Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Бобово-ризобиальный симбиоз 15
1.2Ростостимулирующие ризобактерии (PGPR) и возможности их применения
1.2.1. Ризобии как PGPR 17
1.2.2. Механизмы стимуляции роста растений ризобиями 19
1.3. Бактериальные и растительные компоненты клеток, участвующие на ранних этапах становления растительно микробных взаимодействий
1.3.1. Бактериальная аутоагглютинация 24
1.3.2. Биопленки 26
1.3.3. Полисахариды клеточной стенки ризобий 28
1.3.4. Бактериальные адгезины
1.4. Ризобиальный адгезин RapA1 33
1.5. Способы улучшения колонизации корней растений ризобиями 36
1.6. Бинарные биоудобрения на основе ризобактерий 40
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования, бактериальные штаммы и векторы 44
2.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при 46 проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.3. Реактивы и материалы 46
2.4. Составы использованных стандартных водных растворов и 48 сред
2.5. Методы исследований 50
2.5.1. Выделение и очистка ДНК бактерий 50
2.5.2. ПЦР 51
2.5.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК 51
2.5.4. Препаративный гель-электрофорез ДНК 53
2.5.5. Выделение белков из клеток растений и бактерий 53
2.5.6. Вестерн-блот анализ 54
2.5.7. Обработка ДНК щелочной фосфатазой и полинуклеотидкиназой фага Т4
2.5.8. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 57
2.5.9. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.5.10. Подготовка компетентных клеток E. coli 60
2.5.11. Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной 60 ДНК
2.5.12. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным 61 методом
2.5.13. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 62
2.5.14. Приготовление электрокомпетентных клеток ризобактерий 62
2.5.15. Электропорация компетентных клеток ризобактерий 62
2.5.16. Определение ростовых параметров растений 63
2.5.17. Определение нитрогеназной активности бактерий 64
2.5.18. Выделение чистых культур клубеньковых бактерий 65
2.5.19. Бинарное сокультивирование бактерий и микроскопирование
2.5.20. Агробактериальная трансформация листовых пластинок растений табака
2.5.21. Анализ -глюкуронидазной (gus) активности 67
2.5.22. Выделение и очистка ДНК растений 68
2.5.23. Выделение и очистка РНК растений 68
2.5.24. Синтез кДНК 69
2.5.25. Иммунофлуоресцентный анализ для определения локализации белка RapA
2.5.26. Обработка корней табака R. leguminosarum и подсчет количества адсорбированных на поверхности корней бактерий
2.5.27. Статистический анализ 71
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Поиск и выделение гена rapA1 из штаммов R. leguminosarum 73
3.2. Создание генно-инженерной конструкции на основе вектора pJN для конститутивной экспрессии гена rapA1 в бактериях
3.3. Получение и анализ рекомбинантных по гену rapA1 бактерий 76
3.3.1. Вестерн-блот белка RapA1 в трансформированных бактериях 76
3.4. Агглютинация бактерий, рекомбинантных по гену rapA1, в бинарной системе сокультивирования
3.5. Оценка влияния рекомбинантных штаммов ризобий на образование клубеньков, нитрогеназную активность и ростовые параметры на растения фасоли
3.6. Бинарная инокуляция растений фасоли и козлятника рекомбинантными и нетрансформированными штаммами
3.6.1. Совместная обработка рекомбинантными и нетрансформированными штаммами ризобий растений фасоли и козлятника
3.6.2. Идентификация гена rapA1 у бактерий, выделенных из клубеньков обработанных растений
3.7. Получение и анализ трансгенных по гену rapA1 растений табака
3.7.1. Создание векторной конструкции pCambia 1301 несущей ген адгезина rapA1 с лидерным пептидом секретируемого лектина гороха PSL
3.7.2. Получение растений табака, экспрессирующих ген rapA1 99
3.7.3. Вестерн-блот анализ белков, выделенных из трансгенных 102 растений табака 3.7.4. Иммунофлуоресцентный анализ локализации белка RapA1 на 103 корнях трансгенных растений табака
3.7.5. Адгезия бактерий на корнях трансгенных растений табака 104
Заключение 108
Выводы 111
Список литературы
- Бактериальные и растительные компоненты клеток, участвующие на ранних этапах становления растительно микробных взаимодействий
- Выделение и очистка ДНК бактерий
- Агробактериальная трансформация листовых пластинок растений табака
- Оценка влияния рекомбинантных штаммов ризобий на образование клубеньков, нитрогеназную активность и ростовые параметры на растения фасоли
Введение к работе
Актуальность темы. Микроорганизмы рода Rhizobium (клубеньковые бактерии или ризобии) являются одними из самых эффективных азотфиксаторов в симбиозе с бобовыми растениями. Кроме того, ризобии способствуют улучшению роста и развития, а также минерального питания растений и в свободноживущем состоянии, что позволяет их отнести к PGPR-микроорганизмам (от Plant Growth-Promoting Rhizobacteria – ризобактерии, способствующие росту растений) (Pliego et al., 2011; Nadeem et al., 2014). Инокуляция ими бобовых и небобовых растений может широко применяться в сельском хозяйстве для повышения урожайности сельскохозяйственно-значимых культур (Тихонович, Круглов, 2006; Pena, Reyes, 2007).
По многим литературным данным ризобии обладают ростостимулирующим
эффектом (Lemanceau, 1992), который обеспечивается путем синтеза веществ
фитогормональной природы (ауксины, гиббереллины, цитокинины и другие),
витаминов, веществ антибиотической и противогрибковой природы, фиксации
молекулярного азота и ингибирования синтеза этилена растений, улучшая
поглощение питательных веществ, повышенной стрессоустойчивости,
растворения неорганического фосфата и минерализации органического фосфата. Также ризобии могут способствовать росту небобовых растений, косвенно взаимодействуя с другими полезными микроорганизмами (Цавкелова и др., 2005, 2006; Kao et al., 2005; Kang et. al., 2006).
PGPR-микроорганизмам в мире уделяется большое внимание, так как применение данной группы ризобактерий в сельском хозяйстве позволяет снизить уровень использования химических удобрений и пестицидов (Моргун и др., 2009), в том числе благодаря стимуляции роста важных сельскохозяйственных культур (Glick, 1995; Lucy et al., 2004) и подавлению развития фитопатогенов (Probanza et al., 2001; Pieterse et al., 2002; Recep et al., 2009), в том числе патогенных грибов
4 (Благова и др., 2012, 2015; Оркодашвили и др., 2013; Вершинина и др., 2013, 2015). Все эти положительные качества делают ризобии хорошим инструментом для повышения урожайности в растениеводстве, в частности, путем обработки семян или корней растений инокулятами бактерий.
Прикрепление ризобактерий к корневым волоскам растений является
определяющим этапом на ранних стадиях формирования бобово-ризобиального
симбиоза. Первый этап адгезии является слабым и обратимым, в нем участвуют
бактериальные поверхностные полисахариды, растительные лектины и адгезины,
в том числе Са2+-связывающие белки. К таким белкам относится адгезин RapA1,
имеющий сходство с рикадгезинами (Ausmees et al., 2001; Mongiardini et al., 2008,
2009). Было доказано, что RapA1 является Са2+-связывающим белком,
выделенным из Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (Ausmees et al., 2001). Кроме
того, показано, что повышенная конститутивная экспрессия гена rapA1 влияет на
конкурентоспособность штаммов ризобий R. leguminosarum, увеличивает
адсорбционную способность их клеток к корневым волоскам растений (Mongiardini et al., 2008, 2009). Результаты данных экспериментальных работ явились предпосылкой для использования белка RapA1 в качестве инструмента для создания новых симбиотических ассоциаций между клубеньковыми бактериями и растениями.
Цель исследования
Изучение возможности использования адгезина RapA1 бактерий Rhizobium
leguminosarum в качестве инструмента для создания искусственных
симбиотических ассоциаций культурных растений с PGPR-микроорганизмами.
Задачи исследования
1. Скрининг штаммов Rhizobium leguminosarum на наличие гена rapA1 и получение рекомбинантных бактериальных штаммов с конститутивной экспрессией данного гена.
2. Оценка способности рекомбинантных по гену rapA1 штаммов бактерий к
агглютинации.
-
Анализ влияния клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum с конститутивной экспрессией гена rapA1 на образование клубеньков, нитрогеназную активность и ростовые параметры растений фасоли.
-
Оценка возможности создания бинарных биопрепаратов на основе клубеньковых бактерий, в которых, кроме основного штамма ризобий, будет присутствовать штамм-продуцент RарA1.
5. Получение векторной конструкции на основе плазмиды pCambia1301,
содержащей ген адгезина rapA1 с лидерным пептидом секретируемого лектина
гороха PSL под управлением CaMV 35S промотора. Получение растений табака,
трансгенных по гену rapA1, и исследование особенностей колонизации
трансгенных корней флуоресцентно меченым штаммом бактерий Rhizobium
leguminosarum.
Научная новизна работы
Обнаружено положительное влияние конститутивной экспрессии гена белка RарA1 в рекомбинантных штаммах Rhizobium leguminosarum на образование клубеньков и ростовые параметры растений фасоли. Показана эффективность бинарной инокуляции растений фасоли и козлятника сочетанием симбиотических и не симбиотических штаммов, где белок RарA1 продуцирует несимбиотический штамм-помощник. На основе вектора pCambia 1301 создана генетическая конструкция, содержащая ген адгезина RарA1 под лидерными пептидом PSL гороха (Pisum sativum). Впервые получены трансгенные по гену бактериального адгезина растения табака и доказана повышенная адгезия бактериальных клеток к корням трансгенных растений.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты расширяют представление о возможности использования адгезинов бактерий в качестве инструмента для создания
6 симбиотических ассоциаций между растениями и PGPR-микроорганизмами. Разработанный подход позволяет получать штаммы ризобий с повышенной экспрессией гена rapA1, которые смогут успешнее колонизировать корневую систему растений, чем «дикие» штаммы, тем самым оказывая положительное влияние, как на образование клубеньков, так и на рост биомассы и урожайности растений в целом, что существенно расширит границы применения рекомбинантных бактерий в качестве биоудобрений. Полученные в данной работе штаммы могут быть использованы в качестве второго компонента в бинарных удобрениях для совместной инокуляции экономически значимых культур.
Методология и методы исследования
Методологическую основу работы составил системный подход,
позволяющий рассмотреть различные аспекты использования адгезина ризобий RарA1 как инструмент в биоинженерии во взаимодействии клубеньковых бактерий с корнями растений.
При проведении исследования и изложения материала автором были
применены общенаучные методы: теоретический и методологический анализ
литературных источников, экспериментальные методы исследования и
сравнительный анализ полученных данных. Использованные методы и статистическая обработка экспериментального материала позволили обеспечить обьективность полученных результатов.
Положения, выносимые на защиту
-
Клетки Rhizobium leguminosarum агглютинируют в присутствии белка RарA1 независимо вырабатывают они данный белок сами или он продуцируется сокультивируемым штаммом.
-
Симбиотическая система, включающая собственно микросимбионт и штамм-продуцент белка RapA1, потенциально может быть использована в основе биопрепаратов для повышения продуктивности растений в экологически ориентированном сельском хозяйстве.
7 3. На поверхности корней, трансгенных по гену rapA1 растении табака, адсорбируется большее количество клеток Rhizobium leguminosarum по сравнению с контролем.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных в ходе исследования результатов подтверждена
применением современных микробиологических, молекулярно-биологических и
биохимических методов и объемом проведенной работы. Результаты
исследования соответствуют данным, представленным в отечественной и зарубежной литературе. Проведенный статистический анализ подтверждает достоверность полученных результатов. Выводы полностью и в строгой логической последовательности отражают полученные результаты.
Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции с международным участием «Современные проблемы биохимии и биотехнологии» (Уфа, 2013), VI Всероссийской с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), Второй всероссийской молодёжной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2014), II Пущинской школе-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» (Пущино, 2015), VIII Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2016).
Личный вклад автора в проведенные исследования
Определение направления диссертационной работы, цели и задач исследования проводилось автором совместно с научным руководителем доктором биологических наук Баймиевым А. Х. Автором самостоятельно изучена отечественная и зарубежная литература по теме диссертации и лично написана рукопись данной работы. Автор непосредственно участвовал в подготовке материалов к публикациям по диссертационной теме и их написании. Основная
8
часть экспериментальной работы: микроскопирование, выращивание
бактериальных культур на различных средах, секвенирование, клонирование,
конструирование вектора, трансформация, эксперименты с растениями
выполнены автором самостоятельно.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертационная работа «Бактериальный адгезин RapA1 Rhizobium leguminosarum как инструмент в биоинженерии микробно-растительных симбиозов» соответствует формуле специальности 03.02.03 – «Микробиология», охватывающая область симбиоза микроорганизмов (пункт 6), а также использование микроорганизмов в народном хозяйстве, ветеринарии и медицине (пункт 10). В диссертационной работе исследована возможность использования адгезина RapA1 бактерий Rhizobium leguminosarum в качестве инструмента для создания искусственных симбиотических ассоциаций культурных растений с PGPR-микроорганизмами. Для этого создана генно-инженерная конструкция для конститутивной экспрессии гена rapA1 Rhizobium leguminosarum в бактериальных клетках, получены рекомбинантные штаммы ризобий с конститутивной экспрессией гена rapA1 и трансгенные растения табака, секретирующие адгезин RapA1.
Структура и объем диссертации
Бактериальные и растительные компоненты клеток, участвующие на ранних этапах становления растительно микробных взаимодействий
Ассоциативный симбиоз образуют бактерии, колонизирующие ризосферу и ускоряющие рост растений с помощью различных механизмов, которые называются ростостимулирующими ризобактериями (от Plant Growth-Promoting Rhizobacteria или PGPR – ризобактерии, способствующие росту растений) (Kloepper et al., 1980; Dey et al., 2004; Herman et al., 2008). PGPR – это обширная группа бактерий, влияющие на всхожесть семян, увеличивают массу растений и повышают урожайность (Kloepper et al, 2003). Применение PGPR в сельском хозяйстве позволяет снизить уровень использования химических удобрений, пестицидов (Моргун и др., 2009), а также увеличить рост важных сельскохозяйственных культур (Glick, 1995; Lucy et al., 2004) и подавлять рост патогенов растений (Probanza et al., 2001; Pieterse et al., 2002; Recep et al., 2009), в том числе патогенных грибов (Благова, Нигматуллина, 2012; Благова и др., 2012, 2015; Оркодашвили и др., 2013; Вершинина и др., 2013, 2015). Кроме того, обработка растений PGPR вызывает у них развитие защитных механизмов, например, приводит к состоянию индуцированной системной устойчивости (Van Loon et al., 1998; Kloepper et al., 1999). Индуцированная системная устойчивость запускает защитные механизмы растений, направленные на борьбу с патогенами (Van Loon et al., 1998).
К PGPR-бактериям принадлежат микроорганизмы, относящиеся к следующим родам: Pseudomonas, Bacillus, Azospirillum, Agrobacterium, Azotobacter, Arthrobacter, Alcaligenes, Serratia, Rhizobium, Enterobacter, Burkholderia, Beijerinckia, Klebsiella, Clostridium, Vario-vovax, Xanthomonas и Phyllobacterium (Kloepper, 1989; De Freitas, 1990; Young, 1995; Quadt-Hallmann,1997; De Silva, 2000; Bullied, 2002; Nicholson, 2002;). Наиболее широко из них изучены Azospirillum (Bashan et al., 2004), Pseudomonas (Kloepper et al., 1980; Cattelan et al., 1999; Adesemoye, 2009), Bacillus (Probanza et al., 2001; Recep et al., 2009), Burkholderia (Joo et al., 2009).
PGPR-бактерии характеризуются положительными (прямыми и косвенными) действиями на растения (Liu, Zhang, 2015). К прямым относится синтез бактериями некоторых метаболитов (ауксинов, цитокининов и гиббереллинов), индукция 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазы, продуцирование сидерофоров, синтез антибиотиков и цианида водорода (HCN), летучих и гормоноподобных соединений. Косвенные механизмы включают в себя растворение минералов (например, фосфора), индукцию системного защитного ответа, а также облегчение усвоения растениями различных питательных веществ из окружающей среды, например, растворение фосфатов и фиксация атмосферного азота (Glick, 1994; Glick, 1995; Кравченко и др., 2002; Wu et al., 2005; Kao et al., 2005; Цавкелова и др., 2005; Kang et al., 2006; Цавкелова и др., 2006; Ashraf, 2013).
Существует много работ, посвященных исследованию образования ассоциативных симбиотических систем на корнях небобовых растений различными штаммами ризобий. Кроме того, было обнаружено, что клубеньковые бактерии способны существовать в почве даже в отсутствие бобового растения-хозяина и колонизировать корни небобовых растений (Perez-Montano, 2014). Так была показана возможность колонизации бактериями R. leguminosarum bv. phaseoli корней кукурузы и салата (Chabot et al., 1996). Эндофитная колонизация ризобиями небобовых растений была обнаружена на таких растениях как рис (Yanni et al., 2001), кукуруза (Gutirrez-Zamora, Martnez-Romero, 2001; Lopez-Guerrero, 2013), табак (Ji et al., 2010). Показана колонизация корней томата и перца штаммами R. leguminosarum и стимуляция роста этих растений (Garcia-Fraile et al., 2012). Также обнаружено, что ризобии способны образовывать биопленки на корнях арабидопсиса и рапса (Santaella et al., 2008).
Таким образом, бактерии рода Rhizobium (клубеньковые бактерии или ризобии) являются одной из наиболее важных и перспективных групп PGPR, поскольку инокуляция ими бобовых и небобовых растений может широко применяться в сельском хозяйстве для повышения урожайности (Sturtevant, Taller, 1989; Costacurta, Vanderleyden, 1995; Antoun et al., 1998; Maturi et al., 2005 a,b; Тихонович, Круглов, 2006; Pena, Reyes, 2007).
По многим литературным данным ризобии обладают ростостимулирующим эффектом (Lemanceau, 1992), который обеспечивается путем синтеза веществ фитогормональной природы (ауксины, гиббереллины, цитокинины и другие), витаминов, веществ антибиотической и противогрибковой природы, фиксации молекулярного азота и ингибирования синтеза этилена растений, улучшая поглощение питательных веществ, повышенной стрессоустойчивости, растворения неорганического фосфата и минерализации органического фосфата. Кроме того, ризобии могут способствовать росту небобовых растений, косвенно взаимодействуя с другими полезными микроорганизмами (Цавкелова и др., 2005, 2006; Kao et al., 2005; Kang et. al., 2006).
Тем не менее, некоторые исследования показали, что инокуляция растений ризобиями также может оказывать и негативное влияние на рост и урожайность небобовых. Например, R. leguminosarum bv. trifolii, выделенный из клубеньков клевера, ингибирует развитие риса (Perrine et al., 2001). Аналогичным образом, Antoun и соавт. (1998) и Antoun и Prevost (2006) показали, что штаммы Rhizobium проявляют двойственный эффект воздействия на рост небобовых культур как положительный, так и негативный. В виду этого они пришли к выводу, что только конкретные штаммы Rhizobium и Bradyrhizobium могут обладать потенциалом для использования их в качестве PGPR небобовых растений (Antoun et al., 1998; Antoun, Prevost, 2006).
Выделение и очистка ДНК бактерий
Приоритетным направлением экологического земледелия является использование всего потенциала растительно-микробных взаимоотношений, благодаря которым возможно увеличение качества и количества урожая (Van Aarie, Olsson, 2003; Лабутова и др., 2006; Тихонович, Проворов, 2009). Следовательно, закономерным является повышение интереса к микробным препаратам, выделенным из естественных биоценозов, которые не загрязняют окружающую среду и безопасны для человека и животных (Шерстобоева и др., 1997; Сафронова и др., 2007; Омельянець и др., 2008). Такие препараты, содержащие живые микроорганизмы, способствуют улучшению питания растений, регуляции роста и развития, а также защиты от фитопатогенов (Іутинська и др., 2002; Смірнов и др., 2002; Иутинская и др., 2010). Одним из наиболее эффективных способов улучшения экологического земледелия является обработка растений симбиотическими для них видами микроорганизмов, при этом наибольшую эффективность показывает совместная обработка (двойная инокуляция) растений несколькими видами или штаммами микроорганизмов (Борисов и др., 2004; Лабутова и др., 2004). Основным недостатком моноинкуляции является нестабильность действия бактерий, так как на них могут негативно влиять неблагоприятные условия окружающей среды или же низкая конкурентоспособность понижает вероятность инокуляции макросимбионта. А в двойных культурах один из компонентов может быть более устойчивым к условиям окружающей среды и нести дополнительные функции (Иутинская и др., 2010).
Проводилось много исследований по обработке бобовых и небобовых растений методом двойной инокуляции. Выяснилось, что при совместной обработке Azospirillum brasilense и Arthrobacter diacomelloi, бактерии секретируют большее количество фитогормонов, чем при моноинокуляции. Это может объясняться тем, что в природных сообществах микроорганизмы постоянно взаимодействуют и усиливают функции друг друга (Цавкелова и др., 2006). Также при совместной обработке растений томата P. fluorescens, P. putida, Enterobacter cloacae и микоризным грибом Glomus intraradices выявлено уменьшение заболевания фузариозом до 58,6% (Akkoprii, Deneir, 2005). Способ совместной обработки небобовых культур, например, рапса ассоциацией бактерий Azotobacter nigricans и Bacillus sp (Ковальская и др., 2001), а также риса и шелковицы (Sekar et al., 2000; Гончар и др., 2007), показал свою эффективность. Двойная инокуляция растений кукурузы, рапса, пшеницы и ячменя биоудоборением на основе бактерий Rhizobium, Bradyrhizobium, Synorhizobium, а также A. chroococcum и Paenibacillus polymyxa способствовала росту растений и накоплению в них азота (Степанян и др., 2010). А инокуляция корней пшеницы A. brasilense и R. meliloti увеличивала количество адгезированных ризобий с 0,67 105 КОЕ/г до 21 105 КОЕ/г (Askary et al., 2009).
Совместная обработка сои клубеньковыми бактериями B. japonicum А1017 с gusA-мечеными штаммами P. fluorescens 2137, P. fluorescens WCS365, Azospirillum lipoferum 137, Azomonas agilis 125 показала активную колонизацию корней ризобактериями, при этом увеличилось количество клубеньков на корнях сои и их нитрогеназная активность (Chebotar et al., 2001). Из ризосферы фасоли были отобраны не образующие клубеньки Agrobacterium-подобные (Agrobacterium-like strains – ALS) штаммы бактерий и помечены gusA геном. Дальнейшая совместная инокуляция растений R. leguminozarum bv. phaseoli и gusA-ALS показала активную колонизацию ALS-штаммом клубеньков, образуемых ризобиями (Mhamdi et al., 2005). Была показана большая эффективность работы бактерий рода Azotobacter в ассоциации с другими ризобактериями (Мельникова и др., 2002; Моргун и др., 2009). Так, комплексная инокуляция растений показала свою эффективность, при этом правильно подобранные сокультивируемые бактерии имеют большую стабильность и эффективность в разных климатических условиях (Андреюк и др., 1999; Кириченко и др., 2014).
Существуют работы, описывающие двойную инокуляцию, когда бобовые растения обрабатывают ризобактериями, а в качестве второго компонента используют арбускулярную микоризу (АМ). Так было показано, что при обработке сои клубеньковыми бактериями B. japonicum и АМ грибом G. intraradices как монокультурой, так и двойной инокуляцией общая биомасса растений и масса зерна увеличилась по сравнению с контролем, при этом на фоне сортовых различий появлялось специфическое действие каждого способа обработки на развитие растений. Но, тем не менее, по многим показателям совместный способ инокуляции оказался более эффективным (Лабутова, Левина, 2011). Исследование по двойной инокуляции на растениях фасоли показал, что обработка фасоли биопрепаратом на основе клубеньковых бактерий штамма 653а и АМ грибом G. intraradices увеличило число клубеньков в 2,2 раза, потребление азота в 1,5 раза. Биопрепараты оказывали положительное влияние и при раздельной обработке, но все же большую эффективность показывала совместная обработка растений фасоли (Парахин и др., 2008).
Применение на практике биологических и комбинированных препаратов на основе ризобактерий, является одним из главных направлений в сельском хозяйстве для получения экологически чистой продукции безопасной для человека. Таким образом, перспективными являются работы, посвященные поиску и получению бинарных удобрений на основе ризобактерий для применения в сельском хозяйстве.
Агробактериальная трансформация листовых пластинок растений табака
Полученные нами данные показывают, что обработка растений штаммами R. leguminosarum с повышенной экспрессией RapA1 увеличивает количество клубеньков и, соответственно, нитрогеназную активность, что, возможно, связано с лучшей адсорбцией ризобий на поверхности корней на начальных этапах симбиоза. Несомненно, улучшение ростовых параметров, сырой и сухой биомассы связано с улучшением азотного питания растений (табл. 9).
При этом рекомбинантный штамм ризобий оказал лучшее влияние на растения, показывая наибольший эффект на все параметры. Повышение числа клубеньков, сформировавшихся на корнях опытных растений, может свидетельствовать о связывании RарA1 с полисахаридными компонентами клеточной стенки корней фасоли.
Влияние конститутивной экспрессии гена rapA1 в клетках микросимбионта на эффективность образования клубеньков, нитрогеназную активность, биомассу и ростовые параметры растений
Штаммыбактерий дляобработкирастений фасоли Количествоклубеньков (шт) Длинастебля(см) Сыраябиомасса (г) Сухаябиомасса(г) Нитрогеназная активность(мкг N2/мл/час) контроль — 13±0,7 3,6±0,4 0,72±0,15 — R. leguminosarum PVu5 7±2 16±2,3 5,8±0,8 0,92±0,12 0,03±0,003 R. leguminosarum PVu5+RapAl 15±3 25±3,1 8,1±0,5 2,8±0,17 0,062±0,018 Подобные эксперименты ранее проводились на клевере (T. pratеnse), где повышенная конститутивная экспрессия гена rapA1 в плазмиде pHC60 положительно влияло на конкурентоспособность штаммов ризобий R. leguminosarum bv. trifolii и R. etli, а также было показано увеличение адсорбционной способности бактерий к корням растений в 2-5 раз. Однако авторы данной работы подсчета количества образовавшихся клубеньков не проводилось (Mongiardini et al., 2008, 2009). Также изучалась адсорбция данного штамма к корням люцерны и сои, которые не являются его природными макросимбионтами, однако клетки R. leguminosarum прикреплялись к корням растений, а повышенная экспрессия rapA1 увеличивала уровень адсорбции бактерий (Mongiardini et al., 2008). Таким образом, можно сделать вывод, что белок RарA1 обладает более широкой специфичностью, а не только сродством исключительно к растению-хозяину из семейства бобовых. Существуют работы, описывающие другие ризобиальные адгезины, которые также могут неспецифически узнавать поверхность корней бобовых растений (Lodeiro, Favelukes, 1999). К ним относятся такие агглютинины, как a-L-фукоза-связывающий лектин Rhizobium lupini (Wisniewski et al., 1994) и белок BJ38 Bradyrhizobium japonicum (Ho et al., 1990). Существование таких неспецифических адгезинов повышает адаптивные возможности ризобий и позволяет им успешнее конкурировать с другими почвенными бактериями (Bogino et al., 2013).
Впервые Ausmees с соавт. (2001) высказали предположение, что белок RарA1 подобен лектину сои и трифолину А, и он узнает не только полисахариды бактерий, но и растений, играя немаловажную роль в формировании азотфиксирующего симбиоза (Ausmees et al., 2001).
Считается, что адгезия и специфическое узнавание при формировании азотфиксирующего симбиоза зависит от взаимодействия между производимыми ризобиями NF и LysM рецептор киназами макросимбионта (Oldroyd, Downie, 2008), но нельзя говорить о том, что данная система является единственным механизмом при узнавании симбиотических партнеров и адсорбции ризобий к поверхности корневых волосков растений. Возможно, она является основным звеном в сложном процессе, где также участвуют бактериальные белки RарA1. Кроме того, в специфических взаимодействиях между ризобиями и растением участвуют растительные лектины. Так, например, было показано участие лектинов, таких как PSL (лектин Pisum sativum (Diaz et al., 1989)), Le1 (лектин Glycine max (van Rhijn et al., 1998)), GS52 и DB46 (лектин Glycine soja и Dolichos biflorus, соответственно (Etzler et al., 1999; Day et al., 2000)) в процессах специфического узнавания ризобий в системе растение-хозяин. Возможно, адгезия с помощью белка RарA1 является одним из механизмов адсорбции и колонизации корней растений ризобиями, что, в случае бобовых связано с последующим формированием клубеньков.
Несомненно, использование гена rapA1 в качестве трансгена может помочь в создании ассоциативных взаимодействий ризобий с небобовыми растениями, где данный белок, как и лектины бобовых растений (Vershinina et al., 2012), может оказаться хорошим инструментом для модификации симбиотических взаимодействий. А также биопрепараты на основе рекомбинантных ризобий могут найти свое применение в сельском хозяйстве в рамках перехода на экологическое земледелие.
Оценка влияния рекомбинантных штаммов ризобий на образование клубеньков, нитрогеназную активность и ростовые параметры на растения фасоли
Трансгенные растения табака получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Gallois, Marinho, 1994). Для этого использовали листья растений 3-месячного возраста. В результате было получено 65 первичных побегов с целевой генно-инженерной конструкцией. Из них укоренились 36 первичных трансгенных побегов на селективной среде, из которых у 27 с помощью гистохимического анализа обнаружилась активность репортерного гена GUS в листьях – листья окрашивались в сине-голубой цвет (Jefferson et al., 1987) (рис. 14).
Из отобранных положительных растений 20 акклиматизировались к условиям почвы и использовались для дальнейших исследований. Из оставшихся опытных растений табака была выделена тотальная растительная ДНК и проведен ПЦР-анализ с праймерами rapF и rapR, фланкирующими полноразмерную последовательность гена. Было показано, что все 20 отобранных растений содержат в своем геноме целевой ген. Далее была определена транскрипционная активность гена rapA1 в полученых трансгенных растениях табака путем ОТ-ПЦР анализа, показавшим наработку мРНК с трансгена (рис. 15). Также был поставлен контрольный ПЦР-анализ на наличие ДНК в препаратах мРНК, где результаты были отрицательными.
Размер ампликона составил около 750 п.н., что совпадает с теоретически ожидаемым размером. В контрольных растениях гистохимический анализ, ПЦР и ОТ-ПЦР дали отрицательный результат.
Таким способом, было получено Т0-поколение трансгенных растений табака. Далее получили семена и смотрели расщепление Т1-поколения на гигромицине. Для дальнейших экспериментов использовали линии, которые дали расщепление на антибиотике 3:1 (табл. 12).
Для дальнейших исследований посадили в почву 15 линий трансгенного табака, с которыми также провели гистохимический анализ на активность гена GUS, ПЦР-анализ ДНК из листьев на наличие гена rapA1 и ОТ-ПЦР, чтобы проверить активность экспрессии гена rapA1. Все линии дали положительный результат.
Для определения продукции белка RapA1 был поставлен Вестерн-блот анализ белков, выделенных из трансгенных растений (рис. 16).
В качестве контроля рассматривали растения, несущие Т-ДНК pCambia 1305.1 без целевого гена (Кулуев и др., 2013).
После разделения белков пластины неокрашенного геля были подвергнуты процедуре иммуноблоттинга, где нитроцеллюлозные мембраны с перенесенными на них белками инкубировали в буфере с поликлональными кроличьими антителами. В результате анализа из 15 линий растений у 11 на мембране детектировали полосы размером около 25 кДа, что соответствовало ожидаемому размеру белка RapA1. Дальнейшие эксперименты проводили с трансгенными растениями, показывавшими положительный результат.
Проведенное исследование доказывает стабильную продукцию белка RapA1 трансгенными растениями табака.
Локализацию целевого белка RapA1 на поверхности корней трансгенного табака наблюдали с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием первичных антител к белкам RapA1 и вторичных антител, меченых Alexa Fluor 488. В качестве контроля для исключения автофлуоресценции взяли фрагменты корней контрольных нетрансгенных растений (рис. 17).
Иммунофлуоресцентный анализ локализации белка на корнях растений табака. А – корни контрольного растения; Б – корни трансгенного по гену rapA1 растений табака Данные показывают, что трансгенные растения действительно секретируют белок RapA1 на поверхность корней. Этим подтверждается правильное функционирование векторной конструкции pCambia1301LPSLRapA1 в трансгенных растениях табака. Далее проводили проверку адгезии бактерий к корневым волоскам трансгенного табака. Для этого корни растений, трансгенных по гену rapA1, а также контрольных растений табака в возрасте одного месяца инокулировали ризобиями R. leguminosarum, маркироваными красным флуоресцентным белком (RFP) (рис. 18).
Анализ показал, что на корнях растений табака, трансгенных по гену rapA1, сорбировалось в среднем в 2 раз больше клеток бактерий R. leguminosarum+RFP (рис. 19).
Полученные результаты подтверждают, что белок RapA1 принимает участие в процессах узнавания и прикрепления бактерий к корням растений, однако такая незначительная разница в количестве адгезированных клеток показывает, что получение трансгенных растений трансформированных геном адгезина RapA1 не является перспективным методом для создания ассоциативных симбиозов, в отличие, например, от некоторых растительных агглютининов, в частности лектина PSL гороха, который способен избирательно и эффективно связывать полисахариды на клеточных стенках определенных штаммов ризобий (Vershinina et al., 2012). Однако, так как наши эксперименты были проведены лишь на трансгенных растениях табака трансформированных геном адгезина RapA1, использование данного гена для трансформации других растений с целью получения искусственных ассоциативных систем требует дальнейшего изучения.
Ранее в нашей лаборатории подобное взаимодействие наблюдалось при использовании в качестве трансгена лектина козлятника восточного GORL. Исследование адгезии флуоресцентно меченых бактерий R. galegae (микросимбионтов козлятника восточного) к корням трансгенных по гену GORL растений табака показало, что на корнях опытных растений сорбировалось в 4 раза больше бактерий R. galegae по сравнению с контрольными растениями (Чубукова и др., 2015; неопубликованные данные).
Таким образом, возможно использование бактериального адгезина RapA1 R.leguminosarum в качестве инструмента для улучшения эффективности формирования существующих симбиотических систем (что было наглядно показано на фасоли), создания бинарных удобрений (показано на фасоли и козлятнике) и создания бактериально-растительных ассоциаций de novo (показано на табаке). Полученные результаты подтверждают, что белок RapA1 принимает участие в процессах узнавания и прикрепления бактерий к корням растений, однако данное взаимодействие не является строго избирательным и специфичным, что делает этот адгезин достаточно лабильным инструментом для формирования новых симбиотических систем.