Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование путей распространения микроорганизмов в природных средах и их активности, прослеживание судьбы популяций в естественных субстратах, контаминация почвы и других природных местообитаний, определение риска попадания микроорганизмов, в том числе патогенных, в организм человека и животных с пищей , в частности с овощной продукцией, продолжает оставаться актуальной задачей (Заварзин, 1989; Кожевин, 1989; Добровольская, 2002; Ranjard, 2001; Natvig, 2002; Ingham, 2004; Semenov, 2004; Franz, 2005; Van Bruggen, 2008).
Традиционным методическим приемом исследования выживания микроорганизмов в естественных субстратах является интродукция их в такие субстраты и прослеживание популяционной динамики в конкретном субстрате. Закономерности поведения сапротрофных микроорганизмов при их интродукции и динамика выживания в одном субстрате неоднократно исследовались (Звягинцев, 1987; Звягинцев и Голимбет, 1983; Кожевин, 1989; Семенов, 2005; Ahn, 2001; Zelenev, 2005). Исследования выживания микроорганизмов, а тем более энтеропатогенов, при последовательном перемещении их из одного в другой или третий субстрат все еще редки (Шустрова и др., 1992; Semenov, 2004).
В подавляющем большинстве работ, связанных с выявлением динамики микроорганизмов в природе и особенно патогенных микроорганизмов, исследователи ограничиваются прослеживанием их наличия и численности только в одном природном субстрате или местообитании (Wang, 1996; Kudva, 1998; Himathongkham, 1999; Jiang, 2002). Однако существует проблема перемещения микроорганизмов из одного местообитания в другие, а тем более перемещения через несколько разных местообитаний в виде цепи и даже с образованием цикла (Семенов, 2005). Закономерности именно такого распространения сапротрофных, а особенно патогенных, микроорганизмов остаются малоизученными, хотя указания на существование такого цикла высказывались давно, а само явление несомненно и интереснее, и важнее, чем просто динамика выживания микроба в одном субстрате (Мишустин и др., 1979; Литвин и др., 1997; Семенов, 2005).
В настоящее время в разных странах широко развернулось движение за производство «экологически чистых» продуктов, охрану природы от бесконтрольной химизации и, в том числе, от распространения генетически модифицированных организмов и, в частности, микроорганизмов (ГММ). В повседневной практике внесение некомпостированного или недостаточно компостированного навоза в почву - нередкость, особенно при использовании «экологически чистых» технологий производства продуктов. Это несет в себе серьезную опасность для человека быть инфицированным такими штаммами бактерий как Е. coli 0157:Н7, Salmonella spp., Campilobacter jejuni, Listeria monocytogenes и другими. Бактерии Salmonella spp., Escherichia coli 0157:H7 являются наиболее распространенными возбудителями пищевых отравлений в мире,
связанных с употреблением инфицированных мясных и молочных продуктов, фруктов, овощей и их производных, в частности, соков и пюре (Altwegg, 1998; Brackett, 1999; Rangel et al., 2005).
Резервуарами и распространителями упомянутых энтеропатогенов традиционно рассматривают животных. Однако последние исследования показывают, что энтеропатогены успешно выживают и вне желудочно-кишечных трактов (ЖКТ) животных (Van Bruggen et al., 2008). Именно этими фактами вызваны те массированные исследования, развернувшиеся в зарубежных научных центрах (Natvig, 2002; Solomon, 2002; Ingham, 2004; Franz, 2005).
Энтеробактерии способны проникать в ткани растений, выживая в них, и поэтому опасность распространения инфекций существенно возрастает (Люлин, 2007; Solomon, 2002; Klerks, 2007).
Таким образом, как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения изучение явления многократного перемещения микроорганизмов через различные, но взаимосвязанные местообитания, способность конкретной популяции проходить по цепи взаимосвязанных субстратов, в том числе в виде цикла и количественные закономерности таких перемещений являются важными и нужными.
Целью работы являлось изучение выживания бактерий, сапротрофных и аналогов энтеропатогенных, при перемещении в цепи природно-связанных субстратов с образованием цикла: животные - экскременты животных - почва - растения и опять животные и выявление количественных закономерностей динамики перемещающихся популяций.
Для выполнения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:
1. В лабораторных экспериментах изучить закономерности выживания аналогов
энтеропатогенных Salmonella Typhimurium МАЕ ПО gfp, Escherichia coli 0157:Н7 gfp и
сапротрофных Pseudomonas fluorescens 32 gfp бактериальных популяций в краткосрочных
экспериментах при интродукции их в экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС) и
последующем перемещении в серии природных субстратов в зависимости от исходной
численности бактерий.
Определить длительность выживания исследуемых популяций бактерий в краткосрочных и долгосрочных экспериментах при интродукции их в ЭКРС и после перемещения в почву при циклически изменяющейся и постоянной температуре, а также при дальнейшем перемещении на растения, через ЖКТ животных и в экскрементах животных.
Определить способность избранных бактерий расти в комбикорме, используемом для кормления разных сельскохозяйственных животных.
4. Изучить способность исследуемых бактерий проходить через ЖКТ коров при
попадании таких бактерий в пищеварительный тракт с кормами, динамику выживания
бактерий в экскрементах и при последующем перемещении бактерий в почву, на
растения и через ЖКТ других животных.
5. Исследовать способность бактерий проходить через ЖКТ птиц (кур) при попадании в ЖКТ с кормами, динамику их выживания в экскрементах и в воде при инокуляции воды такими экскрементами.
Научная новизна. Впервые в серии лабораторных и натурных экспериментов на примере представителей энтеропатогенных и сапротрофных бактерий проведены сравнительные исследования возможности перемещений индивидуальных бактериальных популяций через серию природных местообитаний: животные - их экскременты - почва - растения и опять животные с фактическим образованием цикла. Показана возможность существования укороченных цепей и циклов. Результаты дают основание полагать, что циркуляция микроорганизмов может происходить не только в виде замкнутой цепи-цикла , но и в виде замкнутой сети. Выявлена возможность активного роста энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в комбикорме с последующим прохождением этих бактерий через ЖКТ разных животных. Установлено, что циклически меняющаяся температура, соответствующая природному режиму день-ночь, более негативно действует на выживание энтеропатогенных и сапротрофных бактерий, как в ЭКРС, так и смеси ЭКРС-почва, чем традиционно применяемая в исследованиях постоянная температура. Этот факт необходимо принимать во внимание при оценке риска выживания и распространения микроорганизмов в природе. В круговороте или цикле микроорганизмов имеются местообитания, в которых может происходить увеличение численности микроорганизмов. Показано, что на растениях, может происходить «подращивание» популяций патогенных микроорганизмов. Получено подтверждение положению о том, что численность интродуцента, сравнимая или несколько меньшая численности культивируемых аборигенов, является более оптимальной для прохождения по цепи субстратов, чем очень высокая или очень низкая численности. Установлено, что при интродукции микроорганизмов в природные субстраты имеет место не ограниченный акт существования конкретного микроорганизма в том конкретном местообитании, а скорее последовательная многоступенчатая интродукция с возможными отдаленными последствиями для экосистемы.
Практическая значимость. Полученные результаты найдут применение при разработке методик оценки риска распространения энтеропатогенных микроорганизмов в природе, а также для разработки методических пособий и рекомендаций по предотвращению неконтролируемого распространения генетически модифицированных микроорганизмов в природе. Результаты исследований следует направить в органы санэпидемнадзора для использования при разработке мер и правил санитарно-эпидемиологического контроля пищевой продукции и, в первую очередь, для разработки мер и правил выращивания, хранения и переработки овощной продукции.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференциях и симпозиумах: «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, 2005; «Автотрофные микроорганизмы», Москва, 2005; «Микроорганизмы и биосфера», Москва, 2007.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ: 4 экспериментальные статьи, 3 тезисов конференций, 2 статьи приняты в печать.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, списка литературы, который содержит 222 наименований работ. Материалы диссертации изложены на 141 страницах текста и включают 19 рисунков и 4 таблицы.
Место проведения работы, сотрудничество и благодарности. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В . Ломоносова. Исследования поддержаны NWO - RFBR (Dutch - Russia) collaborative grants (Dossier numbers 047.014.001 and 047.0147.011) for A.H.C. van Bruggen and A.M. Semenov Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю Семенову А.М ., д.б.н, проф. Нетрусову А.И ., д.б.н . Захарчуку Л.М ., к.б.н . Пискунковой Н.Ф ., а также всем сотрудникам и аспирантам кафедры микробиологии биофака МГУ Особая благодарность и признательность к.б.н., доц. Семёновой Е.В.
