенсации постоянной составляющей геомагнитного поля для каротиноидов, окологлоточных колец и нервных волокон осуществлялись так же, как и для описанных в п. 2.4.2, контрольных измерений проведенных при лабораторном значении МП.
Метод динамической фазовой микроскопии предназначен для исследования оптических свойств клеток (светорассеяния, показателя преломления), которые зависят от свойств плазматической мембраны, организации цитоскилета, положения и объема органоидов в цитоплазме. Изучение оптических свойств нейронов, как показателя уровня клеточной активности, впервые было предложено авторами [94], наблюдавшими изменение интенсивности светорассеяния нервом, при проведении ритмического возбуждения. Затем было показано, что оптические свойства нервных клеток зависят от мембранного потенциала и транспорта ионов через плазматическую мембрану [95]. Было обнаружено, что интенсивность света, рассеяного на нейронах, линейно зависят от мембранного потенциала [96]. Так же было установлено, что оптические свойства нейронов зависит и от цитоплазматических процессов: реорганизация цитоскилета, движение органоидов и транспорта ионов через митохондриальную мембрану [97].
Исследования проводились на опытном образце модуляционного интерференционного микроскопа МИМ 2.1, выпущенного компанией «Лаборатории Амфора» [98, 99]. Прибор предназначен для прецизионного измерения микрорельефа поверхности образцов на отражение, точность измерения высоты лучше, чем ЗА, в случае применения специальных методик эта величина может быть снижена до 1А. Традиционной областью его применения являются контроль поверхности оптических изделий, магнитооптических и видеодисков; аттестация эталонов длин (0,1-1мкм); контроль топологии интегральных схем с субмикронным разрешением. В отличие от традиционных методов оптической микроскопии, основанных на регистрации распределения интенсивности света, метод ДФМ позволяет непосредственно получать распределение фазы в интерференционном изображении. Прибор представляет собой лазерный интерферометр с разделенными оптическими трактами предметного и объектного плеча (модифицированная схема интерферометра Линника). На рис. 10 приведена блок-схема установки. Регистрация интерференционного изображения производится координатно-чувствительным приемником при модуляции длины опорного плеча интерферометра с помощью пьезопреобразователя.
Похожие диссертации на Исследование действия ослабленного магнитного поля на функционирование нервной клетки
