Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Математическое моделирование рассеяния плоской монохроматической волны эритроцитами 29
1.1 Математическая постановка задачи 29
1.2 Теория Ми для однородных диэлектрических сфер 31
1.3 Приближение аномальной дифракции 33
1.4 Отличия дифракционных картин для частиц различных форм 35
1.5 Зависимость видности дифракционной картины от разброса эритроцитов по размерам
1.5.1 Оценка видности дифракционной картины в районе центрального светлого пятна 42
1.5.2 Оценка видности дифракционной картины в области первого интерференционного кольца 44
1.5.3 Численное моделирование рассеяния лазерного излучения на неоднородном по размерам ансамбле частиц 48
1.5.4 Обсуждение результатов расчёта зависимости видности дифракционной картины от разброса частиц по размерам 51
Глава 2. Обратная задача восстановления распределения частиц по размерам и удлинению в рамках лазерной дифрактометрии 54
2.1 Различные постановки обратных задач для определения распределения эритроцитов по размерам 55
2.1.1 Исследование рассеяния света на двояковогнутом диске и цилиндре 56
2.1.2 Обратная задача определения распределения эритроцитов по размерам по неточно измеренной дифракционной картине 58
2.1.3. Численные результаты решения обратной задачи восстановления распределения эритроцитов по размерам 64
2.1.4 Сравнение результатов численного расчёта распределения эритроцитов по размерам с экспериментальными данными лазерной дифрактометрии 69
2.2 Обратная задача об определении распределения частиц по удлинению в лазерной дифрактометрии эритроцитов 73
2.2.1 Иерархия моделей обратных задач для определения распределений частиц по формам 75 CLASS Глава 3. Оценки трёх первых статистических моментов распределения эритроцитов по удлинению . 81 CLASS
3.1 Модель ансамбля частиц со слабой неоднородностью по удлинению82
3.2 Оценка линии изоинтенсивности дифракционной картины в области первого интерференционного кольца 82
3.3 Оценка первых трёх статистических моментов функции распределения частиц по удлинению в области середины центрального светлого пятна дифракционной картины 95
3.4 Сравнение показаний оценок на первые три статистических момента распределения частиц по удлинению с экспериментальными данными 100
Приложение.
Структура программного комплекса 106
4.2 Обработка экспериментальных данных для вычисления распределения частиц по размерам 109
4.3 Модуль определения статистических моментов распределения эритроцитов по вытянутости . 111
Заключение 115
Литература 116
- Отличия дифракционных картин для частиц различных форм
- Исследование рассеяния света на двояковогнутом диске и цилиндре
- Оценка линии изоинтенсивности дифракционной картины в области первого интерференционного кольца
- Модуль определения статистических моментов распределения эритроцитов по вытянутости
Отличия дифракционных картин для частиц различных форм
В данном случае считается, что все частицы обладают примерно одинаковыми размерами и что разброс частиц по размерам почти не влияет на двумерную дифракционную картину. По сравнению с тем, что в современных эктацитометрах измеряется только среднее значение функции г, постановка задачи о вычислении всей функции является существенным продвижением вперёд. Насколько известно автору до сих пор соотношение (4) не рассматривалось как интегральное уравнение, решение которого позволяет получить информацию о всей неизвестной функции распределения клеток по удлинению . В главе 2 приведены численные результаты регуляризации интегрального уравнения (4) по Тихонову с помощью обобщённого принципа невязки в зависимости от погрешности, внесённой в правую часть. Возникает естественная иерархия моделей обратной задачи от интегрального уравнения (3) к уравнению (4) и далее к аналогичному уравнению на неизвестную функцию , , в котором одновременно учтён разброс по размерам и по удлинению. Исследование этого полностью двумерного уравнения остаётся делом будущего и выходит за рамки диссертации.
В литературе известно несколько альтернативных подходов к определению распределения частиц по удлинению по данным светорассеяния, в том числе применяющихся и для эритроцитов. Рассматриваются постановки задачи для хаотически ориентированных частиц специальной формы [79] и хаотически ориентированных вытянутых частиц [65]. Предложены несколько эвристик, чтобы рассчитать распределение частиц по формам [48]. Также предложено решать подобные задачи с помощью обучения специальных нейронных сетей [32].
Помимо лазерной дифрактометрии для анализа деформируемости клеток применяется, например, реоскопия, предложенная в недавней работе [39] – техника, в которой сильно разбавленную в вязкой прозрачной жидкости кровь помещают между двумя плоскостями, движущимися друг относительно друга в разные стороны. В результате возникает сдвиговое напряжение, растягивающее эритроциты, но не заставляющее их двигаться относительно неподвижного наблюдателя. Это позволяет наблюдать вытянутые клетки в оптический микроскоп. При своём очевидном преимуществе – возможности напрямую наблюдать вытянутые клетки – данный прибор до сих пор создан в количестве нескольких штук и не применяется в медицинской практике. При этом работа с реоскопом предполагает значительный труд оператора, устраняющего изображения дефектных клеток в полуавтоматическом режиме. В будущем возможно совмещение основного преимущества лазерной дифрактометрии – автоматизированный быстрый анализ огромного числа частиц – с главным преимуществом реоскопии – возможностью наблюдать частицы в микроскоп.
Есть и другие методы для измерения деформируемости эритроцитов – метод микропипетки [44], лазерного пинцета [33], фильтрации крови через пористую среду [74] и другие. Методы микропипетки и лазерного пинцета позволяют измерять деформируемость эритроцитов на уровне единичных клеток, в то время как метод фильтрации через пористую среду даёт информацию о средней деформируемости эритроцитов в образце, но не о распределении клеток по деформируемости. Более детальное сравнение методов измерения деформируемости эритроцитов выходит за рамки данной работы. Обзор таких методов можно найти в статье [54].
Отметим, что лазерная дифрактометрия обладает несколькими уникальными особенностями по сравнению с другими методами, позволяющими измерять распределения частиц по размерам и удлинению. Во-первых, дифракция света переводит задачу с уровня микро объектов на уровень макро объектов – при характерном размере эритроцитов 8 мкм дифракционная картина при достаточном увеличении расстояния от эритроцитов может достигать любого размера, например, несколько метров. Во-вторых, интегральное уравнение (3) предполагает усреднение по огромному количеству частиц, в результате чего информация от малых групп частиц отбрасывается автоматически за счёт того, что вклад рассеяния света на группе частиц пропорционален их суммарной площади, а если частиц мало, то и их суммарная площадь будет мала.
Таким образом, благодаря особенностям явления дифракции света решается основная проблема всех методов, обрабатывающих частицы по отдельности, в том числе таких как проточная цитометрия [49] и оптическая микроскопия, в которых необходимо отбраковывать все случаи плохих частиц (например порванные клетки крови и т.п.) в огромном массиве данных. Сама процедура отсеивания изображений плохих частиц, имеющих неправильную форму и иногда наложенных друг на друга, представляет собой значительную сложность при автоматизации проточных цитометров и оптических микроскопов. Поэтому возможность полностью автоматизировать процедуру измерения также является сильным преимуществом лазерной дифрактометрии по сравнению с другими методами.
В интегральном уравнении (3) и (4) в качестве известной правой части выступает угловое распределение интенсивности рассеянного на частицах света. Это хорошо соответствует условиям натурного эксперимента, в котором можно измерить интенсивность света в любой точке, но нельзя измерить фазу электрического поля ни в одной точке.
В литературе рассматривались и другие схемы экспериментальной установки. Например, можно добавить фоновую волну как это делается в фазовой микроскопии [68] и в динамической голографии [37]. В этом случае возможно определить фазу комплексной амплитуды электрического поля в дальней зоне дифракции и восстановить изображение отдельных клеток, а также распределение показателя преломления среды внутри каждой отдельной клетки. Такой подход ведёт к получению детальной информации о каждой отдельной клетке и в любом случае предполагает, что человек-оператор должен отсеивать плохие результаты, анализировать массив данных. Аналогичная картина возникает и при использовании современных алгоритмов распознавания фазы светового поля [43].
Исследование рассеяния света на двояковогнутом диске и цилиндре
Другим характерным признаком может служить видность дифракционной картины, определённая как разность первого дифракционного максимума и первого минимума, делённая на их сумму. При задании одной и той же формы частиц, но возможном разбросе частиц по размерам дифракционная картина должна терять свой контраст, “замываться” при увеличении разброса по размерам. Математически это выражается в том, что для узких распределений частиц по размерам зависимость видности от значения разброса частиц по размерам является монотонной. Исследованию этой зависимости посвящен отдельный пункт настоящей диссертации.
На рисунке 7 показано сравнение расчётов малоуглового рассеяния света цилиндром с помощью приближения аномальной дифракции, описанного в пункте 1.3 и с помощью численного решения уравнения объёмного интеграла, описанного в пункте 1.4. Видно, что решения совпадают с высокой точностью. Это согласуется с физическим аспектом рассматриваемой модели – в плоской частице лучи, падая на поверхность, не должны преломляться; в то же время в приближении аномальной дифракции в основном пренебрегается именно преломлением лучей при пересечении поверхности частицы.
Показан расчёт интеграла в левой части (3), моделирующего рассеяние на большом количестве частиц одинаковой формы, но разных размеров, распределённых как функция co(R). Сплошная кривая соответствует плоским цилиндрам с распределением по размерам co(R), а точечная - двояковогнутым дискам с распределением a)(R). На рисунке 8 показан расчёт интеграла в левой части (3), моделирующего рассеяние на большом количестве частиц одинаковой формы, но разных размеров, распределённых как функция . Несмотря на то, что интеграл (3) выполняет операцию усреднения, разница в дифракционных картинах для разных форм в области первого дифракционного минимума и максимума остаётся такого же порядка, как и для одиночных частиц. Это значит, что использование той или иной модели для частицы важно с точки зрения решения обратной задачи об определении .
Представленные выше данные получены для случая фиксированной одинаковой ориентации частиц – они считались повернутыми перпендикулярно направлению распространения падающей волны. Если сделать ориентацию частиц случайной, то разница между формами практически пропадёт, см. результаты такого моделирования, например, в обзоре [6]. В настоящей диссертации ставится целью осветить аспекты математического моделирования рассеяния света частицами сложных форм, поэтому ориентация выбирается постоянной.
Одним из факторов, влияющих на видность дифракционной картины, является разброс эритроцитов по размерам. Чтобы оценить влияние этого фактора, рассмотрим дифракцию плоской монохроматической волны на неоднородном по размерам ансамбле частиц, обладающих фиксированной формой. Примерную схему моделируемого в данном пункте эксперимента см. на рисунке 3. Эритроциты помещаются в тонкую кювету, расположенную горизонтально, если необходимо сохранить единую ориентацию клеток, и вертикально, если необходимо достичь произвольной ориентации эритроцитов. Специальная фотоматрица снимает рассеянный на эритроцитах лазерный свет в дальней зоне дифракции, после чего оцифрованный сигнал заносится в компьютер. Расстояние между фотоматрицей, иначе называемой экраном наблюдения, и малым объёмом, в котором сосредоточены эритроциты обозначим z. Размер освещаемого лазерным лучом участка кюветы составляет примерно 1 мм3, расстояние z « 5 с , т.е. много больше освещаемого объёма.
Используя приближение аномальной дифракции, описанное в пункте 1.3 настоящей диссертации, можно показать (см., например, [63]), что в условиях лазерной дифрактометрии эритроцитов следует учитывать: - дифрагированное световое поле, создаваемое частицей в области пространства, лежащей за пределами лазерного пучка, выражается через дифракционный интеграл (1.7), который берется по поверхности частицы; - при рассеянии плоской монохроматической волны на ансамбле частиц, координаты которых представляют собой равномерно распределённые независимые случайные величины с нулевым средним значением, средняя интенсивность света в любой точке экрана наблюдения равна сумме интенсивностей света, создаваемых в этой точке отдельными частицами ансамбля; - при рассеянии плоской монохроматической волны на неоднородном по размерам ансамбле эритроцитов угловое распределение интенсивности света / пропорционально соответствующему распределению для отдельной частицы, усредненному по размерам частиц: N І І, d = /, 1.10 о где все обозначения такие же как и в (3), iV - количество частиц, на которых в данный момент рассеивается свет. Параметр iV определяет интенсивность в центре дифракционной картины при = 0 . Если поделить левую и правую части уравнения (1.10) на/ 0 , то параметр iV сокращается и получается уравнение (3) для нормированной на центральный максимум правой части / // 0 .
Оценка линии изоинтенсивности дифракционной картины в области первого интерференционного кольца
Назовём теперь обратной задачей 3 случай, когда правая часть для любого заранее фиксированного распределения по размерам рассчитывается численным интегрированием левой части 2.2 с ядром, рассчитываемым по программе adda, но интегральное уравнение 2.2 затем решается для ядра, заданного по формуле аномальной дифракции 1.8 . Такая обратная задача соответствует часто возникающей в литературе [11, 27, 76, 77] ситуации, когда используется упрощённая модель цилиндра малой толщины, однако данные из натурного эксперимента естественно значительно ближе к обратной задаче 2, поскольку физиологическая форма эритроцитов в нормальных условиях есть двояковогнутый диск, а не цилиндр. Будем интерпретировать интегральный оператор с ядром задачи 1 как неточно заданный по сравнению с ядром задачи 2. Оператор левой части 2.2 обозначим за А3 = А1, точную правую часть за /3 = /2, правую часть с экспериментальной ошибкой измерения за I3S = I2S , соответственно 83 = /3 - I3s\\ Й ] = 82 по норме Ь2[0,втах], погрешность оператора примем равной h3 = \\А2 - АНи 1 по операторной норме линейных ограниченных операторов из W21[ 1, 2] в L2[0,9тах].
Введенные обратные задачи сводятся к решению интегральных уравнений Ai = IiS, і = 1,2,3. Нетрудно видеть, что для всех трёх уравнений интегральные операторы обладают непрерывными ядрами. Поэтому соответствующие линейные интегральные операторы А1,А2,А3 вполне непрерывны из W21[ 1, 2] в L2 [0, втах]. Кроме того отметим, что инъективность оператора А1 и А3 = А1 вытекает из результатов работ [34, 50], где рассматривались интегральные операторы на полупрямой с ядрами специального вида К (х, t = К t х, где / Ks s-1/2 ds оо, а инъективность оператора А2 с ядром общего вида далее предполагается a priori. Следовательно, интегральные операторы At,i = 1,2,3 обратимы, щ = Aj4t , однако обратные операторы А 1 неограниченны (см., например, [19], п. 20.6).
Таким образом, обращение интегрального оператора At для любой из трёх обратных задач неустойчиво для пространства решений W [Rlt 2] и пространства правых частей L2[0,6max] . Это приводит к тому, что даже найденные для обращения А± аналитические формулы, опирающиеся на интегральное преобразование Меллина (см., например,[34]), в случае неточно заданной правой части (2.2) приводят к не имеющим физического смысла решениям. Поэтому для численного обращения (2.2) мы воспользовались регуляризацией по Тихонову.
Обратные задачи 1,2,3 были решены сведением к задаче минимизации функционала Тихонова с выбором параметра регуляризации по обобщённому принципу невязки. Обозначим Aih - приближение для At с точностью h в операторной норме. Рассмотрим функционал Тихонова: Ма = \\Aih-Lx\\2 +а\\\\2 1г где a 0 - параметр регуляризации. Следуя физическим соображениям определим множество ограничений а = ( Є W}[Rlt2] = i = 2 = 0, 0 VR Є [ 1;2]Ь которое является замкнутым (по теореме о следах в W21[ 1, 2\), выпуклым и 0 Є П. Поскольку функционал Тихонова является сильно выпуклым, то существует единственная экстремаль f , доставляющая минимум функционалу: М?(?п)= infM/Ч, 2.3 1 U] шеа L где ту = Qi, S вектор погрешностей задания оператора и правой части. Рассмотрим ,,2 / и и \2 невязку pv{a = \\Aihfv - IiS\\L - [8 + /i? R J . Выбор параметра регуляризации по обобщённому принципу невязки (см. [18], стр. 15) состоит в том, что если /і5 S , то ir] = 0 берем в качестве приближенного решения (2.2); если /і5 8, то в случае существования ал такого, что pv(ar] = О, полагаем ir] = о? , а в случае pv(a О для всех а О берем ,-„ = lim ,. Справедливо следующее утверждение, которое является переформулировкой теоремы 3 из книги [18] для рассматриваемых обратных задач. Теорема 1. Если \\Aih - Ai\\wi L2 h, \\hs-h\\L 8 то, выбирая параметр регуляризации по обобщённому принципу невязки, при r\ = h, 8 -» О имеем ir] -» 5j в норме пространства W iR-i, 2] , і — 1»2,3 .
В вычислительных экспериментах по моделированию решения обратных задач 1-3 операторы At в левой части (2.2) заменялись своими конечномерными аналогами (матрицами) Aih с помощью аппроксимации интегралов частичными суммами на основе квадратуры Гаусса с iV слагаемыми. Поскольку точность вычисления интегралов напрямую зависит от выбора достаточно большого N, то, с учетом характерного для лазерной дифрактометрии диапазона уровней погрешностей измерения дифракционной картины от 1% до 15%, соответствующая погрешность вычисления операторов А і в формуле невязки не учитывалась при і = 1,2, а при і = 3 учитывалась с помощью соотношений \\A2h - Alh\\wi L2 \\A2h-Alh\\L L2=h3.
Модуль определения статистических моментов распределения эритроцитов по вытянутости
Доказанные выше утверждения 3.2 и 3.3 дают возможность по измеряемым в натурном эксперименте данным рассчитывать среднее удлинение, дисперсию и асимметрию распределения частиц по удлинению в исследуемом образце. Для проверки результатов этих утверждений были использованы данные следующего калибровочного эксперимента. У здоровой крысы был взят 1 мл крови. Крысиные эритроциты меньше человеческих и в диаметре составляют порядка 5 мкм, обладают примерно такой же формой двояковогнутого диска, относительный показатель преломления на длине волны 0.6 мкм в воде у эритроцитов крысы примерно равен 1.05 как и в случае человеческих красных клеток крови, поглощение в обоих случаях примерно нулевое. Крысиные эритроциты деформируются несколько слабее человеческих. Другие особенности для настоящей работы не важны.
В работах [11, 58, 60, 64] опубликованы результаты калибровочных экспериментов с кровью крыс. Во всех указанных случаях часть клеток фиксировали с помощью специального вещества – глютаральдегида, - которое делает клетки крови абсолютно жёсткими, они теряют возможность деформироваться в условиях эксперимента в искусственно созданном сдвиговом потоке в эктацитометре. Процедура обработки эритроцитов глютаральдегидом описана в [58]. Таким образом, можно взять известное количество жёстких клеток и смешать с известным количеством обычных клеток – получится ансамбль, близкий к бимодальному. При малом сдвиговом напряжении все клетки будут круглыми. При увеличении сдвигового напряжения фракция здоровых клеток будет вытягиваться и ориентироваться вдоль параллельных линий поля сдвиговых напряжений в эктацитометре, а фракция зафиксированных клеток останется в недеформированном состоянии.
В таком калибровочном эксперименте есть возможность наблюдать дифракцию не только на смеси здоровых и зафиксированных клеток, но и на каждой из этих групп по отдельности. Это позволяет проверить как действие глютаральдегида – фракция зафиксированных клеток должна давать дифракционные картины с круговой симметрией, - так и работоспособность моделей, предложенных в диссертации.
На рисунке 24 показаны дифракционные картины и линии изоинтенсивности, соответствующие одному и тому же образцу крови, в котором отношение фиксированных и здоровых клеток равно соответственно 0%, 20%, 50%, 100%.
Отметим, что ПЗС матрица современных камер обычно снимает не всю дифракционную картину, а некоторый её фрагмент – на малых выдержках лучше прорисовывается центральная самая яркая область, а на больших выдержках можно измерять периферию картины. Поэтому само угловое распределение интенсивности достаточно сложно корректно заснять и оцифровать в силу того, что матрицы могут работать в нелинейном режиме, обладают малым динамическим диапазоном и т.д. Однако даже самые дешёвые камеры позволяют измерять линии изоинтенсивности – даже если матрица применяет нелинейную аппаратную функцию к входному сигналу, она всё равно остаётся монотонной и корректно измеряет координаты пикселей с некоторой постоянной интенсивностью. Для сглаживания относительно малых случайных шумов был применён алгоритм бегущего среднего, описанный в нашей работе [58]. На рисунке 25 показана линия изоинтенсивности до и после применения алгоритма бегущего среднего.
В работе [60] был использован эктацитометр Л.А.Д.Э. [29], а в работе [64] -Реоскан [75] производства корейской фирмы Rheomed Tech. С помощью прибора Реоскан удалось измерить линии изоинтенсивности , лежащие почти в центре дифракционной картины. Сложность измерения состоит в том, что поскольку образец крови сильно разбавлен в прозрачной жидкости, значительная часть прямого лазерного луча проходит сквозь образец не рассеиваясь и не преломляясь. Прямой лазерный свет делает центральную часть изображения засвеченной и в приборах Реоскан и Л.А.Д.Э. закрывается непрозрачным экраном. Этот непрозрачный экран достаточно большой и закрывает часть изображения, на которой наблюдается линия изоинтенсивности с уровнем, равным половине центрального дифракционного максимума. Поэтому пришлось выбрать уровень интенсивности 0.4 от центрального максимума, см. рисунок 26. На рисунке 26 также проиллюстрирована работа алгоритма расчёта радиуса кривизны в полярных точках для данных натурного эксперимента.
Таким образом, было произведено сравнение параметров s,[i, v , рассчитанных исходя из контролируемых в эксперименте данных, в том числе исходя из процентного соотношения жёстких и свободных клеток, и аналогичных параметров, рассчитанных с применением оценок из утверждений 3.2 и 3.3. Количество различных образцов составило порядка 10. В среднем ошибка в определении 5,V ,Vv при помощи утверждений 3.2 и 3.3 составила приблизительно 10%, 20% и 30% соответственно. Квадратный корень из д и кубический корень из v были взяты для того чтобы определять ошибку физических, а не абстрактных математических параметров - корень из дисперсии непосредственно определяет ширину распределения частиц по удлинению, а l/v пропорционален коэффициенту асимметрии этого распределения.