Введение к работе
Актуальность проблемы.
Изучение механизмов возникновения и распространения нозокомиальных (госпитальных) инфекций является в настоящее время одной из актуальных проблем как теоретической медицины, так и практического здравоохранения. Одним из важных показателей, характеризующих такого рода инфекции, является резистентность бактериальных клеток к широкому кругу антибиотиков и химиотерапевтических средств, которые повсеместно используются для лечения в профилактических и лечебных учреждениях [Глатман Л.Н., 1979; Мельникова В.М., 1993; Навашин СМ., 1982; Покровский В.Н., 1988; Сидоренко СВ., 1992; Яфаев Р.Х., 1986; Lowbury E.J.S., 1981; Rubens С.Е., 1981.]
Согласно последним данным, [Влодавец В.В., 1993; Габисония Т.П., 1993; Коротяев А.И., 1988; Лившиц М.Л., 1992; Мороз А.Ф., 1988; Яфаев Р.Х., 1989; Maki D.G., 1981; Olexy V.M., 1982; Tantulavanich S., 1981; Tardif G., 1983.].в 50 - 80% случаев антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий обусловлена R-плазмидами, которые обнаружены более чем у 45 родов бактерий и способны нести устойчивость одновременно к 20 антибиотикам. Именно поэтому изучение структуры и свойств плазмидных ДНК представляет не только чисто академический интерес, но предполагает активное использование полученных знаний и в практическом здравоохранении.
Следует отметить, что необходимость разработки и внедрения методов получения и очистки плазмидных ДНК определяется возможностью использовать плазмидные ДНК в качестве эпидемиологического маркера для изучения процессов возникновения и распространения внутрибольничных инфекций в условиях клинического стационара.
Все вышеизложенное определило цель и задачи наших исследований.
Цель работы.
Целью настоящего диссертационного исследования является разработка наиболее оптимальных методов выделения и очистки плазмидных ДНК из клинических грамотрицательных условнопатогенных микроорганизмов для использования плазмид в качестве дополнительного эпидемиологического
маркера госпитальных инфекций. Задачи исследования.
-
Провести микробиологическую и биохимическую идентификации штаммов, выделенных от больных, находящихся в стационаре (Саратовский научно-исследовательский институт ортопедии и травматологии), определить чувствительность микроорганизмов к антибиотикам.
-
Выделить плазмидные ДНК из клинических штаммов микроорганизмов.
-
Разработать новые методы очистки плазмидных ДНК из клинических штаммов микроорганизмов.
4. Исследовать структуру и свойства плазмидных ДНК,
определить их молекулярную массу, провести
рестрикционный анализ некоторых плазмидных ДНК
выделенных из клинических штаммов.
Новизна исследований.
Впервые разработана модификация метода Бирнбойма-
Доли выделения плазмид из грамотрицательных
микрорганизмов, которая требует меньшего количества времени на процедуру выделения плазмидной ДНК из бактерий в сравнении с классическими методиками получения плазмидных
ДНК.
Также, впервые разработан и применен в исследовательской работе метод очистки плазмидных ДНК в большом количестве, пригодный для проведения рестрикционного анализа без привлечения таких дорогостоящих и длительных методических процедур как центрифугирование в градиенте хлористого цезия или препаративная хроматография.
Плазмидная ДНК, обнаруженная в клинических штаммах микроорганизмов, является своеобразным эпидемиологическим маркером, который может дополнить традиционные микробиологические и биохимические методы идентификации бактерий в стационарах. Исследование плазмидных ДНК, выделенных из клинических штаммов, позволит с большей достоверностью определять штаммы, вызывающие внутрибольничные инфекции.
Практическая значимость работы.
В условиях клинико-травматологического стационара выделены и исследованы плазмидные ДНК из
условнопатогенных грамотрицательных бактериальных штаммов, которые обнаруживаются у больных, находившихся на длительном лечении в стационаре.
В настоящей работе исследована молекулярная масса
плазмид, и доказана принципиальная возможность
использования плазмидных ДНК в качестве
эпидемиологических маркеров, выделенных из клинических штаммов микроорганизмов.
Разработанный нами метод выделения плазмидной ДНК внедрен в практику бактериологической лаборатории СарНИИТО от 27.09.00 года.
Зарегистрировано 2 рацпредложения от 25.03.99г. №№ 2326, 2327.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены:
на 58-й научной конференции молодых ученых и студентов СГМУ (Саратов, апрель 1997 г.);
- на 1-й городской конференции студентов и молодых
ученых «Молодежь и наука на пороге XXI века» (Саратов,
апрель 1998 года);
- на международной конференции «Molecular basis of
bacterial infection» (Греция, август - сентябрь 1998 год).
на межгородской конференции «Химия для медицины и ветеринарии» (Саратов, 1998 г.);
на юбилейной научной конференции молодых ученых и студентов СГМУ (Саратов, 1999 г.)
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной межкафедральной конференции кафедры биохимии СГМУ и группы геносистематики ИБФРМ РАН 4 апреля 2000 года.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Разработаны 2 рационализаторских предложения.
Структура работы.
Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и приложение. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 1 таблицей. Список литературы содержит 135 наименований, из них 53 отечественных и 82 иностранных источника.
Основные положения выносимые на защиту:
1. Разработаны > модификации методов выделения
плазмидных ДНК из клинических штаммов.
-
Разработан метод очистки плазмидных ДНК без применения центрифугирования в градиенте хлористого цезия или использования препаративной хроматографии.
-
Обнаружены плазмидные ДНК из клинических штаммов микроорганизмов и идентифицированы их молекулярные массы.
4. Обнаружены плазмиды, обладающие сходными
сайтами рестрикции, которые были выявлены в различных
штаммах микроорганизмов, выделенных в разные промежутки
времени от больных, находящихся на лечении в стационаре.
