Введение к работе
Актуальность проблемы.
Азокрасители и аминоароматические соединения (ААВ) входят в состав многих товаров (красок, лаков, тканей, кожаных, пластиковых и типографских изделий, продуктов питания, лекарственных средств и парфюмерно-косметической продукции) и применяются практически во всех областях человеческой деятельности (Березин, Березин, 2001; Карпов, Белов, 2002). При производстве и использовании со сточными водами сбрасывается от 10 до 50% ААВ. Пищевые азокрасители требуют особо пристального внимания, так как они вступают в прямой контакт с человеческим организмом. Высокую токсичность и мутагенность ААВ связывают с преобразованием их в реакционноспособные интермедиаты, взаимодействующие с молекулами ДНК и гемоглобином крови и способствующие развитию раковых заболеваний у человека и животных (Weisburger, 1997; Pinheiro et al., 2004).
Сохранение азокрасителями и ароматическими аминами своих свойств под действием факторов окружающей среды обусловило их повсеместное применение, однако именно это качество стало серьезным препятствием для разрушения их в сточных водах и в естественных местообитаниях. Анаэробные микроорганизмы способны осуществлять полную минерализацию ААВ с образованием незначительного количества биомассы, а проведение процесса в метаногенных условиях технологически более удобно, так как не требует внесения дополнительных акцепторов электронов в среду и позволяет получить на выходе полезный продукт - биогаз (Slokar, Majcen Le Marechal, 1998; Калюжный, 2004). В связи с этим первостепенное значение приобретает изучение метаногенных микробных сообществ, способных активно и стабильно осуществлять полную минерализацию ААВ.
Состояние вопроса.
К началу настоящего исследования в научной литературе имелось значительное количество работ, показывающих принципиальную возможность полной минерализации ААВ в анаэробных условиях (Bumpus, 1995), однако в большинстве случаев авторы ограничивались простой констатацией факта деструкции ААВ безотносительно к состоянию микробных культур и без подробного разбора этапов и промежуточных продуктов этого процесса. Данные литературы о специфичности микробных сообществ к ароматическим аминам весьма противоречивы, поскольку не выделены микроорганизмы, осуществляющие первые стадии деструкции и использующие сразу несколько изомеров аминоароматики. Наиболее изучены процессы разложения аминоароматических кислот (ААК) в нитрат- и сульфатредуцирующих условиях (Braun, Gibson, 1984; Tschech, Fuchs, 1987; Schnell, Schink, 1992). Для этих условий подробно разобраны пути расщепления ароматического кольца через бензоил-КоА-, резорциновый и флороглюциновый пути (Dutton, Evans, 1969; Heider, Fuchs, 1997; Carmona et al., 2009). Несмотря на то, что в очистных сооружениях используются анаэробные реакторы на основе именно метаногенных сообществ, на момент начала наших исследований работы по разложению в метаногенных условиях ААК были малочисленны (Tschech, Schink, 1988; Kalyuzhnyi et al., 2000), а пути превращений ААК на первых этапах процесса не были известны.
В подавляющем большинстве работ, посвященных деструкции ААВ, авторы применяли метаногенные сообщества как «черный ящик» без учета видового состава и взаимодействий внутри него. На момент начала наших исследований данных об их микробном составе и свойствах входящих в них культур было крайне мало, сведения отрывочны и не систематизированы. Отсутствовали данные о влиянии этих ксенобиотиков на общую структуру анаэробных сообществ, превращающих их в биогаз, а также на каждую группу микроорганизмов неметаногенных стадий процесса. Не было сведений о таксономической принадлежности, метаболическом потенциале и функциях в сообществе выделенных из таких
консорциумов чистых культур. Таким образом, к началу работы микробиологическая конверсия ААВ в биогаз не была изучена комплексно, так как отсутствовала полная схема превращений с указанием интермедиатов и групп микроорганизмов, ответственных за каждую стадию процесса.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы было комплексное изучение метаногенной деструкции азокрасителей и аминоароматических кислот анаэробными микробными сообществами различного происхождения и изменений структуры этих сообществ при контакте с аминоароматическими ксенобиотиками. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1) Выделить из илов очистных сооружений и донных отложений природных водоемов
активные и стабильные анаэробные микробные сообщества, способные к полной
минерализации ААВ, и определить параметры культивирования, оптимальные для
эффективного обесцвечивания азокрасителей и метаногенной деградации ААК;
-
Определить основные ароматические и линейные интермедиаты процесса конверсии ААВ в биогаз, вероятный механизм обесцвечивания азокрасителей и путь деградации ААК в активных сообществах;
-
Проследить изменения структуры сообществ по ходу процесса и во времени;
-
Определить компонентный состав типичного активного метаногенного сообщества и сравнить его с исходным илом;
-
Выделить чистые и ко-культуры микроорганизмов-членов сообществ и определить их роли в общем процессе биодеградации ААВ;
-
Создать искусственные микробные ассоциации из выделенных чистых и ко-культур для подтверждения их функций в сообществе и для проверки предложенной схемы трофической цепи;
7) Проверить выявленные закономерности на кишечных микробных сообществах
млекопитающих и определить подходы к их использованию в качестве тест-систем для
проверки пищевых азокрасителей.
Научная новизна работы.
Впервые проведено комплексное исследование процесса метаногенной конверсии ААВ, сопровождаемое изучением изменений структурно-функциональной организации осуществляющих его анаэробных микробных сообществ различного происхождения.
Полученные в работе данные о возможности «подстраивания» метаболизма как отдельных микроорганизмов, так и микробных сообществ в целом к использованию неприродных соединений расширили наши познания о пределах существования живой материи. Сведения о поведении микробных сообществ при контакте с ксенобиотиками, которые можно рассматривать как стрессовые факторы, представили новую информацию о возможных направлениях сукцессионных изменений структуры сообщества и его активности.
Впервые получены стабильные метаногенные сообщества, способные с высокой скоростью разлагать изомеры АБК и АСК. Выявлены основные закономерности функционирования сообществ при контакте с ААВ и факторы, влияющие на их активность.
Показана принципиальная разница характеристик и оптимальных параметров для первой стадии метаногенной деструкции азокрасителей (обесцвечивания) и последующих этапов разложения образовавшихся ароматических аминов. Впервые определены основные ароматические и линейные интремедиаты процесса метаногенной деструкции ААК и предложена последовательность реакций, осуществляемая в сообществах. Независимо от происхождения сообществ продемонстрирована схожесть у них цепи реакций деструкции ААК,
наиболее соответствующей бензоил-КоА-пути. Впервые показана возможность деструкции ААК сообществами, выделенными из донных отложений естественных водоёмов, которые ранее не подвергались массированному воздействию таких ксенобиотиков. Впервые установлено, что при преобразовании ААВ и их интермедиатов сообщества также меняют свою структуру.
Из метаногенного сообщества выделен Citrobacter freundii WAl, осуществляющий не описанную ранее реакцию восстановления и одновременного дезаминирования ААК. Впервые показано наличие и индуцибельный характер данной активности у штаммов вида Citrobacter freundii, хранящихся в коллекции микроорганизмов каф. микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.Из активных метаногенных сообществ выделены два штамма Pseudomonas aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA и впервые показана возможность опосредования химической реакции трансформации ААК биологической нитратредуцирующей активностью псевдомонад. Выделен и идентифицирован ряд чистых культур (Bacillus subtilis ЕР-ABA, Moraxella osloensis EP-ABA2, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei L-34, L. rhamnosus L-43.1), участвующих в процессе деструкции ААК на стадии брожения. Впервые показано наличие дополнительной функции обесцвечивания азокрасителей у данных лактобацилл и С. freundii WAl. Установлена значимая роль факультативных и аэротолерантных анаэробов в стабилизации и функционировании метаногенных микробных сообществ, разрушающих ААВ.
Практическая значимость работы.
В процессе экспериментов с ААВ выработан алгоритм получения и исследования активных и стабильных анаэробных микробных сообществ, который может быть применен к другому классу сложных органических ксенобиотиков. Полученные в работе фундаментальные знания могут послужить основой для моделирования и «конструирования» микробных сообществ с заданными свойствами, а также для отслеживания судьбы ААВ в природе и их влияния на экосистемы различных уровней. Выделенные нами стабильно работающие высокоактивные микробные сообщества могут стать базой для создания биореакторов.
Изучение процессов биологической и химической трансформации ААК, осуществляемых С. freundii WAl и штаммами P. aeruginosa, поможет моделировать микропроцессы, происходящие в анаэробных илах при изменении физико-химических условий.
Данные о сукцессионных изменениях структуры сообщества и его активности при контакте с ААВ должны учитываться при прогнозировании результатов загрязнения природных и искусственных систем. Исследование биодеградабельной способности сообществ, полученных из донных осадков природных водоемов, почвы, экскрементов животных и человека, и мониторинг изменений их структуры под влиянием ААВ может дать исходные сведения для построения более сложных моделей, а также возможность прогнозировать последствия загрязнения таких биотопов. Простая и быстрая регистрация в кишечных сообществах пищевых азокрасителей и интермедиатов их обесцвечивания и дальнейшей деструкции позволяет рекомендовать такие тесты для первичной проверки данных добавок. Установленные сдвиги в структуре кишечных сообществ при контакте с ААВ и токсичность азокрасителей и продуктов их распада по отношению к лактобациллам, составляющим важную часть нормальной микробиоты ЖКТ млекопитающих, позволяет предвидеть риски для здоровья при попадании пищевых азокрасителей в организм с пищей, напитками и лекарствами.
Материалы диссертационной работы использованы автором для написания разделов в 9-ти учебниках (см. Список публикаций) и вошли в читаемые в МГУ имени М.В.Ломоносова курсы «Микробиология» и «Актуальные проблемы микробиологии». Они могут быть использованы в системе высшего профессионального образования в программах по микробиологии и биотехнологии естественнонаучных направлений.
Апробация работы.
Результаты исследований были представлены на Симпозиуме INTAS "Microbial and cellular systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment" (Moscow, 26-30 May, 1999), научной конференции «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов» (Москва, 21 декабря 1999); научной конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 28 мая - 2 июня, 2000); 9-м Международном симпозиуме по микробной экологии "Interactions in microbial world" (Амстердам, Нидерланды, 26-31 августа, 2001); 7-м Международном семинаре FAO/SREN «Анаэробное разложение для поддержания очистки сточных вод» (Москва, 19-22 мая, 2002); 2-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 10-14 ноября, 2003); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 20-23 октября, 2004); Международной конференции "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 14-16 сентября, 2005); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 21-24 декабря, 2005); 12-й Международной пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 10-14 ноября, 2008); 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Экологические проблемы промышленных городов" (Саратов, 7-8 апреля, 2009); научной конференции "Экосистемы. Организмы. Инновации-11" (Москва, 24 июня, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 24-27 декабря, 2009); 7-й Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск, 31 мая - 4 июня, 2010); 6-й школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 25-27 октября, 2010); 6-й Международной научно-практической конференции «Найновите постижения на европейската наука - 2011» (Болгария, София, 17-25 июня, 2011).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 47 работ, из них 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 10 глав в учебниках и учебных пособиях, 6 статей в сборниках и 21 тезис докладов.
Положения, выносимые на защиту.
1) Анаэробная конверсия азокрасителей в биогаз, осуществляемая микробными
сообществами, является многоэтапным процессом, включающим неспецифическую стадию
обесцвечивания и специфическую стадию трансформации образовавщихся ароматических
аминов. Эти стадии имеют различный механизм, регуляцию и отношение к параметрам
культивирования.
2) Активные метаногенные сообщества независимо от происхождения осуществляют
процесс деструкции ААВ сходным образом и имеют аналогичную структурно-функциональную
организацию.
3) Контакт с ААВ приводит к сукцессии микробных сообществ, выражающейся в снижении
общего числа клеток, уменьшении биоразнообразия и смене доминирования.
-
Факультативно анаэробные и аэротолерантные микроорганизмы играют значительную роль как в процессе метаногенной деструкции ААВ, так и в стабилизации микробного сообщества, разрушающего эти вещества.
-
Искусственные микробные сообщества с заданными свойствами могут быть созданы как из микроорганизмов, выделенных из активных консорциумов одинакового или разного происхождения, так и из коллекционных штаммов со свойствами, аналогичными присутствующим в консорциуме.
-
Прослеживание судьбы ААВ в кишечных микробных сообществах млекопитающих может быть использовано в качестве первичного теста при проверке пищевых азокрасителей на безопасность.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследований и излагающей полученные результаты и их обсуждение, заключения и выводов. Текст предваряется списком сокращений и завершается перечнем использованной литературы из 398 источников. Работа изложена на 431 странице, проиллюстрирована 137 рисунками и 43 таблицами.