Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. На фоне продолжающейся пандемии холеры, которая сопровождается диссеминацией возбудителя в окружающей среде, наблюдается выраженная изменчивость основных биологических свойств холерных вибрионов, в том числе связанная с модификацией структуры поверхностных антигенов.
Изменчивость является самым стабильным свойством любой биологической системы, поскольку она служит гарантией сохранения видов, обеспечивая динамическую вариабельность целого ряда признаков, в первую очередь вирулентности и антигенной структуры (Беляков В.Д. с соавт., 1987; Смирнов Г.Б., 1988). Именно эти алгоритмы были отобраны эволюцией в качестве универсального орудия адаптации и персистенции прокариот (Беляков В.Д. с соавт., 1987; Бухарин О.В., 1997, 1999; Литвин В.Ю. с соавт., 1998).
Антигенная изменчивость - это "первый эшелон" адаптации микроорганизмов при смене экологической среды обитания (Беляков В.Д. с соавт., 1987), поэтому ей наряду с вирулентностью придается важная роль в формировании новых патогенных вариантов, обусловливающих запуск эпидемического процесса.
Широкие адаптационные возможности патогенных микроорганизмов, в том числе холерных вибрионов, обусловлены прежде всего гетерогенностью популяции возбудителя, находящегося в определенных экологических условиях (Беляков В.Д. с соавт., 1987), так как создание антигенного разнообразия дает значительные преимущества для ее существования в условиях естественного отбора (Стейниер Р. с соавт., 1979; Литвин В.Ю., 1988).
Главной причиной гетерогенности является непостоянство геномов, поэтому свойства любой популяции никогда не бывают стабильными (Домарад-ский И.В., 1997; Sharma С. et al., 1997; Alon U. et al., 1999).
Эволюция холерных вибрионов продолжается. В эндемичных очагах идет процесс формирования новых антигенных вариантов, имеющих эпидемический потенциал. Вместе с тем, в неблагоприятных экологических условиях образуются глубоко измененные варианты, которые или не выживают, или пополняют аутохтонную микрофлору водоемов. Н.С. Гончарова с соавт. (1987) пришли к выводу, что патогенный вид любого возбудителя в природе эволю-ционно поддерживается громадным многообразием антигенных, авирулентных
и других вариантов, экологически ему сопутствующих.
Поэтому изучение природы антигенной изменчивости холерных вибрионов приобретает в настоящее время особую актуальность в связи с необходимостью расшифровки общебиологического механизма псрсистенции бактерий в водных и организменных сообществах.
Несмотря на появление в течение последних десяти лет многочисленных публикаций о выделении на территории Российской Федерации и некоторых государств СНГ большого количества измененных по антигенному составу штаммов холерных вибрионов, эколого-reor рафический анализ их распространения на различных административных территориях, длительности выделения и возможности укоренения в определенных экосистемах производился фрагментарно.
Хотя существующие методы диагностики и идентификации позволяют установить принадлежность выделенных из внешней среды атипичных штаммов к виду V. cholerae и определить их эпидемическую значимость, тем не менее вопросы, связанные с их происхождением и возможной генетической связью с вибрионами, выделяемыми от человека, остаются пока в стороне.
До настоящего времени не было проведено сравнительного исследования геномов типичных и измененных по антигенной структуре холерных вибрионов, выделенных в различных регионах Российской Федерации от людей и из объектов окружающей среды, с целью получения объективной информации об их эволюционном родстве и процессах популяционной изменчивости, происходящих в различных экологических условиях, а также возможности формирования на фоне происходящих адаптационных перемен вирулентных клонов, приводящих к запуску эпидемического процесса.
Следовательно циркуляция гетерогенных популяций вибрионов на благополучных по холере территориях становится не только медицинской, но и актуальной экологической проблемой, которая не может быть решена только традиционными бактериологическими и эпидемиологическими методами и нуждается в дополнительном молекулярно-биологическом мониторинге.
Очевидно, что только с помощью генетических и экологических подходов могут быть решены назревшие проблемы эпидемичности и эндемичности холеры, выяснены механизмы адаптации вибрионов в окружающей среде и определена роль изменчивости в этом процессе.
Актуальным остается также вопрос совершенствования диагностики измененных по агглютинабельности вибрионов, поскольку существующие критс-
рий определения принадлежности к виду V. cholerae с использованием традиционных диагностических препаратов и методов создают значительные трудности при идентификации таких штаммов.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: проведение сравнительного анализа распространения атипичных по антигенному составу холерных вибрионов, выделенных в период седьмой пандемии холеры на территории СССР, изучение диапазона антигенной вариабельности с характеристикой патогенных свойств измененных клонов, обсуждение возможных путей их формирования и оценка роли антигенной изменчивости в механизме адаптации и эволюции холерных вибрионов в окружающей среде. Поиск новых методических подходов к совершенствованию диагностики и идентификации атипичных вариантов холерных вибрионов.
1.Провести анализ динамики выделения на территории Российской Федерации и других республик СССР атипичных по антигенной структуре штаммов холерных вибрионов в период седьмой пандемии холеры. Охарактеризовать диапазон наблюдаемой при этом изменчивости, изучить состав популяции и стабильность атипичных штаммов.
-
Оценить эпидемическую значимость различных по антигенному фенотипу вариантов холерных вибрионов.
-
Изучить особенности метаболизма у холерных вибрионов в процессе адаптации в окружающей среде, которая сопровождается изменениями антигенного состава.
-
Сравнить генотипы типичных и измененных штаммов, выделенных от людей и из объектов окружающей среды в эпидемический и межэпидемический периоды, с целью определения сходства и различий в составе их нуклео-тидных последовательностей.
-
Изучить в эксперименте адаптационные способности холерных вибрионов под влиянием различных видов стресса (теплового, холодового, анаэробиоза, биоантагонистов).
-
На основании изучения динамики изменений генотипа и фенотипа при экспериментальном стрессе, как модели климатических условий в Российской Федерации, сделать заключение о возможности формирования на территории нашей страны новых эпидемических клонов.
-
Подобрать методические подходы к совершенствованию диагностики ати-
*
личных по антигенному составу штаммов холерных вибрионов.
-
Установлены закономерности адаптации и персистенции холерных вибрионов в объектах окружающей среды, которые сопровождаются изменениями антигенного фенотипа, фагочувствителыюсти и вирулентности. Показано, что характер антигенной изменчивости определяется экосистемой, в которой циркулируют холерные вибрионы.
-
Доказано, что две группы антигенных вариантов (SR и R), объединенных в RO-серовар, имеют различную природу и эпидемическую значимость.
-
Обнаружена выраженная нестабильность поверхностных структур у штаммов с SR-фенотипом, имеющая тенденцию перехода в холерные вибрионы не 01 серогруппы. Стабильность и апатогенность R-вариантов свидетельствуют о глубоких и необратимых изменениях в геноме таких вибрионов.
-
Впервые показано, что в процессе адаптации к условиям окружающей среды, сопровождающейся модификациями поверхностных структур клетки, у холерных вибрионов происходят значительные изменения в метаболизме, связанные с переходом на новый энергетический уровень с замедленным синтезом органических веществ.
-
Доказано, что типичные и измененные штаммы холерных вибрионов, выделенные из воды, в отличие от культур от людей, проявляют выраженную цитотоксическую активность, что не позволяет однозначно относить их к группе авирулентных.
-
Показана возможность использования полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами для сравнительного анализа геномного полиморфизма типичных и измененных штаммов, их генетического родства и оценки происходящих модификаций в поверхностных структурах холерных вибрионов.
-
Установлена неоднородность популяций, циркулирующих в водоемах бывшего СССР и выделенных от людей, по наличию генов, кодирующих синтез токсин-корегулируемых пилей адгезии. Обнаружены редко встречающиеся штаммы с tcp+ ctx" генотипом, наличие которых предполагает ступенчатый характер утраты детерминант вирулентности у холерных вибрионов.
-
Доказано, что длительной персистенции холерных вибрионов в водоемах способствует генетическая неоднородность циркулирующих популяций, в которых происходят постоянные эпитопные модификации поверхностных
і
структур микробных клеток.
9. Показана неоднородность клеточного состава по агглютинабельности у
штамма холерных вибрионов О 139 серогруппы, выделенного от человека.
-
Впервые доказано влияние гелиомагнитной активности на характер и динамику антигенной изменчивости холерных вибрионов, выделенных на территории СССР.
-
Впервые показано, что длительная персистенция холерных вибрионов в среде с низкими концентрациями нефтепродуктов сопровождается изменениями в фенотипе и генотипе, приводящими к снижению и утрате агглютинабельности, фаголизабельности и токсигенности.
-
Впервые изучено влияние различных видов стресса на основные биологические свойства холерных вибрионов. Показано, что вибрионы имеют значительный "запас" экологической пластичности, позволяющей им адаптироваться к стрессовым воздействиям путем выраженной модификации поверхностных структур, а также снижением и утратой вирулентности.
Получены новые данные о механизме адаптации холерных вибрионов в объектах окружающей среды. Показано наличие у них "запаса" биологической пластичности, обеспечивающей возможность длительного существования в различных экосистемах.
Представлены доказательства ключевой роли поверхностных структур в явлении микробной адаптации, установлены причины и условия формирования измененных по антигенной структуре холерных вибрионов.
Доказана роль климато-географической среды обитания холерных вибрионов в формировании популяций с определенным антигенным фенотипом.
Получены новые данные о физиологических свойствах возбудителя холеры, реализуемых им в неблагоприятных условиях окружающей среды путем перехода на другой энергетический уровень питания и дыхания, обеспечивающий длительную персистенцию в различных экосистемах.
С помощью молекулярно-биологического исследования генотипов холерных вибрионов, выделенных от людей, и популяций, циркулирующих в водных экосистемах, получены новые сведения о рекомбинативных процессах, происходящих в процессе изменчивости.
Показана роль солнечной активности как возможного индуктора в появлении новых антигенных вариантов.
Доказана важная экологическая роль высокомолекулярных углеводородов в механизме выживания холерных вибрионов в окружающей среде и модификации основных биологических свойств, важнейшими из которых являются вирулентность и антигенный состав.
Получены доказательства ведущей роли стресса в механизме адаптации холерных вибрионов в водных экосистемах, приводящей к появлению разнообразных антигенных форм, в том числе и неагглютинабельных, что может объяснять сезонную смену серопейзажа в водоемах.
Полученные данные о происходящих в процессе адаптации холерных вибрионов к условиям окружающей среды негативных изменениях в генотипе и фенотипе вибрионов свидетельствуют о том, что условий для формирования новых патогенных клонов на территории Российской Федерации, по-видимому, не существует.
Показана необходимость при идентификации атипичных штаммов дифференцировать холерные вибрионы RO-серовара на SR- и R-варианты, отличающиеся характером изменений поверхностных структур и эпидемической значимостью. SR-вариан гы выделяют от людей, из сточной воды и иногда из воды поверхностных водоемов. У них нередко сохраняются детерминанты патогенносте. R-варианты - аутохтонные обитатели водоемов, они полностью авирулентны.
Предложено использование метода перекисного окисления липидов и тетразолового теста с субстратами цикла Крсбса для изучения особенностей метаболизма у холерных вибрионов в процессе изменений антигенного состава.
Показана возможность использования клеток культуры СНО-К1 для оценки цитотоксической и цитотонической активности типичных и измененных по антигенной структуре холерных вибрионов.
Установлено, что полимеразная цепная реакция с универсальным прай-мером № 15 может быть применена для анализа гетерогенности популяций штаммов, циркулирующих в различных экосистемах.
Показано, что эпндзначимость циркулирующих в воде поверхностных водоемов и выделенных от людей штаммов, помимо существующих методов генного зондирования и в ПЦР со специфическими праймерами, может быть оценена с помощью фагов СТХ+ и СТХ".
Предложено использование ііікальї чисел Вольфа, характеризующих ге-лиоактивность в период солнечного цикла, для проведения коррелятивного
,' 9
анализа степени ее влияния на характер и динамику антигенной вариабельности холерных вибрионов.
Подобраны экспериментальные условия для моделирования стресса у холерных вибрионов.
Модифицирован метод изучения взаимоотношений вибрионов и инфузорий, который описан в "Методических рекомендациях по изучению характера взаимоотношений холерных вибрионов с представителями зоо- и фитопланктона в эксперименте", утвержденных на Ученом Совете Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института 24.12.1999 года.
Получен набор моноклональных антител к антигенным детерминантам атипичных холерных вибрионов. Гибридомы клонированы и криоконсервиро-ваны. Гибридома C11/RO депонирована в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных коллекции клеточных культур под номером ВСКК/11/614Д в институте цитологии АН, г. Санкт-Петербург.
Проведено сравнение существующих иммуно-серологических методов идентификации атипичных по антигенной структуре штаммов холерных вибрионов. Показана целесообразность дифференцированного их использования в зависимости от глубины изменчивости последних.
Рекомендована замена диагностических коммерческих лошадиных сывороток, дающих неспецифические реакции в связи с наличием гетерогенного пула входящих в них антител, на кроличьи, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью, что позволит перейти от постановки объемной реакции агглютинации к реакции на стекле, значительно сокращающей время проведения анализа.
Для музея живых культур Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института составлен каталог атипичных по агглютинабельности штаммов, выделенных в период седьмой пандемии холеры.
Разработанные предложения и дополнения к диагностике атипичных штаммов холерных вибрионов включены в "Инструкцию по организации и проведению противохолерных мероприятий" (М., 1995 г.), новую ее редакцию (2000 г.) и в руководство "Диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний" (Саратов, 1998 г.).