Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз Ильинская, Ольга Николаевна

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Ильинская, Ольга Николаевна. Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз : диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.07.- Казань, 1998.- 213 с.: ил. РГБ ОД, 71 99-3/196-0

Введение к работе

Актуальность проблемы. Биологически активные вещества эндогенного и экзогенного происхождения, не вовлекаясь непосредственно в основной метаболизм клеток, могут оказывать разнообразное влияние на функции клеток, тканей и целого организма. Изучение действия эффекторов на организмы различного эволюционного уровня является классической задачей биологии.

К настоящему времени обнаружено огромное количество факторов, которые подразделяют на активирующие биологические процессы и ингибирующие их, исходя из типа установленного эффекта. Знаменитое высказывание Парацельса "доза разграничивает яд и лекарство" датируют началом XVI века. Однако биологически активные вещества в сегодняшней практике применяют в области конкретного эффекта, не всегда учитывая последствия их альтернативного действия. Противоположная область эффектов и регуляция переключения клеточного ответа с одного типа на другой остаются малоизученными. Тем не менее накоплена масса данных о разнонаправленном действии ряда факторов в зависимости от концентрации: стимулирующем влиянии малых доз мутагенов [Раппопорте соавт., 1980], афлатоксина [Halt, Sutic, 1989], озона [Мельникова с соавт., 1989]; мутагенной активности стимуляторов роста растений [Конобеева, 1987]; активирующем и ингибирующем рост действии нуклеаз [Folkman, Klagsbrun, 1987; Куприянова-Ашина, 1989, 1992; Nitta et al., 1996], продуктов жизнедеятельности микроорганизмов [Филимонова, 1985], ан-тиоксидантов [Горбатенко, 1997].

Работами школы микробиологов Казанского университета впервые установлен ряд закономерностей регуляции синтеза нуклеаз бактерий и указано на неоднозначность проявления биологических эффектов экзогенных ферментов [Куприянова-Ашина, 1989, 1992; Лещинская с соавт., 1991]. Поскольку рибонуклеазы, как новый класс цитотоксических агентов, считают, с одной стороны, вызывающими торможение роста опухолей и размножения вирусов [Karpetsky, Levy, 1981; Куриненко с соавт., 1988; Youle etal., 1993; Prior et al., 1996], а с другой - стимуляторами роста растений и микроорганизмов [Колпаков и Куприянова, 1992; Наумова с соавт., 1997], возникает насущная необходимость комплексного изучения разнонаправленных биологических эффектов бактериальных РНКаз на объектах различного эволюционного уровня. Известно, что изменение направленности эффекта при переходе от низких доз к высоким, достаточно индивидуальном для конкретного вещества и организма, осуществляется с помощью некого триггерного механизма, ответственного

за проявление условных положительных и отрицательных эффектов. Вместе с тем отрицательный с позиций отдельного организма эффект на уровне популяции может быть рассмотрен как благоприятный, способствующий ее выживанию и адаптации. Вышеизложенное обусловливает актуальность исследования биохимических механизмов проявления того или иного типа клеточного ответа под действием биологически активных соединений, каковыми являются бактериальные рибонуклеазы.*

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось установление биохимических механизмов разнообразия клеточных ответов под действием экзогенного эффектора - бактериальной рибонуклеазы - на организмах различного эволюционного уровня.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи.

  1. Выявить спектр условно положительных эффектов микроконцентраций и охарактеризовать комплекс условно отрицательных эффектов макрсконцентраций рибонуклеазы по отношению к грамположительной и грамотрицательной прокариоти-ческой клетке.

  2. Оценить закономерности проявляемых биназой воздействий на клетках низших эукариот - дрожжей и микромицетов.

  3. Изучить действие широкого диапазона концентраций РНКазы in vivo на многоклеточных организмах различного эволюционного уровня (насекомые, млекопитающие).

  4. Охарактеризовать биологическую активность рибонуклеаз in vitro в системе изолированных органов (почка грызунов).

  5. Сравнить влияние экзогенной рибонуклеазы на культуры нормальных и трансформированных онкогенами клеток животных.

  6. Исследовать влияние экзогенной биназы на первичную (лимфоциты) и перевиваемую (эпителиальнолодобные клетки карциномы легких) культуру клеток человека.

  7. Используя мутантные производные бактериальной рибонуклеазы, полученные методом сайт-специфического мутагенеза, оценить вклад специфического и неспецифического взаимодействия эффектора с клеткой в регистрируемый эффект.

* В работе использованы общепринятые тривиальные названия гомологичных РНКаз Bacillus intermedius (биназа) и Bacillus amyloliquefaciens (барназа).

8. Установить ключевые этапы взаимодействия рибонуклеазы с клеткой, необходимые и достаточные для проявления определенного типа клеточного ответа, и провести сравнительный анализ их вовлеченности в универсальную цепь передачи сигналов.

Научная новизна. С позиций системного эволюционного подхода исследован широкий спектр разнонаправленных биологических эффектов, вызываемых экзогенной бактериальной рибонуклеазой при действии ее на клетки прокариот, низших эу-кариот и многоклеточных животных, включая человека. Получен ряд приоритетных данных, пополняющих фундаментальные знания о регуляторных системах живой клетки. Впервые проведена широкомасштабная работа с полным валидным набором тестерных систем различного эволюционного уровня, с оригинальным применением нового уникального инструментария - нативного и ряда мутантных ферментов с направленно измененной каталитической активностью - для оценки вклада специфических и неспецифических взаимодействий эффектора с клеткой. Это позволило выявить общие закономерности функционирования клеток различной архитектоники и уровня организации в ответ на действие эффектора, влияющего на нуклеиновые кислоты, и сформулировать гипотезу общности в проявлении клеточного ответа. В результате проведенных исследований, на защиту выносятся следующие научные положения, отражающие новизну проделанной работы.

Основные защищаемые положения диссертации

Малые концентрации РНКазы в среде культивирования ("I0"7 - 1СГ4 мг/мл) обладают стимулирующим рост и деление действием по отношению к клеткам бактерий и эукариот, причем стимулирующее действие сопряжено с активацией процессов дыхания целых клеток и изолированных митохондрий, а также с повышением активности ключевых ферментов, в частности, сукцинатдегидрогеназы. Дестабилизация мембран поверхностно-активным веществом приводит к увеличению стимулирующего эффекта РНКаз. В области стимулирующих доз (10"5 - 10"3 мг/мл) биназа обладает также антимутагенным действием, активируя работу репарациионных систем клетки.

Высокие концентрации биназы (0.1 -10 мг/мл) обладают токсическим и гено-токсическим действием по отношению к микроорганизмам и высшим животным, а также в системе изолированных органов и в культурах клеток животных и человека. Между активирующими и подавляющими концентрациями лежит интервал

"нейтральных" доз, характеризующийся сбалансированной настройкой стимулирующих и ингибирующих сигнальных путей, приводящих к отсутствию стенотипического эффекта.

Основной вклад в стимуляцию жизнедеятельности микроорганизмов, так же, как и в проявление токсических и генотоксических эффектов на всех тестерных системах клеток и организмов различного эволюционного уровня, вносит каталитическая активность рибонуклеаз. Обнаруженная тенденция к проявлению стимулирующего эффекта малоактивными рибонуклеазами связана с наличием независимых от каталитической функции аффинных взаимодействий фермента с клеточной поверхностью.

Цитоплазматическая мембрана является ключевым звеном в эффекторном пути, активируемом рибонуклеазой. Каталитически активные ферменты воздействуют на мембраносвязанную РНК, вызывая увеличение содержания нуклеотидов в среде инкубации. Проявление тонкой специфики действия биназы, а именно изменение секреции ферментов целлюлазного комплекса, блокирование Са2+-зависимого калиевого тока ионных каналов ras-трансформированных клеток, увеличение выхода из клеток микроорганизмов ионов электролитов, - обусловлено изменением свойств клеточных мембран.

Повреждения ДНК, вызываемые в клетках под влиянием каталитически активной РНКазы, являются следствием нарушения внутриклеточного гомеостаза при индуцированном изменении свойств мембраны и запуске ряда эндогенных процессов, в частности, активации белка RecA у низших организмов и Са2+-зависимых эн-донуклеаз у высших, приводящих к индукции мутаций в ходе ошибочной репарации и фрагментации ядерной ДНК соответственно.

Теоретическая и практическая значимость. Создана принципиальная теоретическая схема универсального переключения типа клеточного ответа под действием экзогенного белкового эффектора, обладающего ферментативной активностью, на модельных системах про- и эукариотических клеток. Выявлены фундаментальные закономерности включения сигнальных систем живой клетки при их активации экзогенной рибонуклеазой в широком диапазоне концентраций. Определен вклад аффинных взаимодействий и специфическая роль собственно рибонуклеолитиче-ской активности в реализацию индуцируемых эффектором функций клетки. Проведенное теоретическое обоснование механизмов действия РНКазы in vitro и in vivo

позволяет выработать корректные рекомендации для практического применения фермента в биотехнологии и медицине.

Практическое использование фермента в малых дозах возможно не только в качестве стимулятора роста, но и для направленного увеличения выхода определенных биологически активных веществ, что несомненно важно учитывать при разработке новых промышленных биотехнологий. Выявленное антимутагенное действие биназы предполагает новый аспект ее применения в качестве репарационного био-антимутагена. Дальнейшее углубленное изучение тонких аспектов проблемы апоп-тических изменений клеток и блокирования биназой Са2+-зависимого калиевого тока ионных каналов, специфичных для онкотрансформированных клеток, может стать основой создания противоопухолевых препаратов нового поколения. Несомненную практическую значимость имеет полная и всесторонняя оценка генотоксических свойств биназы в макродозах, необходимая для любого практического использования фермента. Выделение, характеристика и разработанный способ культивирования целлюлолитического микромицета, защищенные двумя патентами РФ, найдут применение в промышленном получении ферментов целлюлазного комплекса.

Связь работы с базовыми научными программами. Работа в течение 1988-1998гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ госрегистрации 01910049994). Исследования в рамках тематики работы были поддержаны грантами Санкт-Петербургского университета (1992-1993гг., № 2-101-30-53, направление "Биология: молекулярные механизмы стабильности живых систем"; 1997г., "Исследования в области фундаментального естествознания" № 97-0-10.190), грантом Академии Наук Республики Татарстан (1997г.); финансировались как составная часть программы "Университеты России" (1992-1996гг., проект "Ферменты микроорганизмов"; 1997г., №532 "Фундаментальные исследования"), В 1992-1993г. инициативный исследовательский проект получал поддержку фонда Восточной Европы Объединенной высшей технической школы и университета Цюриха (Швейцария), в 1993-1994ГГ., 199бг, 1997г. - поддержку Немецкой Службы Академических Обменов (ФРГ). Автор использовал опыт анализа представленного материала для активного персонального участия в разработке государственной программы "Генетическая безопасность населения Республики Татарстан", получившей одобрение Кабинета Министров РТ в 1998г.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных конференциях, школах, симпозиумах: школе-семинаре "Молекулярные механизмы мутагенеза и канцерогенеза" (Хаддинг, Швеция, 1994), симпозиуме "К столетию Бейеринка" (Гаага, Нидерланды, 1995), 7-ом европейском конгрессе по биотехнологии (Ницца, Франция, 1995), 14-ом съезде "Технологии животных клеток: от вакцин до генетической медицины" (Алгавре, Португалия, 1996), 4-ой конференции "Рибонуклеазы: химия, биология, биотехнология" (Гронинген, Нидерланды, 1996), ежегодном съезде Общества Токсикологов (Рестон, США, 1998), Форуме прикладной биотехнологии (Брюгге, Бельгия, 1998). Основные положения работы были представлены также на конференциях "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993), "Нуклеазы микроорганизмов" (Рига, 1989; Казань, 1989, 1991, 1998) и вошли в отчетные доклады по темам полученных грантов и НИР КГУ.

Публикации. Основной материал диссертационной работы нашел отражение в 42 печатных работах, из которых 21 статья в ведущих отечественных и зарубежных журналах, 2 патента РФ, 19 тезисов и материалов докладов на Российских и Международных конференциях. Методические разработки и некоторые теоретические аспекты диссертации вошли в 2 учебно-методических пособия для студентов, обучающихся по специальности 2041 -"микробиология".

Место выполнения работы. Основные экспериментальные данные получены автором за время работы на кафедре микробиологи Казанского государственного университета в период с 1988 по 1998гг. Исследования были начаты в кафедральной лаборатории генетической токсикологии КГУ под руководством к.б.н. И.Е.Черепневой и д.б.н. И.Б.Лещинской. Работа по определению биомассы микро-мицетов на нерастворимых субстратах выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г.Пущино) при участии к.б.н. Н.Б.Горкиной. Промышленное испытание способа культивирования целлюлолитического гриба проведено на химическом заводе под руководством нач.цеха Ф.К.Бадгиева (г.Менделеевск). Мутагенные и антимутагенные свойства биназы в бактериальных тест-системах исследованы в рамках кандидатских работ аспирантов, к.б.н. О.Б.Иванченко и к.б.н. Н.С.Карамовой, выполненных под руководством О.Н.Ильинской. Выделение и очистка мутантных рибонуклеаз, полученных методом сайт-специфического мутагенеза, проведена аспирантом автора к.б.н. Л.В.Кипенской в лаборатории д.х.н. Г.И.Яковлева (Институт молекулярной биологии, г.Москва). Исследования в тесте

SMART с дрозофилой выполнены автором в Институте токсикологии в лаборатории проф. Ф.Вюрглера под руководством др-а Х.Фрая (гг.Шверценбах-Цюрих, Швейцария). Анализ двойных разрывов ДНК методом гель-электрофореза в пульсирующем поле и эксперименты в системе изолированно перфузированной почки автор осуществил в Институте токсикологии (г.Вюрцбург, ФРГ) в научной группе др-а Э.Вок и др-а С.Вамвакаса. Измерения мембранного тока клеток и отдельных каналов проведены автором совместно с немецкими коллегами в Институте фармакологии г.Гиссена (директор проф. Ф.Драйер). Электрофоретическую подвижность клеток автор исследовал в Казанском технологическом университете при участии к.х.н. Ю.Л.Ишханяна, электропроводность клеточных суспензий - на кафедре физиологии растений КГУ при участии к.б.н. А..И.Колпакова и к.б.н. Е.В.Асафовой.

Автор выражает искреннюю благодарность названным сотрудникам и коллективам. Особо автор благодарит ученых, работа под руководством которых сформировала его научное мировоззрение - чл.-корр. РАН, д.б.н., профессора И.С.Кулаева и профессора Дитриха Хеншлера.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных результатов, обсуждения полученных данных и выводов. Текст иллюстрирован 47 рисунками и 16 таблицами. Список литературы содержит 292 наименования, из них 87 работ отечественных авторов и 205 зарубежных.