Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Влияние физических нагрузок на состояние иммунной системы 12
1.1. Эффект регулярных интенсивных тренировок на клеточный состав иммунной системы 14
1.2. Семейство герпесвирусов 45
Глава II. Материалы, методы и организация исследования 54
Глава III. Оценка состояния клеточного звена иммунной системы в зависимости от уровня физической выносливости 60
3.1. Исследование исходного состояния клеточного звена иммунной системы в зависимости от уровня физической выносливости 62
3.2. Состояние клеточного звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов под воздействием физической нагрузки 71
3.3. Состояние клеточного звена иммунитета в период восстановления после физической нагрузки 82
Глава IV. Поиск иммунологических генов, активирующихся под воздействием физической нагрузки 86
Глава V. Изменение экспрессии генов активации цитотоксических клеток под воздействием физической нагрузки у высококвалифицированных спортсменов 90
Заключение 101
Выводы 104
Практические рекомендации 105
Список литературы 107
Акты внедрения 137
- Семейство герпесвирусов
- Материалы, методы и организация исследования
- Состояние клеточного звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов под воздействием физической нагрузки
- Поиск иммунологических генов, активирующихся под воздействием физической нагрузки
Введение к работе
Актуальность
Исследования последних лет показали, что при систематическом воздействии физических факторов именно иммунная система в первую очередь участвует в формировании адаптации организма (Суздальницкий Р.С. Левандо В.А., 1998), которая опосредуется через активацию клеток иммунной системы, несущих цитотоксический потенциал — цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+) и субпопуляции NK-клеток (CD 16+, CD56+). Первыми под влиянием различных стрессовых воздействий, в том числе и физической нагрузки, активируются NK-клетки.
На сегодняшний день данные о влиянии физической нагрузки на активационные показатели иммунной системы противоречивы. Так, некоторые исследователи обнаружили увеличение фагоцитарной и цитотоксической активности в результате спортивных тренировок (Tvede N.J., 1991) (Nieman D.C., 2000), однако в других работах показано, что физическая нагрузка не влияет на цитотоксическую функцию NK-клеток (Суздальницкий Р.С. 2003) (Nieman D.C., 1993) (Nieman D.C., 1998) (Nieman D.C., 1990). Поэтому представляется важным выявить особенности механизмов регуляции цитотоксической функции NK-клеток при физической нагрузке. Одним из актуальных направлений поиска маркеров активации является изучение экспрессионного профиля белков как рецепторного аппарата, так и функциональных белков, играющих значительную роль на начальных этапах активации NK-клеток.
Стоит отметить, что большинство работ по спортивной иммунологии направлено на изучение изменения параметров иммунной системы людей под воздействием физической нагрузки вне зависимости от уровня их спортивной квалификации и степени подготовленности. В немногочисленных работах, посвященных сравнительному анализу иммунологических параметров у спортсменов и неподготовленных людей, учеными высказываются различные
точки зрения. Так, в одних исследованиях показано, что пролиферация лимфоцитов в ответ на физическую нагрузку не отличается между этими двумя группами (Nieman D.C., 1995). В ряде других работ отмечается, что активность NK-клеток у более выносливых спортсменов выше, чем у нетренированных людей (Tvede N.J., 1991), хотя в других исследованиях полученные данные не подтверждаются (Baj Z., 1994) (Tvede N.J., 1991).
Значительное действие на активность цитотоксического потенциала оказывает наличие вирусной инфекции в организме (Lusso Р., 1993). Наиболее распространены латентные инфекции, вызываемые герпесвирусами, к которым относится вирус Эпштейн-Барр (ВЭБ, EBV) и вирус герпеса человека 6 типа (ВГЧ6, HHV6). В ряде исследований при изучении влияния наличия данных вирусов на показатели клеточного иммунитета отмечается увеличение количества клеток натуральных киллеров (NK-клеток) у спортсменов. С другой стороны, в некоторых работах описано значительное снижение количества клеток цитотоксического звена под воздействием интенсивных физических нагрузок у спортсменов-носителей ВЭБ (Gabriel Н.Н., 1998). При этом влияние вирусной нагрузки на состояние иммунитета в зависимости от уровня выносливости атлета не изучалось, хотя это является важным моментом для определения степени адаптации и восстановительной способности защитной системы организма спортсмена на протяжении его тренировочной деятельности.
Поэтому изучение состояния иммунной системы и механизмов регуляции цитотоксического потенциала в зависимости от уровня физической выносливости является актуальным для спортивной и восстановительной медицины.
Гипотеза
Адаптация к физическим нагрузкам у высококвалифицированных спортсменов приводит к изменению количественных и активационных показателей клеток цитотоксического звена иммунной системы.
Цель исследования
Разработка молекулярно-генетических диагностических критериев, характеризующих состояние цитотоксического звена иммунитета, для оценки адаптационных изменений организма высококвалифицированного спортсмена.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Оценить степень адаптационных изменений клеточного состава
иммунной системы под воздействием физической нагрузки у
высококвалифицированных спортсменов по сравнению с
нетренированными людьми.
Осуществить выбор генов, вызывающих активацию иммунной системы при физической нагрузке у спортсменов. Сравнить особенности динамики экспрессии генов, участвующих в активации цитотоксического звена иммунитета, у высококвалифицированных спортсменов и неподготовленных людей до и после физической нагрузки, а также в период восстановления после нее.
Разработать диагностические маркеры адаптации цитотоксического звена иммунной системы на молекулярно-генетическом уровне у высококвалифицированных спортсменов на основании полученных данных.
Объект исследования
Механизмы иммунного реагирования на клеточном и молекулярно-генетическом уровнях у высококвалифицированных спортсменов.
Предмет исследования
Состояние клеточного звена иммунной системы и экспрессии генов белков, регулирующих активацию цитотоксического звена иммунной системы под воздействием физической нагрузки.
Научная новизна
В работе изучены различия состояния цитотоксического звена иммунной
системы между высококвалифицированными спортсменами и
нетренированными людьми. Выявлено, что увеличение содержания цитотоксических клеток (цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки) при физической нагрузке не зависит от уровня физической подготовленности. Описано влияние вирусной нагрузки на адаптацию цитотоксического звена иммунной системы при физической нагрузке и степень восстановления после нее у высококвалифицированных спортсменов.
Впервые изучены особенности иммунного реагирования на молекулярно-генетическом уровне у высококвалифицированных спортсменов до, после физической нагрузки и в период восстановления после нее. Выявлены изменения активности генов иммуноглобулинподобных рецепторов (KIR), функциональных белков перфорина 1 (PRF1) и гранзима В (GZMB) клеток, играющих значительную роль в развитии цитотоксического потенциала.
Определены прогностически значимые параметры цитотоксического звена иммунной системы, характеризующие высокую степень адаптации к физическим нагрузкам спортсменов.
Теоретическая значимость
Результаты исследования расширяют знания о влиянии интенсивной физической деятельности на протяжении нескольких лет на состояние иммунной системы. Показано, что иммунологические показатели являются информативными критериями для оценки физической подготовленности спортсмена. В работе найдены количественные и активационные маркеры
цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированного спортсмена, что позволяет определить степень его адаптации к физической нагрузке, необходимой для поддержания здоровья атлета и повышения результативности спортсменов на соревнованиях.
Практическая значимость
Практическая значимость работы заключается в разработке молекулярно-
генетических диагностических маркеров, характеризующих адаптационные
изменения цитотоксического звена иммунной системы у
высококвалифицированных спортсменов.
Оценка экспрессии иммунологических генов необходима при разработке новых подходов к мониторингу состояния организма спортсмена в процессе тренировки и периода восстановления после нее.
Указанные в работе подходы могут быть использованы для коррекции учебно-тренировочного процесса атлетов и оценки степени их подготовленности к соревнованиям.
Материалы исследования могут быть использованы в преподавании медико-биологических дисциплин в высших учебных заведениях, на семинарах и курсах повышения квалификации врачей спортивной медицины, тренеров и врачей команд.
Результаты исследования внедрены в работу кафедры физического воспитания и спорта Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и ООО «Союз биатлонистов России», что подтверждено актами о внедрении.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Под воздействием физической нагрузки у спортсменов увеличивается количество лейкоцитов за счет лимфатического звена в отличие от нетренированных людей, у которых повышается содержание сегментоядерных нейтрофилов.
Высококвалифицированные спортсмены демонстрируют низкий базальный уровень экспрессии генов иммуноглобулинподобных рецепторов (KIR), перфорина 1(PRF1) и гранзима В (GZMB), ответственных за развитие цитотоксического ответа, по сравнению с нетренированными людьми.
Физическая нагрузка приводит к усиленной активации экспрессии генов KIR, PRF1 и GZMB. Выявлены достоверные различия в усилении экспрессии генов KIR2DL3, KIR2DS2, PRF1 между группой высококвалифицированных спортсменов и группой неподготовленных людей.
4. В период восстановления у высококвалифицированных спортсменов
продолжается активация цитотоксического звена иммунной системы по
генам KIR, PRF1 и GZMB, а у нетренированных людей стремится к
исходному уровню, кроме генов рецепторов KIR2DL2 и KIR2DS2.
Семейство герпесвирусов
Семейство герпесвирусов включает в себя более 70 видов. Для человека патогенными являются восемь: вирус простого герпеса 1 и 2 типов, вирус ветряной оспы, вирус Эпштейн-Барр, цитомегаловирус, вирус герпеса человека 6, 7, 8 типов (Bornkamm G.W., 2001). Вирус Эпштейн-Барр (ВЭБ, EBV)
Вирус Эпштейн-Барр - это широко распространенный герпесвирус. ВЭБ был впервые описан в 1964 году Epstein, Achong и Barr при электронной микроскопии культуры лимфобластов, полученных у больных лимфомой Беркитта. В 1968 году установлена взаимосвязь между ВЭБ и инфекционным мононуклеозом. В дальнейшем были проведены продолжительные исследования на студентах-добровольцах Иельского университета, где была подтверждена этиологическая роль ВЭБ в развитии инфекционного мононуклеоза (Tattevin Р., 2006).
На основе морфологических признаков данный вирус был отнесен к семейству herpesvirus. ВЭБ относится к подсемейству Gammaherpesvirinae роду Gimphcryptovirus (Заблоцкая С.Г., 2002).
Строение вируса Вирус Эпштейн-Барр - это ДНК-содержащий вирус. Вирион имеет форму сферы диаметром 180 нм (Buisson М., 1999). Геном вируса состоит из 186000 пар оснований (п.о.) (Hess R.D., 2004). Вокруг расположен капсид икосаэдрической формы. Капсид покрыт тегументом и липидной мембраной, которая содержит 12 гликопротеинов (рис. 5).
Данные гликопротеины делятся на две группы. Первая группа ответственна за взаимодействие вируса с клеткой-мишенью, проникновение его в клетку. Вторая - это структурные белки. Основными белками-антигенами ВЭБ являются: мембранный антиген (МА), капсидный антиген (VCA), ранний антиген (ЕА) и ядерный антиген (EBNA). Существует два типа ядерного антигена — EBNA-1, EBNA-2. Одна из функций EBNA - образование эписомальной формы вирусной ДНК. Ядерный антиген экспрессируется внутри клеток при латентном состоянии вируса. Взаимодействие вируса с клеткой-мишенью
ВЭБ имеет тропность к эпителию слизистых (Pegtel D.M., 2004) и В-лимфоцитам (Molesworth S.J., 2000). При попадании вируса в организм происходит заражение слизистого эпителия с последующим или, возможно, одновременным заражением лимфоцитов. Существуют определенные различия в инфицировании эпителиоцитов и лимфоцитов. В эпителиоцитах вирус проходит полную репликацию с образованием большого количества
вирионов, лизисом эпителиоцитов и высвобождением вирионов во внеклеточное пространство с последующим заражением соседних клеток. При инфицировании В-лимфоцитов лишь в небольшом проценте лимфоцитов активно продуцируется вирус, в остальных клетках вирус находится в латентном состоянии (Блохина Е.Б., 2003). Пути передачи ВЭБ
ВЭБ передается в основном воздушно-капельным путем через слюну. При этом передаются вирусные частицы и/или зараженные клетки эпителия ротовой полости, содержащие вирус. ВЭБ крайне неустойчив во внешней среде, следовательно, заражение возможно только при прямом контакте. В англоязычной литературе инфекционный мононуклеоз, острая форма ВЭБ-инфекции, имеет другое название: «kissing disease» («болезнь поцелуев»). Описаны случаи заражения при переливании крови, трансплантации органов, также замечен половой путь передачи (Блохина Е.Б., 2003). Предполагается также трансмиссивный путь передачи вируса на основе территориального совпадения «лимфоидного пояса» (эндемичные районы по распространению лимфомы Беркитта) с зоной распространения некоторых комаров и москитов рода Anophelesu Monsonia (Центральная Африка и Папуа Новая Гвинея) (Заблоцкая С.Г., 2002). Эпидемиология
Почти 90% взрослого населения мира поражены данным вирусом. Чаще ВЭБ встречается в странах с неудовлетворительной санитарной ситуацией. В развивающихся странах практически все детское население к возрасту 3 лет уже инфицировано. Эпидемиологические исследования в США показали, что у детей до 5 лет инфицированность составляет 50%, а у взрослых 80%.
Источником вируса является больной человек или носитель, вирус выделяется со слюной в продромальном периоде, в разгар заболевания и реконвалесценции в срок до 6 месяцев. Заболевание малоконтагиозно за счет наличия большого числа иммунокомпетентных лиц (Заблоцкая С.Г., 2002) (Straus S.E., 1993). Назофарингиальная карцинома распространена на юге Китая, изолированные группы встречаются в Исландии, на Аляске, Малайзии и в Африке. У мужчин заболевание встречается чаще, чем у женщин.
Заболевания, связанные с вирусом Эпштейн-Барр Инфекция, вызываемая ВЭБ, характеризуется разнообразием клинических проявлений. Инфицирование обычно происходит в детском или подростковом возрасте. Основными заболеваниями, ассоциированными с ВЭБ являются инфекционный мононуклеоз (ИМ), назофарингиальная карцинома, лимфома Беркита (Заблоцкая С.Г., 2002).
Первичная инфекция у детей в большинстве случаев протекает бессимптомно или проявляется в виде инфекционного мононуклеоза (фарингит и тонзиллит, лихорадка, головная боль, увеличение периферических лимфатических узлов, и гепатоспленомегалия). Течение инфекционного мононуклеоза может быть как в виде кратковременной лихорадки, так и длительного тяжелого заболевания. В крови помимо общих признаков инфекции выявляются атипичные мононуклеары (Т-лимфоциты, специфичные к ВЭБ) (Wallace L.E., 1982).
Материалы, методы и организация исследования
Диссертационная работа состоит из четырёх этапов. I этап: Определение антропометрических и физиологических (уровень максимального потребления кислорода - МІЖ) данных, сбор анамнеза (иммунологического, аллергологического) у всех обследуемых. Разделение на группы по уровню физической выносливости на основании показателя МІЖ. II этап: Исследование состояния клеточного иммунитета и, в частности, цитотоксического звена у испытуемых до, после физической нагрузки и в период восстановления. III этап: Исследование профиля иммунологических генов, отбор наиболее активно экспрессирующихся генов под воздействием физической нагрузки. Определение уровня экспрессии отобранных генов в зависимости от уровня физической выносливости под воздействием физической нагрузки и в период восстановления после неё. IV этап: Проведение статистического анализа данных. Материалы и методы для I этапа исследования В исследовании приняли участие 12 высококвалифицированных спортсменов, специализирующихся в циклических видах спорта более 5 лет. В качестве контрольной группы выступали 7 юношей с обычным уровнем физической активности. Антропометрические и физиологические данные испытуемых представлены в таблице 1. Перед участием в эксперименте все испытуемые дали информированное согласие. Протокол эксперимента одобрен этическим комитетом ФГУ ВНИИФК. Для оценки степени подготовленности к физической нагрузке определяли уровень максимального потребления кислорода (МІЖ) каждого участника. За неделю до исследования проводили тест до отказа, со ступенчато повышающейся мощностью на беговой дорожке Venus (h.p.Cosmos, Германия). Для оценки состояния здоровья спортсмена разработана анкета, представленная на рисунке 7. В качестве модельной нагрузки использовали 30-минутный бег на 80% от МІЖ. Забор крови проводили до начала нагрузки (ТІ), сразу после окончания теста (Т2) и через час отдыха после окончания теста (ТЗ). Выделение периферических мононуклеаров проводили с помощью разделения клеток на градиенте плотности фиколла «Histopaque-1077» (Сигма, США). Осадок лейкоцитов отмывали два раза однократным фосфатно-солевым буфером. Иммунофенотипирование проводилось на проточном цитофлюориметре FACScan Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием комбинации меченных флуоресциин изотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ) моноклональных антител к дифферецировочным маркерам («Сорбент», Россия): CD3 (FITC), CD4 (РЕ), CD8 (РЕ), CD 16 (FITC), CD56 (РЕ), CD 19 (FITC). Для анализа использовался лимфоцитарный гейт по фронтальному и боковому светорассеиванию. Анализ результатов проводился в программе CELLQuest Pro (Becton Dickinson, США). Выявление наличия вирусной инфекции Определение наличия вирусов проводилось с помощью иммуноферментного метода с определением концентрации антител к вирусам Эпштейн-Барр и герпесу 6 типа: «ВектоВЭБ - NA - IgG»; «ВектоВЭБ - VCA - IgM»; «ВектоВЭБ - ЕА - IgG»; «ВектоВГЧб - IgG» («Вектор-Бест», Россия). Также проводилось определение наличия ДНК вирусов в крови испытуемых с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Выделение РНК проводили с помощью набора PaxGene Blood RNA kit (PaxGene, США) по протоколу производителя. Выход очищенной нефрагментированной РНК (RIN 8) составил около 100 нг/мкл. Скриннинговый анализ экспрессии генов проводили с использованием микрочипов Human GeneChip STl.O (Affymetrix, США). Выделенная РНК использовалась в качестве матрицы для синтеза комплиментарной цепочки ДНК (кДНК), часть которой была использована для синтеза биотин-меченной кДНК. После фрагментации биотинилированная кДНК наносилась на микрочип HuGene 1.0 ST Array, который инкубировали в течение 16 ч в гибридизационной печи при температуре 45С. Затем проводили отмывку микрочипов от несвязавшейся кРНК и окрашивали стрептавидин-фикоэритрином на станции Fluidics Station 450 (Affymetrix, США). Окрашенные чипы сканировали на сканере GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix, США). Оценку качества гибридизации, отмывки и окрашивания чипов производили с помощью программного пакета Gene Expression Console (Affymetrix). Все внутренние контроли на чипах соответствовали нормам, указанным производителем.
Состояние клеточного звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов под воздействием физической нагрузки
Для оценки влияния 30-минутной аэробной физической нагрузки проводили сравнительный анализ показателей клеточного иммунитета непосредственно после нагрузки у высококвалифицированных спортсменов (N=12) и в группе контроля, представленной юношами с обычным уровнем физической активности (N=7), относящихся к одной возрастной группе и не отличающихся по половому признаку.
Исследование лейкоцитарной формулы. В работе изучено количественное соотношение популяций лейкоцитов под воздействием физической нагрузки. В таблице 10 представлены результаты исследования мазка крови.
В ответ на физическую нагрузку выявлено повышение количества лейкоцитов (Табл. 10) по сравнению с исходным уровнем на 25,9% в группе спортсменов и на 27,3% в группе контроля. Полученные данные свидетельствуют об усилении работы иммунной системы в ответ на физическую нагрузку независимо от уровня подготовленности спортсменов.
При этом повышение лейкоцитов у спортсменов осуществлялось за счет повышения количества клеток лимфоцитарного звена, тогда как в группе контроля -за счет нейтрофильного. (Табл. 10).
Следует отметить, что по сравнению с исходным уровнем относительные показатели лимфоцитов увеличились на 6% в группе спортсменов, тогда как в группе контроля остались на том же уровне (37,1% - ТІ и 38,6% - Т2). Нейтрофильное звено у спортсменов снизилось почти на 10% по сравнению с показателями в покое, а в группе контроля осталось на прежнем уровне (Табл. 5, 10).
Таким образом, отмечается влияние физической подготовленности на процентное соотношение клеточного состава. У спортсменов с высокими показателями МПК наблюдается перераспределение лейкоцитарного состава: преобладание лимфоцитарного звена над нейтрофильным. Не обнаружено изменений соотношения популяций лейкоцитов у неподготовленных людей при физических нагрузках.
Судзиловским выявлено, что наибольшее повышение лимфоцитарного звена иммунной системы по сравнению с нейтрофильным свидетельствует о том, что нагрузка была адекватной и спортсмен к ней хорошо адаптирован (Судзиловский Ф.В., 1999)
Не выявлено изменений в состоянии других популяций лейкоцитов: моноцитов, эозинофилов и палочкоядерных нейтрофилов (Табл. 10).
Исследование лимфоцитарных популяций. Подробное исследование лимфоцитарных популяций показало, что относительные показатели в двух исследуемых группах не отличаются между собой.
Обнаружены значительные различия в абсолютном содержании клеток между спортсменами и группой контроля. У спортсменов наблюдается повышенные показатели по сравнению с группой контроля. Так же как и в исходных значениях выявлены достоверные отличия в популяции Т-лимфоцитов за счет значительных отличий Т-хелперов (Табл. 11).
Таким образом, физическая нагрузка не приводит к изменению соотношения лимфоцитарных популяций между исследуемыми группами. Это свидетельствует о стабильности иммунного ответа под воздействием спортивных тренировок.
При детальном рассмотрении количественных изменений в каждой группе замечены некоторые сдвиги в количественном соотношении популяций лимфоцитов. Физическая нагрузка приводит к снижению уровня относительных показателей в основных популяциях лимфоцитов (Т- и В-клетки). Стоит отметить, что в группе спортсменов наблюдается большее снижение популяций лимфоцитов CD3+ за счет значительного уменьшения CD3+CD4+ на 12,4%, по сравнению с группой контроля, в котором снижение составило только 3,8%. Уровень относительных показателей CD 19+ лимфоцитов практически не изменился в результате нагрузки (Рис. 10).
Исследование иммунорегуляторного индекса. В работе также изучен иммунорегуляторный индекс (CD3+CD4+/CD3+CD8+), который дает важную информацию о состоянии иммунитета человека, поскольку его снижение свидетельствует о развитии или наличии иммунодефицитного состояния. Соотношение Т-хелперов к Т-супресорам более объективно отражает направленности иммунорегуляторных процессов, нежели изолированные показатели обоих субпопуляций Т-клеток.
После рассмотрения количественных изменений клеточных популяций под воздействием 30-минутной аэробной физической нагрузки было выявлено, что физическая нагрузка приводит к сдвигу иммунорегуляции по Т-1 хелперу типу иммунного ответа (ИРИ 1,5) в обеих исследуемых группах. При этом наиболее глубокое снижение отмечено в группе контроля (Рис. 11), что характеризует более сильное увеличение относительных показателей CD3+CD8+ по сравнению с CD3+CD4+ клеток. Снижение иммунорегуляторного индекса обычно расценивают как признак грубых нарушений в клеточном звене иммунной системы, приводящих к иммуносупрессии, однако в исследовании не наблюдается истощения количественных запасов клеток лимфоцитов. Поэтому полученные данные подтверждают теорию о более высокой активации цитотоксического звена, в данном случае CD3+CD8+ клеток.
Поиск иммунологических генов, активирующихся под воздействием физической нагрузки
Известно, что неспецифическое звено иммунитета первым реагирует на физическую нагрузку. Наибольшие изменения происходят в цитотоксическом звене, главную роль в котором играют клетки натуральных киллеров (NK-клетки). В работе изучена динамика экспрессии генов, кодирующих белки, ответственные за активацию NK-клеток и их цитотоксической функции.
С помощью алгоритма I/NI из имеющихся на чипе 28869 РНК была отобрана 761, вариация которых обусловлена биологическими причинами. Для поиска дифференциально экспрессированных генов с помощью библиотеки limma (2005) была рассчитана моделируемая t-статистика. При FDR O.OS (поправка Бенжамини-Хохберга) и изменении люминисценции не менее чем в 1.3 раза были получены 104 дифференциально экспрессируемых мРНК.
По данным базы KEGG (http://www.genome.jp/kegg/pathway.htmn, были отобраны 10 дифференциально экспрессированных иммунологических генов, отвечающих за активацию цитотоксического ответа неспецифического звена иммунной системы (табл. 1). Это гены, кодирующие KIR: KIR2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1, 2DS4, 2DS1, гены субъединиц рецепторов IL2 (IL2RB) и IL-18 ассоциированный белок (IL18RAP, interleukin 18 receptor accessory protein) и гены функциональных белков - гранзим В (granzyme В, GZMB) и перфорин 1 (perforin, PRF1) (табл. 13).
Наиболее сильные изменения в экспрессии наблюдаются в генах KIR рецепторов, участвующих в регуляции активации NK-клеток. В зависимости от длины цитоплазматического домена KIR обладают ингибиторными (длинный цитоплазматический домен - KIR2DL1, 2DL3, 2DL2, 3DL1) или активационными (короткий домен - KIR2DS4, 2DS1) свойствами (Cheent К., 2009); (Middleton D., 2002); (Kroemer G., 1998). Изменения активации экспрессии обоих типов рецепторов находятся примерно на одном и том же уровне, что может быть следствием влияния различных стимуляционных факторов на активацию NK-клетки.
Основными триггерами для активации NK-клеток являются цитокины: IL-2, IL-12, IL15, IL18 (Caligiuri М.А., 2008). Они стимулируют пролиферацию и созревание клеток, а также их цитотоксическую функцию. В нашем исследовании замечено увеличение транскрипционной активности генов IL2RB и IL18RAP (табл.1). Известно, что их экспрессия значительно усиливается под влиянием IL2 (Dybkaer К., 2007), поэтому было изучено изменение концентрации IL2 в сыворотке испытуемых и обнаружено его повышение после нагрузки (р=0.008 0.05, критерий Манна — Уитни) (рис. 17).
Таким образом, усиление экспрессии генов рецепторов интерлейкинов и KIR является одним из показателей активации NK-клетки.
Известно, что стимуляция KIR рецепторов, как ингибиторных, так и активационных, через ряд посредников обеспечивает развитие функционального ответа NK-клетки, проявляющийся в выбросе цитокинов (INFy, TNFa, GM-CSF) (Cheent К., 2009), активирующих клеточное звено иммунитета, и синтезе цитотоксических молекул - гранзимов и перфоринов (Cullen S.P., 2008).
Так для образования цитокинов в NK-клетке в качестве одного из главных посредников выступает молекула SLP-76, которая путем фосфорилирования запускает механизм транскрипции генов цитокинов. Известно, что экспрессия РНК SLP-76 также находится под контролем IL-2 (Hodge DL 2002). Однако, в нашей работе изменение транскрипционной активности гена SLP-76 не обнаружено (Vivier Е., 2004).
Активация синтеза цитотоксических молекул осуществляется путем взаимодействия активационных рецепторов с молекулой DAP 12, которая связывается с киназой ZAP-70 (зета цепь, связывающий белок 70 кДа), что приводит к фосфорилированию остатка тирозина эффекторной молекулы LAT (линкер для активации Т-лимфоцитов), способного активировать выброс перфоринов и гранзимов (Vivier Е., 2004). В работе не было выявлено изменение экспрессии генов DAP 12, ZAP-70 и LAT. Хотя, замечено усиление транскрипционной активности цитотоксических молекул (гранзимы, перфорины) (табл.1), которое может быть также стимулировано IL-2 (Janas M.L., 2005). Основное действие гранзимов направлено на индукцию апоптоза и обеспечение лизиса клетки-мишени путем быстрой фрагментации её ДНК. Для реализации функций гранзимов необходимо обеспечить их проникновение в клетку-мишень (Cullen S.P., 2008). Ключевую роль в этом процессе играют перфорины, также содержащиеся в гранулах NK-клеток. При высвобождении перфоринов происходит встраивание их в мембрану клетки мишени и полимеризация с образованием трансмембранного канала. Предполагается, что через этот же канал внутрь клетки-мишени попадают гранзимы, которые и обеспечивают лизис клетки-мишени.
Стоит отметить, что наблюдаемое усиление экспрессии KIR рецепторов и цитотоксических молекул, может быть следствием увеличенного количества NK-клеток после физической нагрузки. Однако отсутствие изменения транскрипционной активности вторичных посредников в данных клетках может являться маркером истинной активации экспрессии рецепторного аппарата и функциональных белков.
Таким образом, физическая нагрузка приводит к значительному усилению активационных маркеров цитотоксических клеток, которые принимают участие в развитии цитотоксического потенциала. Это свидетельствует о запуске в иммунных клетках адаптационных процессов в ответ на физическую нагрузку.
Поэтому для дальнейшей работы были отобраны 5 генов, наиболее сильно изменяющихся под действием физической нагрузки и отражающие работу NK-клеток: KIR2DL3, KIR2DL2, KIR2DS2, PRF1 и GZMB.
