Введение к работе
Актуальность проблемы.
Морские гетеротрофные микроорганизмы являются важной составной частью морских экосистем и играют существенную роль в биологических процессах морской среды. Бактерии рода Alteromonas - типичные представители морских прокариот - составляют значительную часть бактериального комплекса морских биоценозов [Baumann et al., 1972; 1981; 1984].
Исследования показывают, что микроорганизмы морской среды и бактерии рода Alteromonas, в частности, способны синтезировать уникальные разнообразные физиологически активные вещества: антибиотики, токсины, витамины, ферменты, лротивовирусные н противоопухолевые вещества [Sieburth,. 1971; Okani et al., 1975; Okami, 1982; Okutani, 1984; Kamei et al., 1987; Nair, Simidu, 1987; Austin, 1988, 1989; Fenical, 1993].
Среди бактерий рода Alteromonas выделены штаммы-продуцеяты антибиотиков бромпиррола [Burkholder et al. , 1966] и изатина [Gil-Turnes et al., 1989]; тетродотоксина [Simidu et al., 1990]. Изучены альтеромонады - продуценты гидролитических ферментов: агараз [Yaphe, 1957; 1962], каррагиназ [Weigl, Yaphe, 1966], протеази [Dohmoto, Miyachi, 1991], хитиназы [Tsujibo et al., 1991].
Исследования показали, что бактерии рода Alteromonas могут служить источниками некоторых ферментов нуклеинового обмена: внеклеточной экзонукл'еазы [Wei et al., 1983], рестриктаз [Дедков et al., 1990], щелочной фосфатази [Федосов et al., 1991]. Однако, нуклеазы морских бактерий, в том числе, рибонуклеазы альтеромонад изучены недостаточно. Исследований по специфическим эндорибонук-леазам бактерий рода Alteromonas не обнаружено. Малоизученной областью остаются и такие практически важные энзимы бактерий как тирозиназы. Описаны тирозиназы морских бактерий Alteromonas sp. 2-40 [Kelley et al., 1990] и Shewanella colwelliana [Weiner et al., 1991]. В связи с этим представляется перспективным дальнейшее изучение физиологической активности бактерий рода Alteromonas с целью выделения штаммов-продуцентов нуклеаз и тирозиназ.
По мнению У.Феникала [Fenical, 1993], несмотря на проводимые исследования, достаточно полно изучено менее 1 % бактерий, изоли-
- 2 -рованных из морской среды. Фундаментальное изучение биологии морских микроорганизмов, в том числе альтеромонад, является базисом для успешного развития морской микробиологии и биотехнологии, химии морских соединений.
В последнее десятилетие исследования по таксономии морских бактерий получили дальнейшее развитие [De Vos et al., 1989]. Охарактеризовано несколько новых видов альтеромонад A.tetraodonis [Simidu et al., 1990], A.carrageenovora и A.atlantica [Akagawa-Matsushita et al.,1991]. Однако генотаксономические исследования, в том числе результаты РНК-ДНК гибридизации [Van Landschoot, De Ley, 1983], свидетельствуют о гетерогенности видов бактерий этого рода, в связи с чем таксономическое направление в исследовании морских альтеромонад и альтеромонадоподобных бактерий представляется перспективным.
Целью настоящей работы было изучение морфолого-биохими-ческих, генотипических свойств, исследование физиологической активности и таксономии морских бактерий рода Alteromonas; выделение и культивирование штаммов альтеромонад - источников некоторых ферментов.
Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
-
Выделить из различных источников морской среды.и изучить морфологические, физиолого-биохимические и генотипические свойства культур бактерий рода Alteromonas.
-
Изучить физиологическую активность выделенных штаммов альтеромонад по следующим направлениям:
исследование гидролитической активности;
наличие антагонистических свойств;
исследование внутриклеточной нуклеазной активности;
определение уровня тирозиназной активности.
3. Определить таксономическое положение меланин-синтезирую-
щего штамма бактерий Alteromonas sp. КИМ 638.
4. Определить таксономическое положение 4-х буропигментиро-
ванных агаролитических штаммов бактерий Alteromonas sp. КММ 216,
КИМ 250, КММ 256, КММ 504.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые изучена гидролитическая, нуклеазная, тирозиназная активность свободноживущих глубоководных штаммов бактерий рода /Alteromonas и бактерий-ассоцнантов морских асцидий. Показано, что
бактерии рода Alteromonas обладают' высоким уровнем физиологической активности и могут служить источниками получения гидро-лаз, нуклеаз, рестриктаз, тирозиназ. Впервые установлено, что альтеромонады проявляют высокий уровень активности специфических рибонуклеаз. Выделены и охарактеризованы штаммы-продуценты специфических эндорибонуклеаз и тирозиназ. Изучение фенотипических, генотипических свойств и ДНК-ДНК гибридизации бактерий штамма КММ 638, синтезирующих меланоидный пигмент, и 4-х буропигментирован-ных агаролитических бактерий КММ 216, КММ 250, КММ 256, КММ 504 показало, что выделенные бактерии, относятся, вероятно, к двум новым видам бактерий рода Alteromonas.
Практическая значимость работы.
Выделен штамм бактерий A.haloplanktis КММ 223 - продуцент полиуридил-специфической эндорибонуклеазы.Получено положительное решение о выдаче патента Российской Федерации по заявке 5056929 от 17 марта 1993 г. на изобретение "Штамм бактерии Alteromonas haloplanktis - продуцент полиуридил-эндорибонуклеазы".
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Бактерии рода Alteromonas обладают высоким уровнем гидролитической активности и способны синтезировать комплекс различных гидролаз.
-
Бактерии рода Alteromonas, ассоциированные с морскими асцидиями, проявляют антимикробную активность в отношении P.vulgaris, С.albicans, S.aureus.
-
Морские альтеромонады обладают внутриклеточной нуклеазной активностью и способны продуцировать нуклеазы, в том числе, специфические рибонуклеазы, а также эндонуклеазы рестрикции. Активные штаммы бактерий представлены видами A.haloplanktis, A.atlantica, A.fuliginea sp.nov.
-
Глубоководный штамм бактерий A.haloplanktis КММ 223 -продуцент фермента, специфически расщепляющего полиуридиловую кислоту.
5.Бактерии рода Alteromonas могут служить источниками тирозиназ и проявляют высокий уровень тирозиназной активности в клетках и культуральной жидкости.
6. На основании изучения ДНК-ДНК гибридизации штамма бактерий КММ 638 и типовых альтєромонад выделенные бактерии могут быть отне-
- 4 -сены к новому виду бактерий рода Alteromonas. Бактерии образуют латеральные жгутики и синтезируют меланоидный пигмент, диффундирующий в среду.
7. Изучение ДНК-ДНК гибридизации и физиолого-биохимнческих свойств буропигментированных агаролитических бактерий показало, что эти бактерии представляют, вероятно, новый вид альтеромонад.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всесоюзном совещании " Биологически активные вещества гидробионтов при комплексной утилизации ресурсов океана", ТИНРО, Владивосток, 1988 г.; Всесоюзной школе-конференции молодых ученых "Физиология, биохимия и генетика микроорганизмов - фундаментальная основа биотехнологии"/Г-г.Алушта, 1990 г.; Научно-практической конференции ТИБОХ ДВО РАН, 1993 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов. Материалы изложены на 140 страницах машинописного текста, иллюстрированы 22 таблицами и 5 рисунками. Указатель литературы содержит 29 отечественных, и 153 иностранных источника.