Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие биотехноло-ч' гии и Медицинской микробиологии ставит проблему управляемого культивирования микроорганизмов, исследование закономерностей адаптации, роста и деления клеток, развития популяций в различных условиях выращивания.
Бактериальная популяция может изучаться на целостно-популяцион-ном (Иерусалимский Н.Д.,1963; Работнова И.Л.,1971) и клеточвд-попу--ляционном (Печуркин Н.С., Терсков И.А.,1975; Пшеничной Р.А. и др., 1977; Печуркин Н.С,1978) уровнях организации биологической системы. В последнее время приоритетное развитие в исследовании процессов жизнедеятельности популяций микроорганизмов получает клеточно-популяциодаый подход, учитывающий гетерогенность клеток популяции го различным свойствам, причины возникновения этой гетерогенности (Иванов В.Н.,.Угодчиков Г.Д.,1984). Присутствие в популяции определенной доли атипичных особей повышает пластичность популяции (Наслов Ю.Й., Парамонова 3.Л.,1983) при адаптации к неблагоприятным воздействиям внешней средн. Изучение динамики поведения микробных популяций с учетом гетерогенности (на популяционном уровне) является одной из наиболее актуальных биологических задач (Кяохиня И.Н., Угодчиков Г.А.,1980).
До сих пор недостаточно изучен и слабо освещен в литературе механизм адаптации клеток бактерий на самом раннем этапе развития популяции. Известно (Коротяев А.И.,1973; Перт С.Дж.,1976; Елохина И.Н,, Угодчиков Г.А.,1980; iandolo I., Ordal 2., 1966sAllvwod 1.:.0., Russel д. В. ,1968), что лаг-Фаза является важнейшим и определяющим периодом развития культуры, что в ней наблюдаются бурные физико-химические и клеточные процессы (Смирнов К.К., Смирнов С.Г., Смирнова 3.Г. ,1962; Смирнова 3.Г, ,1985). До елк пер чет ясности в тонких механизмах морфо-йункциональной пдпптзчпи клпток
ИНОКуЛПТа И ППрГЧ« ДО'Т>ШПХ КЛеТОК, ХОТЯ И!"!1')'П ГЧПГ СГ\ХУ$ рлнмий
период б значительной степени определяет последующее развитие бактериальной популяции.
Вышесказанное и определило направление, цели и задачи наших исследований.
Цель работы. Изучение особенностей действия метаболитов (фильтратов), получении из культур разного возраста шигелл Флекснера (sh.fiexncri s ,Ra ,Rd ), на адаптивное поведение клеток инокулята и клеток следующего поколения тех же штаммов на . начальной стадии формирования шкроколоний.
Основные задачи исследования :
-
Отработать методику исследования адаптивного поведения клеток шигелл на ранних стадиях развития в микрокамерах стационарного и проточного типов.
-
Отработать морфометрические аспекты измерения клеток при исследовании их с помощью микрокиносъемки. Найти наиболее информативные показатели оценки адаптивного поведения клеток на начальной стадии образования ылкроколонии при посеве на плотную питательную среду. ,.
3; Исследовать адаптивное поведение разновозрастных клеток шигелл Флекснера ( sh.tlerneri S , Ra , Rd ) при воздействии на них комплекса метаболитов (фильтратов) тех же штаммов в различных сочетаниях по диссоциативной принадлежности из периодических культур разного возраста. .
Научная новизна. При использовании собственных методических и конструкторских разработок в области стационарного и проточного микрокультивирования впервые были проведены исследования по количественной сценке адаптивного поведения шигелл на ранних стадиях образования шкроколоний. Доказано, что наиболее информативными показателями при этом являются I (время генерации клеток! и К(отношение Lk/Lo ) клеток.-Обнаружено, что распределения
данных показателей имеют полимодальный характер и с различных сторон характеризуют процесс адаптации популяции к среде обитания Кластервдсть врег.іенной гетерогенности популяции шигелл по распределениям С клеток отражает динамику адаптивных процессов и глубину стрессовой ситуации изучаемого поколения клеток. Морфофшиоло-гическая кластерная гетерогенность, устанавливаемая по показателю К. характеризует структурно-адаптивные процессы в исследуемых поколениях клеток, в том числе при включении SOS -функции (при стрессовых ситуациях). Адаптивное поведение Ch.flexnari S , На , Rd Определяется только возрастом инокулята и но зависит от возраста фильтраткой добавки в среду культивирования, а также их штаммовой принадлежности.
Впервиэ метрологически доказано, что использование высококонтрастного фотоматериала при йазовоконтрастноя микрокиносъемке позволяет повысить разрешающую способность светового микроскопа на порядок относительно измерений при визуальных микроскопических наблюдениях.
Проведенные эксперименты по проточному микрокультивированию о введением в среду з процессе развития популяции клеток шигелл пенициллина. Впервые показано, что а физиологической структуре инокулята присутствуют нераздаожагациеся и нерасгущие клетки, которые госле удаления пенициллина подвергаются аутолизу. Впервые по данным трансмиссионной микроскопии показано, что эти клетки имеют особенности в строении оболочки и организации нуклеоида.
Основные защищаемые положе н и я .
I. Сконструированы и изготовлены камеры для проточного микрокультивирования микроорганизмов, обеспечивающие быструю замену питательной среды при одновременной оптической регистрации процесса их развития (а.с.» 133 9123,1987; а.с.Н* 141 486В,1958). Доказана високая информативность показателей X (время генерации) и Мотно-
шения ^fe/bj, )'для оценки адаптивного поведения клеток палочка-видных бактерий на ранних стадиях проточного и стационарного шк-рокультивирования.
-
Показано, что применение высококонтрастного фотоматериала, как светочувствительного приемника, повышает разрешающую способность светового микроскопа на порядок относительно визуального предела разрешения, что позволяет при фазовоконтрастной микрофотографии проводить достоверные измерения размеров клеток бактерий с точностью до сотых долей микрометра.
-
Впервые показана временная и морфофизиологическая кластерная гетерогенность клеток шигелл на ранних этапах адаптации к среде обитания, заключающаяся в полимодальности распределений клеток но Т. (времени генерации) и показателю k ( Ь}/Ь0 ). анализ которых позволяет судить как о динамике, так и об особенностях развития структурно-адаптивных процессов в популяции, в частности, под воздействием фильтратов шигелл, полученных на различных фазах их развития. Адаптивное поведение клеток Sh.fleroeri а , йо , Hd определяется возрастои инокулята и не зависит от штаммовой принадлежности и возраста фильтратной добавки в среду культивирования.
-
Впервые показано, что при проточном микрокультивировании адаптивное поведение клеток шигелл определяется возрастом инокулята: при использовании 18-часового инокулята адаптивные процессы ускоряются, а при использовании 3-часового инокулята они замедляются. При введении пенициллина в проток питательной среды происходит массовый лизис растущих клеток шигелл, в поле зрения остаются неповрежденными ранее нерастуцие клетки, которые после активного перфузирования свежей средой подвергались медленному лизису по типу таяния. По данным трансмиссионной электронной микроскопии они имеют различное строение с пролиферирувдими клетками популяции.
\
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых ИГЙИ в 1985,1966, 1987 годах; на научно-практических конференциях микробиологов и инфекционистов ЮМ в 1985,1986,1987,1968-1909 годах; на Первом межинститутском совещании по этологии бактерия (Иваново,1935); на Всесоюзном научно-техническом семинаре "Электронная микроскопия для исследования функциональных изменений структуры клетки при различных воздействиях" (Иваново,1987); на Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" (Красноярск,1967); на Всесоюзной конференции "Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов" (їїущико,І987); на Всесоюзной конференции "Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты" (Москва, 1988); на конференции молодых ученых биологического, факультета МГУ (Москва,1989).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 15 научных работах, в том числе II в центральной печати.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитированной литературы, приложения. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков и 16 таблиц. Список литературы состоит из 360 источников, в том числе 205 отечественных и 155. иностранных.