Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
Молекулярно-клеточные аспекты старения эндотелия сосудов 14
1.2. Биологические эффекты электромагнитного излучения миллиметрового диапазона 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Характеристика исследуемого материала 46
2.2 Гистологический метод 46
2.3 Иммуноцитохимический метод 47
2.4 Культивирование клеток 48
2.5. Метод воздействия на культуры клеток электромагнитным излучением миллиметрового диапазона 49
2.6. Морфометрическое исследование и компьютерный анализ микроскопического изображения 50
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию сигнальных молекул в эндотелии при его старении in vitro 51
3.1. Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию эндотелиальной NO-синтазы в клетках эндотелия сосудов при старении 51
3.2. Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию эндотелина-1 в клетках эндотелия сосудов при старении 57
3.3. Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию ангиотензина-3 в клетках эндотелия сосудов при старении 62
3.4 Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию вазопрессина в клетках эндотелия сосудов при старении 67
3.5 Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию тромбомодулина (CD141) в клетках эндотелия сосудов при старении 72
3.6 Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию фактор роста эндотелия сосудов VEGF в клетках эндотелия сосудов при старении 76
3.7 Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию молекулы межклеточной адгезии ICAM - 1 в клетках эндотелия при старении 80
Заключение 85
Выводы 88
Практические рекомендации 89
Список литературы
- Биологические эффекты электромагнитного излучения миллиметрового диапазона
- Культивирование клеток
- Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию эндотелина-1 в клетках эндотелия сосудов при старении
- Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию тромбомодулина (CD141) в клетках эндотелия сосудов при старении
Биологические эффекты электромагнитного излучения миллиметрового диапазона
Высокая биологическая активность электромагнитного излучения миллиметрового диапазона была обнаружена ещё в 60-е годы 20-го века [Бецкий О.В., Лебедева Н.Н., 2003]. Многочисленные теоретические разработки и экспериментальные работы подтверждают, что ЭМИ ММД может играть определенную роль в биологических процессах [Бецкий О.В., Кислов В.В., Лебедева Н.Н., 2004].
Анализ данных литературы [Алексеев С.И., 2013; Гапеев А.Б.], показывает, что при действии ЭМИ ММД на уровне кожи формируются начальные стадии процессов, приводящих к нарушению синтеза и выделению биологически активных веществ. Среди структурных элементов кожи, способных оказывать потенциальное влияние на концентрацию регуляторных молекул в организме, выделяют нервные окончания, кровеносные капилляры, а также секреторные клетки.
По мнению ряда авторов нейроиммуноэндокринная система способствует переносу информации о начале облучения ЭМИ ММД в ряду факторов нейрогуморальной регуляции. Влияние данных факторов проявляется в реакции различных сигнальных молекул [Гапеев А.Б., Черемис Н.К., 2008].
В восприятии ЭМИ ММД на уровне организма в целом принмает участие комплексная нейрогуморальная система реагирования. После получени ЦНС сигналов о воздействии, поступающих через гипоталамо гипофизарный тракт, меняется функциональная активность желез внутренней секреции. При этом эфферентные нервные волокна могут напрямую воздействовать на активность функций внутренних органов [Бецкий О.В., Лебедева Н.Н., 2003]. По мнению А.Б. Гапеева (2006 ) механизм действия ЭМИ ММД связан с влиянием на кальций-зависимую внутриклеточную сигнализацию, которая чувствительна к изменению его концентрации. Она реагирует на рост уровня кальция выбросом гистамина, что запускает процесс дегрануляции тучных клеток, запускающих каскад реакций в организме в целом.
Возможное влияние ЭМИ ММД рассматривается в виде механизма воздействия на слабые электростатические связи, такие как гидрофобные или водородные. Им принадлежит одна из ведущих ролей в сохранении пространственной структуры биологических молекул и структур надмолекулярного уровня. ЭМИ ММД способны модифицировать путем влияния на слабые взаимодействия физико-химические свойства пептидов и липидов, прочность липопротеиновых комплексов, а также каталитические свойства ферментов [Запорожан В.Н., Реброва Т.Б., 1987].
При воздействии ЭМИ ММД организм вызывает ответную реакцию в виде различных кожно-висцеральных рефлексов и ответа со стороны адаптационно-приспособительных механизмов неспецифической природы. ЭМИ ММД, поглощенное кожными рецепторами, оказывает возбуждающее действие на вегетативную, эндокринную и имунную системы.
В ряде работ показаны ответы различных тканей, органов или систем органов на воздействие электромагнитного излучения крайне высокочастотного диапазона. При воздействии ЭМИ ММД наблюдается уменьшение экссудации и гиперемии в очаге воспаления, что свидетельствует об оказании противовоспалительнго действия. Также в периферической крови уменьшается фагоцитарная активность нейтрофилов. На местном уровне ЭМИ ММД индуцирует дегрануляцию тучных клеток на общесистемном уровне с участием как нервной, эндокринной так и иммунной систем организма [Гапеев А.Б.,2008].
В работах последних лет показано, что ЭМИ ММД нормализует биоэлектрическую активность мозга, снижая признаки дисфункции диэнцефального уровня. Оказывает гемостимулирующий, антиоксидантный и адаптирующий эффект при цитостатическом поражении органов и систем, улучшая при пробах с нагрузкой общую реактивность вегетативной нервной системы [Волин М.В.,2001; Бочкарева А.Г., 2002; Полина Ю.В., 2009].
Описаны разнообразные клинические эффекты ЭМИ ММД, в связи с чем, этот метод находит все более широкое распространение в различных областях медицины, в частности, для лечения болезней органов кровообращения, дыхания, пищеварения, опорно-двигательного аппарата, эндокринной и нервной систем [Полякова А.Г., 2004; Медведев Д.С., 2009].
В тоже время клеточно-молекулярные аспекты влияния электромагнитного излучения миллиметрового диапазона нуждаются в дальнейшем изучении и уточнении. Необходимо отметить, что живые организмы реагируют на все виды электромагнитных излучений, а характер биологической реакции определяется параметрами излучений. При облучении ЭМИ низкой интенсивности отмечаются преходящие функциональные изменения. При этом в первую очередь реагируют структуры центральной нервной системы и эндокринной системы, как более чувствительные. Менее чувствительные системы отвечают на воздействие отсроченными реакциями [Гапочка Л. Д., М.Г. Гапочка, А.Ф. Королев и др. 2000]. Важное значение приобретает индивидуальная чувствительность и исходное состояние организма, во многом определяющие меру ответной реакции, которая может оставаться в границах физиологической нормы или являться патологической.
Культивирование клеток
Установлено, что эндотелий влияет на сосудистый тонус опосредованно через освобождение сосудорасширяющих и сосудосуживающих факторов и модулирует сократительную активность гладкомышечных клеток [Orgaard O.S., Cantera L., Ander M., Edvinsson L. Endothelin, 1996]. Одним из мощнейших вазоконстрикторов, выделяемых эндотелием сосудов, является эндотелин-1, имеющий непосредственное отношение к регуляции тонуса коронарных сосудов, острой ишемии миокарда и возникающих как следствие сердечных аритмий.
Атеросклеротические повреждения венечных сосудов сопровождаются повышенным содержанием иммунореактивного эндотелина-1 (содержание в крови увеличено уже на ранних стадиях формирования гипертонической болезни). После повреждения ткани эндотелиновая система реагирует первой, резкое повышение уровня эндотелиина-1 в плазме является маркером активности процесса деструкции. Определена достоверная значимость эндотелинов в формировании рубца в ткани миокарда после инфаркта [Pintosietsma S.J., 1998]. При угрозе развития аневризмы и разрыва миокарда отмечается повышение уровня эндотелина - 1 в плазме. Эндотелин - 1 обладает широким спектром патологических эффектов, в частности, вызывает гипертрофию и гиперплазию различных клеток, пролиферацию фибробластов, избыточную продукцию внеклеточного матрикса, воспалительный процесс, продукцию вазоактивных веществ (простациклин, оксид азота, факторов, активирующих тромбоциты) [Haynes W.G., 1995]. Интенсивность экспрессии эндотелина – 1 может служить диагностическим маркером процессов инволюции, реорганизации и деструкции коллагенов и эластинов соединительной ткани рубца [Yammine L., Kang D.H., Baun M.M., Meininger J.C., 2014]. В «молодых» контрольных клеточных культурах показатель площади экспрессии эндотелина-1 составил 2,05±0,19%. Облучение в течение 5 мин. повышает уровень экспрессии эндотелина-1 в «молодых» клеточных культурах на 51,0%, что составляет 4,17±0,23%. При этом увеличение времени воздействия до 10 минут так же увеличивает уровень экспрессии в меньшей степени – до 2,63±0,1%. (рост на 23,0%). На протяжении всего времени воздействия ЭМИ ММД не оказывало достоверного влияния на показатель оптической плотности экспрессии. (рисунок 6). - р 0,05 по сравнению с контрольными показателями.
Воздействие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на площадь экспрессии эндотелина -1 в «молодых» культурах эндотелиоцитов сосудов. Рисунок 6. Воздействие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на оптическую плотность экспрессии eNOS в «молодых» культурах эндотелиоцитов сосудов.
В «старых» культурах клеток ЭМИ ММД оказывало сходное с «молодыми» культурами воздействие на клетки эндотелия. При 5-минутном воздействии уровень экспрессии эндотелина-1, как и в «молодых» культурах клеток, увеличился на 72,0% и составил 3,96±0,09%. (рисунок 7). При этом увеличение времени до 10 минут так же увеличивало уровень экспрессии эндотелина-1 на 48% , и составило 2,12±0,16% .
При этом показатель оптической плотности экспрессии увеличился под действием 5-минутного воздействия ЭМИ ММД на 35,0%, его значение составило 0,26±0,03% и 0,17±0,03% в контрольной культуре клеток. Увеличение длительности воздействия до 15 мин. не проводило к росту показателя оптической плотности экспрессии у эндотелина-1.
Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию эндотелина-1 в клетках эндотелия сосудов при старении
Фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) обеспечивает васкулогенез путем дифференцировки мезенхимальных клеток-предшественников в гемангиобласты и их дальнейшей дифференцировки в эндотелиальные клетки (ЭК). Сосудистые эффекты VEGF включают стимуляцию миграции эндотелиальных клеток, их инвазию в базальную мембрану, пролиферацию, выживание и формирование фенестр, а также индукцию вазодилатации. VEGF необходим не только для формирования нормальных сосудов, но и для их созревания и выживания. Длительное снижение концентрации или блокада VEGF у взрослых ведет к ухудшению выживаемости эндотелиальных клеток, разрежению микрососудов (уменьшение в тканях терминальных артериол и капилляров) и повышению АД.
В экспериментах на животных инфузия VEGF индуцирует эндотелийзависимую вазодилатацию, которая сопровождается гипотензией и тахикардией и связана с увеличением концентрации азота оксида (NO). VEGF стимулирует высвобождение NO и дозозависимое повышение содержания протеина и мРНК эндотелиальной NO-синтетазы. Активизация лигандом VEGFR2 (принадлежит к семейству рецепторов тирозинкиназы, способных трансформироваться и фосфорилировать белки) стимулирует фосфорилирование серина и стабилизацию eNOS повышая синтез NO в эндотелии и гладкомышечных клетках с активизацией гуанилаткаскада и увеличением содержания цГМФ (циклического гуанозинмонофосфата), что индуцирует вазодилатацию [Ahmed A., Li X.F., Dunk C. et al. 1995].
Уровень экспрессии VEGF в «молодой» клеточной культуре показал следующую динамику: - Площадь экспрессии VEGF составила 3,35±0,17%. Воздействие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на оптическую площадь экспрессии VEGF в «молодых» культурах эндотелиоцитов сосудов. Оптическая площадь экспрессии VEGF достоверно повышалась под воздействием ЭМИ ММД длительностью 15 минут на 39,0% по сравнению с соответствующим показателем в контроле и составила 0,28±0,03% (рис. 22).
Уровень экспрессии VEGF в «старой» клеточной культуре повысился на 29,0% (2,04±0,2%), на 48,0% (2,78±0,12%) и на 54,0% (3,14±0,09%) при длительности воздействия ЭМИ ММД 5, 10 и 15 минут соответственно. Оптическая плотность экспрессии VEGF по сравнению с соответствующим показателем контрольной культуре повысилась только под воздействием ЭМИ ММД длительностью 15 минут (0,26±0,03%, больше на 39,0%). При этом 5 и 10 минутное воздействие эффекта не оказало (рис.24). - р 0,05 по сравнению с контрольными показателями «молодых» культур клеток. - р 0,05 по сравнению с контрольными показателями. Рисунок 23. Воздействие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на площадь экспрессии VEGF в «старых» культурах эндотелиоцитов сосудов. - р 0,05 по сравнению с контрольными показателями. Рисунок 24. Влияние ЭМИ ММД на оптическую плотность экспрессии VEGF в «старых» культурах эндотелиоцитов сосудов. Следовательно, увеличение уровня VEGF под воздействием ЭМИ ММД может способствовать вазодилатации опосредованно путем стимулирования высвобождения эндотелиальной NO синтазы как в «молодых» так и в «старых» культурах эндотелиоцитов. 3.7. Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию ICAM в клетках эндотелия сосудов при старении
Молекула адгезии эндотелиальных клеток ICAM-1 принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов и принимает участие во взаимодействии лейкоцитов и эндотелиальных клеток в очагах воспаления. На эндотелиальных клетках ICAM-1 является поверхностным лигандом для интегринов. Медиаторы воспаления (IL-1, TNF и др.) могут индуцировать ICAM-1 в фибробластах и эндотелиалии. Рецептор ICAM-1 - LFA-1 служит дополнительным фактором активации Т-лимфоцитов. ICAM-1 плохо выявляется на покоящемся эндотелии. После активации эндотелия экспрессия ICAM-1 быстро усиливается. Установлено, что молекула межклеточной адгезии ICAM-1 принимают участие в атерогенезе, способствуя проникновению лейкоцитов в стенку сосудов и отложению липидов [De Caterina R., Basta G., Lazzerini G. et al. 1997]. В физиологических условиях эндотелиальная клетка не экспрессирует данные молекулы адгезии.
Концентрация последних на поверхности эндотелиальных клеток увеличивается при воздействии различных повреждающих факторов. В местах стенки сосудов, подвергшихся воздействию, скапливаются ICAM-1, способствующие проникновению нейтрофилов, которые вместе с тучными клетками выделяют протезы, вызывая воспаление клеток эндотелия и накопления в субэндотелиальном пространстве окисленных липидов и липопротеидов.
При воздействии ЭМИ ММД как в «молодых», так и в «старых» клеточных структурах произошло уменьшение площади экспрессии ICAM-1 (рис.4). В культурах контроля («молодые» клетки) показатель площади экспрессии ICAM составил 0,64±0,09%. При облучении ЭМИ ММД произошло достоверное снижения уровеня экспрессии ICAM-1 на 22,0% (0,5±0,08%), на 22,5% (0,56±0,13%) и на 54,0% (0,43±0,07%) при длительности воздействия 5, 10 и 15 минут соответственно. (рис. 25). В культурах молодых клеток эндотелиоцитов воздействие ЭМИ ММД разной длительности не влияло на уровень оптической плотности экспрессии ICAM-1 (рис. 25).
Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию тромбомодулина (CD141) в клетках эндотелия сосудов при старении
Молекула адгезии эндотелиальных клеток ICAM-1 принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов и принимает участие во взаимодействии лейкоцитов и эндотелиальных клеток в очагах воспаления. На эндотелиальных клетках ICAM-1 является поверхностным лигандом для интегринов. Медиаторы воспаления (IL-1, TNF и др.) могут индуцировать ICAM-1 в фибробластах и эндотелиалии. Рецептор ICAM-1 - LFA-1 служит дополнительным фактором активации Т-лимфоцитов. ICAM-1 плохо выявляется на покоящемся эндотелии. После активации эндотелия экспрессия ICAM-1 быстро усиливается. Установлено, что молекула межклеточной адгезии ICAM-1 принимают участие в атерогенезе, способствуя проникновению лейкоцитов в стенку сосудов и отложению липидов [De Caterina R., Basta G., Lazzerini G. et al. 1997]. В физиологических условиях эндотелиальная клетка не экспрессирует данные молекулы адгезии.
Концентрация последних на поверхности эндотелиальных клеток увеличивается при воздействии различных повреждающих факторов. В местах стенки сосудов, подвергшихся воздействию, скапливаются ICAM-1, способствующие проникновению нейтрофилов, которые вместе с тучными клетками выделяют протезы, вызывая воспаление клеток эндотелия и накопления в субэндотелиальном пространстве окисленных липидов и липопротеидов.
При воздействии ЭМИ ММД как в «молодых», так и в «старых» клеточных структурах произошло уменьшение площади экспрессии ICAM-1 (рис.4). В культурах контроля («молодые» клетки) показатель площади экспрессии ICAM составил 0,64±0,09%. При облучении ЭМИ ММД произошло достоверное снижения уровеня экспрессии ICAM-1 на 22,0% (0,5±0,08%), на 22,5% (0,56±0,13%) и на 54,0% (0,43±0,07%) при длительности воздействия 5, 10 и 15 минут соответственно. (рис. 25).
В культурах молодых клеток эндотелиоцитов воздействие ЭМИ ММД разной длительности не влияло на уровень оптической плотности экспрессии ICAM-1 (рис. 25). - р 0,05 по сравнению с контрольными показателями.
Воздействие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на оптическую плотность экспрессии ICAM-1в «молодых» культурах эндотелиоцитов сосудов. В «старых» культурах эндотелиоцитов площадь экспрессии ICAM составила 2,33±0,1%. При облучении ЭМИ ММД уровень экспрессии ICAM-1 уменьшался на 46% (1,28±0,13%), на 38% (1,45±0,17%), 59% (0,97±0,07%) при облучении 5, 10 и 15 минут соответственно (рис.27, 29).
Оптическая плотность экспрессии по сравнению с контрольной клеточной культурой также достоверно уменьшилась на 34,0% до 0,08±0,02% (5 мин.), на 25,0% до 0,09±0,02% (10 мин.) и на 34,0% до 0,08±0,02% (15 мин. действия ЭМИ КВЧ) (рис. 28). - р 0,05 по сравнению с соответствующим показателем в контроле «молодых» культур клеток. - р 0,05 по сравнению с контрольными показателями.
Воздействие ЭМИ ММД на оптическую плотность экспрессии ICAM-1 в культурах «старых» клеток.
Повышение уровня экспрессии ICAM – 1 в эндотелиоцитах сосудах может служить биомаркером развития атеросклеротического процесса. Интенсивность экспрессии ICAM-1 и других молекул межклеточной адгезии заметно снижается при активации NO-синтазы, которая посредством NO модулирует освобождение вазоактивных медиаторов. Следовательно, уменьшение уровня экспрессии ICAM – 1 из-за облучения ЭМИ ММД может быть объяснено активацией eNOS в клетках эндотелиоцитов и препятствовать развитию патологического атеросклерозирования клеток сосудов.