Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема боли является одной из самых актуальных и трудных проблем медицины и биологии, в частности восстановительной медицины. Изучение и объяснение иммуногенетических механизмов аку-пунктурной анальгезии с позиции современных данных о нейрональных и нейрохимических процессах организации и центральной интеграции «болевого потока», роли эндогенных антиноцицептивных систем в регуляции болевой чувствительности, а также нейрохимических механизмов опиатной и стимуляци-онной анальгезии, опиатньгх рецепторов и их эндогенных лигандов (нейропеп-тидов) важны для понимания этих процессов и поиска новых возможностей в борьбе с болью.
Ранее сообщалось, что метионин-энкефалиновая иммунореактивность (MEK-IR) и лейцин-энкефалиновая иммунореактивность (LEK-IR) в спинном мозге крыс после акупунктуры были ослаблены, из-за акупунктурной стимуляции высвобождения МЕК и LEK из спинного мозга, с обезболивающим эффектом (Han J. S.; 1984. Fei H., 1986.). В другом эксперименте также показано, что акупунктура может вызывать генную экспрессию c-fos и препроэнкефалина (ppENK) в хромаффинных клетках надпочечников крыс (Lieu F. Y., 1997).
Имеются сведения о том, что глия может играть более активную роль в си-наптической функции и механической анальгезии, продуцируемой периферическими повреждениями, и в спинальной глии была обнаружена экспрессия ин-дуцибельной синтазы окиси азота (iNOS) матричной РНК (mRNA) (Meller ST, 1994; McMicking J, 2002). Связь между акупунктуры и генной экспрессией iNOS, а также связь между эффектом акупунктуры и генной экспрессией c-fos, ppENK и iNOS в спинном мозге мышей до сих пор не освещена. Более того, нет сообщений об эффекте акупунктуры на MEK-IR и динорфиновую иммунореактивность (Dyn-IR) спинного мозга мышей.
Макрофаги - это один из видов иммунокомпетентных клеток, играющих важную роль в специфическом и неспецифическом иммунитете. Они способны высвобождать различные биологические медиаторы, включая нейротрансмит-теры и цитокинины. (Nobel С. S.,1995; Zurawski G., 1986). Кроме того, макрофаги возбуждают рецепторы для МЕК и Dyn, и могут высвобождать биологиче-
РОС НХЦИОНдЛЬІІЛЗІ
БИЬЛИОТГКЛ
С Петербург j
sooj'pk j
ски активные медиаторы, включая МЕК и Dyn (Weisinger G., de Cristofaro D., 1992; CuiX., 2003).
В проводимых ранее экспериментах было обнаружено воздействие акупунктуры на регуляцию макрофагов iNOS генной экспрессии (Guo, 1997; Ji RR, Zhang Q, Han JS., 1993), но о влиянии акупунктуры на макрофаги MEK-IR и Dyn-IR мышей не сообщалось, поэтому представляется актуальным выяснить возможности акупунктуры активировать генную экспрессию c-fos, ppENK и iNOS макрофагов.
Акупунктура может усиливать трансформацию лимфобластов, бактерицидные функции PMN и цитотоксичность NK (Cui X., 1995; Wang Н., 1995; Sun W., 1996; McMicking J., 2002). В предшествующих работах было обнаружено, что Е-розетки особенно активные, трансформация лимфобластов, а-нафтил-ацетат-эстераза (ANAE) фокальный паттерн лимфоцитов, Т4 субпопуляция и циркулирующие лимфоциты с метионин-энкефалин иммунореактивностью и их рецептор MEK-IR могут увеличиваться в акупунктурной группе; и лимфоциты с активным MEK-IR так же проявляли ANAE фокальный паттерн (Cui X., 1995; McMicking J., 1997; de Vera M E., 1996; Garcion E., 2001). Влияние акупунктуры на надрегуляцию генной экспрессии ppENK и c-fos у крыс также изучалось в предыдущих исследованиях. Генная экспрессия c-fos и ppENK в ассоциации с MEK-IR и Dyn-IR в мышиных лимфоцитах до сих пор не изучалось. Установлено, что электропунктура частотой 2 ГЦ может приводить к высвобождению МЕК, в то время как электростимуляция 100 Гц ассоциирована с выбросом ди-норфина в спинномозговую жидкость пациента (Martin J., Del Pozo V., 1997; Yokoyama M., 1996; Kwon O.J., 1997). Сообщений по изучению уровня MEK-IR и Dyn-IR в плазме пациентов нами не было найдено. Влияние акупунктуры на генную экспрессию c-fos и ppENK в мышиных лимфоцитах исследовалось с помощью situ гибридизации, РНК дот блоттинга; иммунореактивность Dyn и МЕК в мышиных лимфоцитах и плазме пациентов исследовалась нами методами иммуногистохимии и протеин дот блоттинга.
Цель исследования: выявить закономерности влияния анальгезии, вызванной методом электроакупунктуры, на экспрессию генов и иммунореактивность.
Задачи исследования:
-
Выяснение значимости iNOS/NO, как функционального маркера макрофагов, макрофагальные/лимфоцитарные c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR взаимосвязи со спинальной iNOS, c-fos, ppENK и экспрессией МЕК и Dyn в нейроиммуномодуляции.
-
Изучение роли опиатной системы в обезболивании и ее зависимости от электроакупунктурного влияния.
-
Вьивление взаимосвязи между генной экспрессией МЕК и ppENK, c-fos и iNOS в перитонеальных макрофагах.
-
Выявление взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK в спинном мозге и иммунных клетках, и разрешение существующих в этом вопросе противоречий.
-
Изучение влияние акупунктуры на генную экспрессию c-fos и ppENK в ассоциации с MEK-IR и Dyn-IR в мышиных лимфоцитах.
-
Изучение влияние акупунктуры на уровень MEK-IR и Dyn-Ir в плазме пациентов.
Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые выявлена и доказана взаимосвязь между анальгетическим эффектом и генной экспрессией c-fos, ppENK, iNOS и экспрессией МЕК и Dyn в спинном мозге и иммунных клетках, что свидетельствует о системных эффектах акупунктурной анальгезии.
Впервые исследовано влияние акупунктуры на генную экспрессию спинальной iNOS, и доказана возможность 5 Гц электроакупунктуры надрегулиро-вать генную экспрессию iNOSmRNA, в основном, локализованную в астроцитах; c-fosmRNA - локализованную в III-V VII слоях спинного мозга.
Впервые обнаружена позитивная корреляция в альтерации между c-fosmRNA и ppENKmRNA и между c-fosmRNA и iNOSmRNA, iNOS активностью, и выявлено легкое повышение генной экспрессии ppENKmRNA, локализованной в поверхностном слое спинного мозга.
В результате проведенного исследования выяснено, что iNOS/NO, как функциональный маркер макрофагов, макрофагальные/лимфоцитарные c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR имеют взаимосвязь со спинальной iNOS, c-fos, ppENK и экспрессией МЕК и Dyn в нейроиммуномодуляции.
Проведенное исследование выявило наличие межсистемной взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK в спинном мозге и иммунных клетках. Экспрессия ppENKmRNA в спинном мозге следовала за экспрессией c-fosmRNA, предполагая, что для генной экспрессии спинальной ppENK может требоваться новопротеин, как трансактиватор, в то время как c-fosmRNA и ppENKmRNA мышиных макрофагов и лимфоцитов показали одинаковую интенсивность сигналов экспрессии. Доказано, что фосфорилированная CREB может являться трансактиватором экспрессии обоих генов в иммунных клетках, и что существуют различия экспрессии в спинном мозге и иммунных клетках.
Научно-практическая значимость исследования. Проведенное исследование позволило разрешить существующие в современной литературе противоречивые данные о взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK в спинном мозге и иммунных клетках.
Выявлена четкая позитивная корреляция между надрегуляцией генной экспрессии c-fos и ppENK, сопровождающаяся выраженным анальгетическим эффектом, доказывающая наличие взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK и участие c-fos в транскрипции ppENKmRNK.
Кроме того, показано, что Dyn-IR циркулирующих-лимфоцитов был выше в электроакупунктурной группе в сравнении с контрольной, позитивно коррелируя с сигналами c-fosmRNA и ppENKmRNA, это объясняется тем, что c-fos протеин может вовлекаться в транскрипцию как ppD, так и ррЕ, и количество животных с активным лимфоцитарным Dyn-IR было выше, чем с активным лимфоцитарным MEK-IR. Результаты свидетельствуют о том, что при электростимуляции частотой 5 Гц высвобождение irDyn гораздо менее активно, чем irMEK.
Проведенное исследование позволило изучить взаимосвязи между анальгетическим эффектом и генной экспрессией c-fos, ppENK, iNOS и экспрессией МЕК и Dyn в спинном мозге и иммунных клетках. Нами было выяснено, что iNOS/NO, как функциональный маркер макрофагов, макрофагаль-ные/лимфоцитарные c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR имеют взаимосвязь со спинальной iNOS, c-fos, ppENK и экспрессией МЕК и Dyn в процессах нейроиммуномодуляции.
В настоящем исследовании доказана позитивная корреляция между возрастанием экспрессии iNOSmRNA и выраженной анальгезией при акупунктур-ной стимуляции, и то, что легкая периферическая травма может приводить к надрегуляции генной экспрессии iNOS в спинномозговой глии, которая может быть вовлечена в синаптическую функцию, приводящую к анальгезии, а позитивная корреляция между спинальной iNOSmRNA и c-fosmRNA, предполагает, что iNOS и c-fos гены могут иметь общие трансактиваторы.
Проведенное изучение влияния акупунктуры на регуляцию генной экспрессии iNOS и iNOS активности, позволило показать возможность данного метода лечения повышать резистентность (иммунный ответ) к болезням, при этом возрастающее количество высвобождающейся NO не повреждает ткани и клетки благодаря двухфазному регулирующему эффекту акупунктуры. Кроме того, стимулирующее воздействие электроакупунктуры на нейроиммуномоду-ляцию подтверждается в данной работе альтерацией МЕК и Dyn в спинном мозге и макрофагах.
В проведенном исследовании изменение уровня болевого порога использовалось как маркер эффективности акупунктуры, и полученные результаты подтвердили надежность этого способа визуализации и объективизации получаемых в процессе работы данных.
Апробация работы. Материалы исследований доложены на 12 научно-практических конференциях (из них 7 - Международных, 2 - Всероссийских, 1- региональной). Основные положения диссертации доложены и обсуждены на международном конгрессе «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994); VI международном конгрессе научной акупунктуры (Стамбул, 1994); симпозиуме «Акупунктура и ци» WFAS 95 (Стамбул, 1995); Первом конгрессе Европейской ассоциации акупунктуры (Бухарест, 1995); VII Международном конгрессе ICMART (Дания, 1996); Втором научном конгрессе «Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты» (Чебоксары, 1996); конгрессе "Традиционная медицина - 2000" (Элиста, 2000); Международном конгрессе ICMART (Эдинбург, 2002); 2ом Международном конгрессе интегративной медицины (Пекин, 2002); конференции «Актуальные вопросы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии» (Владикавказ, 2003).
Апробация осуществлена на заседании ученого совета ГУЛ НИИ новых медицинских технологий и кафедры внутренних болезней Тул ГУ (2005).
Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в практическую работу врачей ВМУУЗ городской поликлинике №1 и Республиканского центра восстановительной медицины и ребилитации, г.Владикавказа. Материалы исследования вошли в систему теоретической и практической подготовки врачей, слушателей кафедры медицинской реабилитации и физических методов лечения СОГМА, в работу отдела новых технологий и восстановительной медицины Института биомедицинских исследований ВНЦРАН и Правительства РСО-Алания, г.Владикавказа и в работу ГУЛ НИИ новых медицинских технологий (Тула).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 4 статьи в зарубежных журналах и 7 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на